馬嘉藝,黃浩倫,劉孟春,熊羊城,張曉娟,柴麗娟,陸震鳴*,許正宏

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心, 江蘇 無(wú)錫,214122)3(貴州省仁懷市茅家村醬醋有限公司,貴州 遵義,564500)

我國(guó)有著悠久的釀醋歷史。按照醋酸發(fā)酵方式的不同,可以將食醋分為固態(tài)發(fā)酵食醋、液態(tài)發(fā)酵食醋和固液復(fù)合發(fā)酵食醋[1]。我國(guó)的傳統(tǒng)食醋是以各種糧食谷物為主要原料,以麩皮、糠殼等為輔料,通過(guò)固態(tài)發(fā)酵工藝釀造而成,如山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩醋等[2]。不同原料、不同發(fā)酵工藝都會(huì)對(duì)食醋的風(fēng)味產(chǎn)生影響,風(fēng)味是影響食醋感官質(zhì)量的重要因素。非揮發(fā)性和揮發(fā)性化合物是固態(tài)發(fā)酵食醋中兩大類主要的風(fēng)味物質(zhì),非揮發(fā)性化合物主要包含有機(jī)酸、氨基酸和糖類等,揮發(fā)性化合物包含酸、醇、酯、酮、醛類等,是食醋香味和滋味的主要來(lái)源[3]。

醋酸發(fā)酵是食醋釀造中的重要環(huán)節(jié),是食醋風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段。典型的固態(tài)發(fā)酵工藝釀造的食醋,通常會(huì)接入部分發(fā)酵成熟的醋醅,或經(jīng)自然接種,作為醋酸發(fā)酵階段的起始,多種微生物在發(fā)酵過(guò)程中富集和演替,醋酸菌將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸,同時(shí)乳酸菌、芽孢桿菌等多種微生物也能夠發(fā)酵形成種類豐富的風(fēng)味物質(zhì)[4-5]。

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵食醋的釀造多以大曲、藥曲等作為糖化發(fā)酵劑[6],其中,大曲的主要功能為:投糧、糖化、發(fā)酵和增香。按制曲的最高品溫,可以將大曲分成低溫、中溫和高溫大曲3類。高溫大曲的制曲最高品溫達(dá)60 ℃以上,在食醋釀造中的應(yīng)用研究較少,通常用于生產(chǎn)醬香型白酒[7]。醬香型白酒是中國(guó)三大傳統(tǒng)白酒之一,具有濃郁持久的香氣,其風(fēng)格源于獨(dú)特的釀造工藝和發(fā)酵特點(diǎn)[8],高溫大曲為白酒的釀造提供了豐富的微生物、獨(dú)特的醬香成分和前體物質(zhì),在賦予醬香型白酒典型特征香氣和滋味方面起著關(guān)鍵作用[9]。同時(shí),由于在發(fā)酵倉(cāng)內(nèi)所處位置不同,溫度、水分、氧氣濃度等存在差異,高溫大曲又可分為3種不同類型:白曲、黃曲和黑曲,它們顏色不同,風(fēng)味也各不相同[10-11]。

在醋酸發(fā)酵階段添加不同類型的高溫大曲進(jìn)行食醋的釀造,將高溫大曲中含有的香氣成分及前體物質(zhì)帶入到成品醋中,發(fā)揮高溫大曲的增香作用,可以豐富食醋的風(fēng)味;此外,高溫大曲可能給醋酸發(fā)酵過(guò)程提供少量的微生物和酶類,對(duì)提升食醋的風(fēng)味品質(zhì)也具有積極作用。本研究嘗試將白曲、黃曲、黑曲3種不同類型的高溫大曲拌入醋醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵,制備固態(tài)發(fā)酵食醋,以期達(dá)到改善食醋風(fēng)味品質(zhì)的目的,為食醋產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和風(fēng)味品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白曲、黃曲、黑曲3種高溫大曲樣品,由貴州仁懷某酒廠提供;麩皮、稻殼、及種醅,由江蘇鎮(zhèn)江某醋廠提供;糯米,產(chǎn)自遼寧沈陽(yáng);釀酒酵母,湖北安琪酵母有限公司。

