李志偉,馬 勇,陳 洋,盤(pán)賽昆
(江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇連云港 222000)
果膠廣泛存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉中,是細(xì)胞壁的一種組成成分,基本組成的部分為甲酯化半乳糖醛酸[1]。果膠按其甲酯化的大小可以分為高酯果膠(HMP) 和低酯果膠(LMP) 兩類(lèi)。HMP 一般是是甲酯化度高于50%,即甲氧基含量高于7%的果膠;LMP 是指甲酯化度介于25%~50%,即甲氧基含量低于7%的果膠[2]。果膠的用途很廣,70%的果膠用于食品添加劑行列,兩類(lèi)果膠的區(qū)別在于膠凝機(jī)理的不同[3]。HMP 受限于pH 值和共熔物的制約,只能用于高糖食品的生產(chǎn)。LMP 形成凝膠的條件不受限于pH 值和共熔物,只需要足夠的高價(jià)金屬離子就可以形成膠體。LMP 能夠出色地滿(mǎn)足人們對(duì)低糖、低鹽、低熱量食品的要求[4]。最近幾年來(lái),世界上糖尿病患者呈上升趨勢(shì),減肥成為一種時(shí)尚,商家針對(duì)這一特性開(kāi)發(fā)出了一系列低糖保健食品,在選擇用膠時(shí),LMP 有著巨大的優(yōu)勢(shì)。
山楂作為我國(guó)特有原產(chǎn)果樹(shù),內(nèi)含豐富果膠,在現(xiàn)有水果中果膠含量位居首位,是制備低酯果膠的優(yōu)秀原材料[5]。利用山楂中固有的果膠酯酶并采用超聲輔助提取低酯果膠,對(duì)提取的低酯果膠進(jìn)行基本成分測(cè)定。
山楂,市售;乙醇,無(wú)錫源之泉化工產(chǎn)品有限公司提供;Na2CO3,安琪酵母股份有限公司提供。
恒溫干燥箱,吳江富盛烘箱設(shè)備有限公司產(chǎn)品;超微粉碎機(jī),濰坊新亞能粉體設(shè)備有限公司產(chǎn)品;電子天平,南北儀器有限公司產(chǎn)品;低速離心機(jī),湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;真空干燥箱,吳江市埃爾特電熱設(shè)備有限公司產(chǎn)品;超聲細(xì)胞破碎儀,南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。
(1) 原料處理。山楂去核去蒂后,放入恒溫干燥箱中去除水分,將山楂置于超微粉碎機(jī)中粉碎。
(2) 脫酯。將原料中加入適量的水得到料液,再加入Na2CO3,利用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行脫酯工作。
(3) 熱水浸提。將料液放入水浴鍋中加熱攪拌3 h,用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min,收集上清液。
(4) 濃縮。將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至30%,去除上清液中的水分。
(5) 乙醇沉淀:將濃縮后的上清液中加入1.5 倍體積的95%乙醇溶液,沉淀出果膠。
(6) 成品果膠。將沉淀物放入真空干燥箱中烘干、粉碎后,即得果膠成品。
分別考查不同料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30(g∶mL) 對(duì)山楂果膠提取率的影響;不同激活劑質(zhì)量6%,10%,14%,18%,22%對(duì)山楂果膠提取率的影響;不同超聲時(shí)間30,60,90,120,150 min 對(duì)山楂果膠提取率的影響;不同超聲功率215,250,285,320,355 W 對(duì)山楂果膠提取率的影響。
以單因素試驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo),低酯山楂果膠提取率作為響應(yīng)值,將料液比、激活劑質(zhì)量、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度作為影響因子,進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,利用Design Expert.12 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析,優(yōu)化超聲波輔助內(nèi)源酶提取低酯果膠生產(chǎn)工藝[6]。
果膠得率按如下公式計(jì)算:
用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 果膠粉末,將其完全溶解在100 mL 蒸餾水中,在果膠溶液中加入2~3 滴酚酞溶液,用濃度為0.1 mmol 的NaOH 滴定果膠溶液,使溶液滴定至紅色0.5 min 內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。再加入濃度為0.5 mmoL 的NaOH 溶液5 mL,于25 ℃環(huán)境下皂化2.5 h。用濃度為0.1 mol/L 的H2SO4溶液滴定至果膠溶液紅色消褪為止[7]。計(jì)算公式如下:
式中:V1——皂化時(shí)加入的氫氧化鈉體積,mL;
C1——皂化時(shí)加入的氫氧化鈉濃度,mol/L;
V2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸體積,mL;
C2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸濃度,mol/L;
m——試樣質(zhì)量,g;0.031——甲氧基毫摩爾數(shù)。
配制含有15%蔗糖、0.1%黃原膠、0.9%卡拉膠的混合液,然后加入提取的低甲氧基山楂果膠,80 ℃加熱攪拌至膠完全溶解,使果膠粉含量為0.1%,溶液冷卻后,再加入檸檬酸,攪拌均勻,使檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。將調(diào)配好的料液85℃水浴保持15 min殺菌,密封,4 ℃下冷藏靜置18 h 即成凝膠。同時(shí),制備未添加果膠的凝膠和加入等量商品柑橘果膠的凝膠樣品,進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。