NaCl、NaOH、ZnSO4、K4[Fe(CN)6](分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;2-辛醇(色譜純),美國(guó)Sigma公司;甲醇、乙酸、乳酸、草酸、酒石酸、丙酮酸、檸檬酸、焦谷氨酸、琥珀酸(色譜純),上海阿拉丁生化科技股份公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;GC 7890B-MSD 5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stableflex (gray) 固相微萃取頭,美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 食醋制備工藝與樣品采集

以糯米為原料,經(jīng)浸泡、蒸煮、糖化和冷卻后補(bǔ)水至料液比為1∶4(g∶mL),加入釀酒酵母(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5‰)進(jìn)行酒精發(fā)酵7 d,得到米酒酒醪。將米酒酒醪分別添加白曲WQ、黃曲YQ和黑曲BQ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%),拌入麩皮和稻殼、接入種醅,進(jìn)行醋酸發(fā)酵;同時(shí),設(shè)置不添加高溫大曲的對(duì)照組。醋酸發(fā)酵持續(xù)6 d,每天從醋缸的上、中、下層3個(gè)位置分別取樣,等量混勻,得到醋醅樣品,凍存于-20 ℃冰箱備用,用于后續(xù)分析。不添加高溫大曲的對(duì)照組醋醅設(shè)置編號(hào)為CC,添加白曲的醋醅為CW,添加黃曲的醋醅為CY以及添加黑曲的醋醅為CB。

當(dāng)醋醅酸度不再上升即醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí),封醅7 d進(jìn)行后熟,封醅結(jié)束后將醋醅混勻進(jìn)行淋醋、過(guò)濾和煎醋,再混勻取樣,分別得到對(duì)照組成品醋樣品CCV、添加白曲的成品醋樣品CWV、添加黃曲的成品醋樣品CYV和添加黑曲的成品醋樣品CBV。

1.3.2 總酸含量的測(cè)定

醋醅和成品醋樣品依據(jù)GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》的酸堿指示劑滴定法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 有機(jī)酸含量的測(cè)定

醋醅和成品醋樣品依據(jù)GB/T 18623—2011《地理標(biāo)志產(chǎn)品 鎮(zhèn)江香醋(含第1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)修改單)》的高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 揮發(fā)性化合物含量的測(cè)定

高溫大曲樣品依據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法,醋醅和成品醋樣品依據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法。

將測(cè)得的質(zhì)譜圖與NIST譜庫(kù)比對(duì)進(jìn)行定性分析,采用內(nèi)標(biāo)峰面積歸一化法計(jì)算各種成分的相對(duì)含量。

1.3.5 成品醋的感官評(píng)價(jià)

參考GB/T 18623—2011《地理標(biāo)志產(chǎn)品 鎮(zhèn)江香醋(含第1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)修改單)》,由10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員組成感官評(píng)價(jià)小組,按照表1的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(100分制)對(duì)所得的4種成品醋樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià),以平均得分為最終結(jié)果。

表1 成品醋的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of vinegar

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),使用SPSS 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)并用GraphPad Prism 8.0.2作圖。采用SIMCA 14.1對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares-discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)及相關(guān)圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫大曲對(duì)食醋總酸含量的影響

2.1.1 醋酸發(fā)酵過(guò)程的總酸含量變化

如圖1所示,醋酸發(fā)酵起始時(shí)醋醅的總酸含量(以乙酸計(jì))為0.6 g/100 g左右,隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行,醋醅的總酸含量逐漸增多,最終達(dá)3.8 g/100 g左右。醋酸發(fā)酵第2天時(shí),添加黑曲的醋醅總酸含量明顯升高,且顯著高于其他醋醅(P<0.05)。醋酸發(fā)酵至5～6 d時(shí),由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機(jī)酸的積累,醋酸菌等產(chǎn)酸菌代謝緩慢,醋醅的總酸含量趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束時(shí),實(shí)驗(yàn)組醋醅的總酸含量均高于對(duì)照組醋醅,這是由于高溫大曲具有投糧作用,其中含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠作為底物被微生物分解利用從而產(chǎn)酸[14]。

圖1 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.1 Changes of total acidity in acetic acid fermentation

2.1.2 成品醋的總酸含量

如表2所示,4種成品醋的總酸含量在6.33～6.55 g/100 mL(以乙酸計(jì))。添加高溫大曲后成品醋的總酸含量均得到提高,且添加白曲的成品醋CWV總酸含量最高,表明醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲有利于提高食醋的總酸含量,并且與黃曲和黑曲相比,白曲中含有更多未被利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),白曲對(duì)食醋總酸含量的提升效果更好。

表2 成品醋的總酸含量 單位:g/100 mL

2.2 高溫大曲對(duì)食醋有機(jī)酸含量的影響

2.2.1 醋酸發(fā)酵過(guò)程的有機(jī)酸含量變化

在醋酸發(fā)酵過(guò)程中,醋醅的總有機(jī)酸含量逐漸增多。如圖2所示,醋醅的主體有機(jī)酸均為乙酸。乙酸具有刺激性強(qiáng)、回味短的特點(diǎn),乳酸是食醋中重要的不揮發(fā)酸,主要是在厭氧條件下由乳酸菌轉(zhuǎn)化糖分而生成,具有酸感柔和的特點(diǎn)[15]。醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí),拌入高溫大曲的3組醋醅的乳酸含量均高于對(duì)照組醋醅,且添加白曲的醋醅乳酸含量顯著高于對(duì)照組醋醅(P<0.05),說(shuō)明在醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲有利于乳酸的積累,且添加白曲的作用優(yōu)于黃曲和黑曲。

圖2 醋酸發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化Fig.2 Changes of organic acids contents in acetic acid fermentation

2.2.2 成品醋的有機(jī)酸含量

有機(jī)酸作為食醋風(fēng)味物質(zhì)的主要成分,對(duì)食醋整體感官有著重要的影響。單純的乙酸具有刺激性氣味,乳酸、琥珀酸、檸檬酸等不揮發(fā)酸可調(diào)和食醋的酸味,減少醋酸對(duì)味覺(jué)的刺激,改善食醋的酸味質(zhì)量[16]。如表3所示,4種成品醋的有機(jī)酸組成均以乙酸為主,添加高溫大曲的3種成品醋的總有機(jī)酸含量增加,主要體現(xiàn)為乙酸和乳酸含量均高于對(duì)照組成品醋CCV,成品醋CWV中乙酸和乳酸含量顯著高于對(duì)照組成品醋CCV,與醋醅的有機(jī)酸含量變化規(guī)律相符,說(shuō)明在醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲有利于成品醋中乙酸和乳酸的積累,且添加白曲的作用更優(yōu)。此外,成品醋CWV的檸檬酸含量也有少量提高,但在成品醋CYV和CBV中略有降低,其余種類的有機(jī)酸含量無(wú)顯著變化。

表3 成品醋的有機(jī)酸含量 單位:g/L

2.3 高溫大曲對(duì)食醋揮發(fā)性化合物的影響

2.3.1 高溫大曲的揮發(fā)性化合物組成

如圖3所示,通過(guò)頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析,在白曲、黃曲、黑曲3種高溫大曲中共檢出76種揮發(fā)性化合物,白曲、黃曲和黑曲分別檢出63、67、67種揮發(fā)性化合物。醇類化合物是高溫大曲樣品中占比最高的揮發(fā)性化合物,其次是醛類和酸類化合物。不同樣品中各類揮發(fā)性化合物的占比不同,白曲的醇類含量相對(duì)最高,黃曲具有相對(duì)較多的醛類和酯類化合物,黑曲的吡嗪類化合物含量相對(duì)最高。

a-揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù);b-揮發(fā)性化合物占比

采用PLS-DA模型對(duì)不同類型的高溫大曲的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析,圖4中3種高溫大曲樣品能夠進(jìn)行較好的區(qū)分,說(shuō)明3種不同類型的高溫大曲之間的揮發(fā)性化合物具有明顯差異。

圖4 高溫大曲揮發(fā)性化合物的PLS-DA得分圖Fig.4 PLS-DA score plot of volatile compounds of high-temperature Daqu