采用苯酚- 硫酸法測(cè)定山楂果膠的總糖含量[8];采用福林酚比色法測(cè)定山楂果膠的多酚含量[9];采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定山楂果膠的蛋白質(zhì)含量[10];采用皂化滴定度法測(cè)定果膠的酯化度[11];采用化學(xué)滴定度法測(cè)定果膠的酰胺化度[12];參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016直接干燥法測(cè)定果膠的水分含量。
用pH-stat 法進(jìn)行檢測(cè)。用天平稱(chēng)取5 g 山楂粉放入100 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaCl 溶液中,于2 ℃環(huán)境溫度下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min,取上清液作為粗酶液。稱(chēng)取0.5 g 山楂果膠溶于100 g 蒸餾水中形成山楂果膠溶液,將溶液置于45 ℃環(huán)境溫度下恒溫并調(diào)pH 值至7.5,加入2 mL 粗酶液后開(kāi)始計(jì)時(shí),用濃度為0.01 mol/L的NaOH 溶液將pH 值穩(wěn)定在7.5[14]。
所有試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示(n=3),采用Origin pro 18.0,Excel 和Design Expert.12 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。
果膠酯酶作用時(shí)間與消耗NaOH 的關(guān)系見(jiàn)表1,PE 的作用曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。
圖1 PE 的作用曲線(xiàn)
表1 果膠酯酶作用時(shí)間與消耗NaOH 的關(guān)系
根據(jù)回歸方程Y=14.766X-17.78 可知,斜率為14.766,由此可以得到山楂中的果膠酯酶活力為14.766 μmol/s,根據(jù)酶的活力發(fā)現(xiàn)可利用果膠酯酶對(duì)山楂中的果膠進(jìn)行脫酯,制備低酯山楂果膠。
2.2.1 果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響
果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖2。
圖2 果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響
由圖2 可知,激活劑添加量為6%~10%時(shí),果膠提取率迅速上升,提取率最高達(dá)到29.72%。激活劑濃度較低時(shí),隨著添加量的增加,使得果膠酯酶的活性增強(qiáng),脫酯反應(yīng)速率加快,甲氧基含量迅速降低;但隨著激活劑添加量達(dá)到一定程度,山楂中的果膠酯酶活性被消耗殆盡,過(guò)多的激活劑使得斷開(kāi)的甲酯鍵和糖苷鍵重新鏈接,使得酯化度上升[15]。綜合考慮,激活劑添加量選擇10%為佳。
2.2.2 料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響
料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖3。
圖3 料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響
由圖3 可知,料液比為1∶10 ~1∶25 時(shí),低酯果膠的提取率隨著料液比的增大而增加,在1∶25時(shí)果膠提取率達(dá)到24.63%。當(dāng)料液比為1∶25 ~1∶30 時(shí),果膠提取率隨著料液比的增大開(kāi)始降低。當(dāng)料液比為1∶10 ~1∶25 時(shí),隨著水的占比增加,使得原料內(nèi)外壓強(qiáng)產(chǎn)生差距,能夠讓果膠物質(zhì)從原料中較完全析出,提高果膠的提取率,但隨著水的比例過(guò)于增加,原料內(nèi)外的壓強(qiáng)差距過(guò)大,原料中的果膠物質(zhì)無(wú)法從原料中析出,果膠提取率開(kāi)始下降[16]。所以,料液比以1∶25 為佳。
2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響
超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖4。
圖4 超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響
由圖4 可知,超聲時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)使原料具有不同的果膠提取率。當(dāng)超聲時(shí)間為120 min 時(shí)原料的低酯果膠提取率達(dá)到峰值28.5%,超聲波的產(chǎn)能和剪切力的作用使得熱量被聚集起來(lái),給了果膠物質(zhì)良好的析出環(huán)境,但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)使得溫度過(guò)高,開(kāi)始破壞果膠的物質(zhì)結(jié)構(gòu),從而使果膠提取率降低[17]。因此,超聲時(shí)間選擇120 min 較好。
2.2.4 超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響
超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖5。