2.3.2 成品醋的揮發(fā)性化合物組成及差異分析

采用HS-SPME-GC-MS測(cè)定成品醋樣品的揮發(fā)性化合物,結(jié)果如圖5所示,4種成品醋共鑒別出79種揮發(fā)性化合物,成品醋CWV、CYV和CBV的化合物個(gè)數(shù)均多于對(duì)照組成品醋CCV,說(shuō)明在醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲能豐富食醋的揮發(fā)性風(fēng)味。酸類化合物是成品醋樣品中占比最高的揮發(fā)性化合物,其次是酯類和醇類,醛類、酚類、酮類等占比較低。不同成品醋樣品中各類揮發(fā)性化合物的個(gè)數(shù)和占比存在一定差異,對(duì)照組成品醋CCV的酸類化合物占比最高,達(dá)63.27%,添加黑曲的成品醋CBV的酸類化合物占比最低,但醇類和酯類化合物占比最高。

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的分析方法,通過(guò)預(yù)設(shè)分類,強(qiáng)化組間差異[17]。采用OPLS-DA分別對(duì)對(duì)照組成品醋CCV與實(shí)驗(yàn)組成品醋CWV、CYV和CBV的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析。模型參數(shù)如表4所示,3組模型的R2X、R2Y和Q2均高于0.5,表明模型穩(wěn)定,擬合度和預(yù)測(cè)能力較高,能較好地解釋和預(yù)測(cè)成品醋整體揮發(fā)性化合物之間的差異。如圖6所示,對(duì)照組成品醋CCV與實(shí)驗(yàn)組成品醋CWV、CYV和CBV均分布于坐標(biāo)軸不同區(qū)域,得到較好分離,說(shuō)明分別添加3種不同類型高溫大曲的成品醋與對(duì)照組成品醋的揮發(fā)性化合物存在顯著差異。根據(jù)OPLS-DA篩選出VIP>1.0且P<0.05的揮發(fā)性化合物共38種,包括醇類化合物6種、醛類化合物1種,酸類化合物6種、酯類化合物16種、酮類化合物4種、酚類化合物2種、呋喃類化合物1種及其他類化合物2種,這些揮發(fā)性化合物是區(qū)分成品醋樣品的重要差異化合物,含量如表5所示。

表4 成品醋的OPLS-DA模型參數(shù)Table 4 OPLS-DA model parameters of vinegar

a-CCV-CWV;b-CCV-CYV;c-CCV-CBV

由表5可知,在成品醋的重要差異揮發(fā)性化合物中,對(duì)照組成品醋中未檢出而添加高溫大曲的成品醋中檢測(cè)到的化合物有10種,包括:乙醇、己醇、2-庚醇、癸醛、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、1-辛烯-3-酮和萘。乙醇的存在可能是由于醋醅含有的乙醇未被完全利用而有部分殘留或是添加的高溫大曲中含有耐酸的釀酒酵母,能夠在酸性條件下生長(zhǎng)繁殖從而積累了少量乙醇;己醇是3種高溫大曲本身含有的化合物,具有花香果,在成品醋CWV中未檢出,但在成品醋CYV和CBV中含量顯著提升,說(shuō)明添加黃曲和黑曲有利于成品醋中己醇的積累;2-庚醇只在成品醋CBV中檢出且含量較低,具有花果香。成品醋CYV和CBV中含有少量具有橙皮味的癸醛[18]。乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯,具有菠蘿香、水果香、花香和香蕉香等風(fēng)味[19-20]。添加黃曲和黑曲的成品醋中含有少量具有蘑菇味的1-辛烯-3-酮,是高溫大曲中本身含有的物質(zhì)。此外,萘也是高溫大曲引入成品醋中的化合物,3種高溫大曲本身含有少量的萘,經(jīng)過(guò)醋酸發(fā)酵階段后,在添加黃曲和黑曲的成品醋CYV和CBV中積累較多。