圖5 超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響
由圖5 可知,超聲功率的不同會(huì)導(dǎo)致不同的果膠提取率。當(dāng)超聲功率為285 W 時(shí),低酯果膠的提取率達(dá)到了37.3%,隨著超聲功率的增強(qiáng),使得果膠中的部分水溶性果膠溶解,同時(shí)因?yàn)楣z酯酶的影響,過(guò)強(qiáng)的超聲功率會(huì)導(dǎo)致果膠中的結(jié)構(gòu)斷裂,降低果膠提取率。因此,超聲功率選擇285 W 為佳。
2.3.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)
響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2,回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
由表3 可知,該回歸模型顯著(p<0.05),所有二次項(xiàng)的p均小于0.05,表明所選因素對(duì)果膠提取率均有顯著影響。模型失擬項(xiàng)不存在顯著面(p>0.05),表明實(shí)際值與預(yù)估值之間相差較遠(yuǎn),表明方程擬合性好,試驗(yàn)誤差小。依據(jù)各因素顯著水平與F值大小進(jìn)行分析,各因素對(duì)果膠提取率影響從高到低為超聲時(shí)間(C) >激活劑添加量(A) >料液比(B) >超聲功率(D),并且所有試驗(yàn)果膠甲氧基含量均小于7%。
以激活劑添加量(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D) 為自變量,山楂低酯果膠提取率為因變量,對(duì)各組合處理得到山楂粗果膠提取率進(jìn)行二次回歸分析[18],建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:
2.3.2 響應(yīng)面分析
各因素響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖6。
圖6 各因素響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)
響應(yīng)面圖能夠直觀(guān)地反映出各個(gè)單因素對(duì)響應(yīng)值的作用,也能夠看出各個(gè)因素相互之間的影響效果。圖6(a) ~6(d) 的等高線(xiàn)更接近橢圓形說(shuō)明因素B和C的交互作用對(duì)果膠提取率的影響顯著;圖6(e) 和6(f) 的等高線(xiàn)圖更接近圓形,說(shuō)明兩因素間的交互作用不明顯,交互作用分析結(jié)果與方差分析表中的結(jié)果相一致。
2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與模型驗(yàn)證
由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),最優(yōu)加工工藝條件為激活劑添加量12.28%,料液比1∶26(g∶mL),超聲時(shí)間119 min,超聲功率288 W,響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果為26.79%,對(duì)此結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)低酯果膠提取率為(25.84±0.12) % ,理論值與實(shí)際值無(wú)顯著性差異,證明了該試驗(yàn)結(jié)果的可行性。
低酯果膠甲氧基含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 低酯果膠甲氧基含量測(cè)定結(jié)果
由圖7 可知,對(duì)單因素試驗(yàn)提取的果膠進(jìn)行甲氧基含量的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示提取出的果膠甲氧基含量均在7%以下,屬于低甲氧基果膠,即低酯果膠。
低酯山楂果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)特性見(jiàn)表4。
表4 低酯山楂果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)特性
由表4 可知,與未添加果膠的凝膠樣品進(jìn)行對(duì)比,添加山楂果膠與低酯山楂果膠后,凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性均有明顯提高,其中添加低酯山楂果膠樣品的硬度、彈性和黏聚性略大于添加山楂果膠的樣品。表明提取的低酯山楂果膠與市售的山楂果膠無(wú)顯著性差異,能夠達(dá)到商品果膠的使用效果。
山楂低酯果膠理化指標(biāo)見(jiàn)表5。
表5 山楂低酯果膠理化指標(biāo)
由表5 可知,由最優(yōu)工藝制作出的山楂果膠均符合干燥減量、二氧化硫、酸不溶灰分、總半乳糖醛酸、酰胺化度和重金屬鉛的含量等均符合GB 25533—2010 的要求。
利用超聲波輔助果膠酯酶進(jìn)行提取低酯山楂果膠的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳方案為激活劑添加量12.28%,料液比1∶26(g∶mL),超聲時(shí)間199 min,超聲功率288 W,果膠提取率為(25.84±0.12) %,并對(duì)果膠的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 25533—2010 的相關(guān)要求。質(zhì)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示,添加低酯山楂果膠能夠有效提升凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性且可達(dá)到商品果膠的使用效果。因此,可利用山楂來(lái)進(jìn)行低酯果膠的制備,擴(kuò)充低酯果膠的原料選擇。