表5 成品醋的重要差異揮發(fā)性化合物含量 單位:ng/L

添加高溫大曲的成品醋相較于對(duì)照組成品醋,含量增加的重要差異揮發(fā)性化合物有:異戊醇、4-甲基-5-癸醇、β-乙基苯乙醇、己酸、順-5-十二碳烯酸、辛酸、壬酸、丁二酸二乙酯、γ-己內(nèi)酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-乙酰基-2-丁酮、2-甲氧基-4-基苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚。異戊醇是3種高溫大曲本身含有的化合物,具有果香,略帶酸味[19],在成品醋CWV中含量有所降低,但在成品醋CYV和CBV中含量顯著提高,說(shuō)明添加黃曲和黑曲有利于異戊醇的積累。辛酸是3種高溫大曲本身含有的化合物,具有花果香和油脂臭[20]。丁二酸二乙酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯等能賦予食醋水果香氣和甜香。2-甲氧基-4-甲基苯酚具有辛香、煙熏味,2-甲氧基-4-乙烯基苯酚具有焙烤香、煙熏味[20-21]。

此外,也有部分重要差異化合物在對(duì)照組成品醋中含量更高,而在添加高溫大曲的成品醋中含量較低,包括:異戊酸、2-甲基己酸、乳酸乙酯、乙酸庚酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、植酮、2-正戊基呋喃和十一烷。其中,異戊酸具有酸臭味,乳酸乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯和棕櫚酸乙酯具有水果香、葡萄香、淡奶油香、甜香和奶香等風(fēng)味[19],3-羥基-2-丁酮具有奶油香氣[21]。

總的來(lái)說(shuō),高溫大曲賦予了成品醋更多具有花果香、煙熏味和甜香的重要差異揮發(fā)性化合物,并且添加黃曲和黑曲的成品醋與對(duì)照組成品醋的揮發(fā)性化合物在種類和含量上的差異更為明顯。

2.4 成品醋的感官評(píng)價(jià)結(jié)果

如圖7所示,所有成品醋的色澤和體態(tài)得分均在20分以上,添加白曲、黃曲和黑曲的成品醋的色澤與對(duì)照組成品醋相比依次加深;香味和滋味的得分有明顯差異,添加高溫大曲的成品醋香味更為醇厚、口感更為柔和協(xié)調(diào)。添加黃曲的成品醋CYV的得分最高,而對(duì)照組成品醋CCV的得分最低,表明在醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲能改善成品醋的風(fēng)味品質(zhì),添加黃曲的效果最佳。

圖7 成品醋的感官評(píng)價(jià)得分Fig.7 Sensory evaluation scores of vinegar end product

3 結(jié)論與討論

本研究將白曲、黃曲、黑曲3種不同類型的高溫大曲拌入醋醅中進(jìn)行醋酸發(fā)酵,制備固態(tài)發(fā)酵食醋。結(jié)果表明,在醋酸發(fā)酵階段添加3種不同類型的高溫大曲均能夠提高成品醋的總酸和有機(jī)酸含量,主要表現(xiàn)為乳酸和乙酸含量的提升,提升效果為白曲最佳;同時(shí),HS-SPME-GC-MS顯示3種不同類型高溫大曲的添加均能豐富成品醋的揮發(fā)性風(fēng)味,OPLS-DA篩選出38種具有重要差異的揮發(fā)性化合物,高溫大曲賦予了成品醋更多具有花果香、煙熏味和甜香的重要差異揮發(fā)性化合物,并且添加黃曲和黑曲的成品醋的揮發(fā)性化合物與對(duì)照組成品醋的差異更為明顯;此外,感官評(píng)價(jià)表明醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲能改善成品醋的風(fēng)味品質(zhì),并且添加黃曲的效果最佳。本研究證實(shí)了在醋酸發(fā)酵階段添加高溫大曲能改善固態(tài)發(fā)酵食醋的風(fēng)味品質(zhì),為食醋產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和風(fēng)味品質(zhì)改良提供參考。由于高溫大曲富含多種微生物和酶類,進(jìn)一步的研究可以基于高通量測(cè)序技術(shù),結(jié)合代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)等,探究添加不同類型高溫大曲的醋醅中微生物和相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況,精確闡明高溫大曲中的微生物和酶類對(duì)食醋風(fēng)味品質(zhì)的影響。