孫孟琦,楊化宇,閆博文*,張娜娜,范大明

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

全蛋液的傳統(tǒng)巴氏殺菌過程主要以傳導(dǎo)加熱為主,為保證管路中心達(dá)到蛋液殺菌溫度,會導(dǎo)致管壁區(qū)域物料的過度加熱并造成熱量冗余。高強(qiáng)度熱處理會使全蛋液中熱敏性蛋白質(zhì)變性,致使全蛋液的功能特性受損、品質(zhì)劣變。此外,管路內(nèi)部溫度梯度方向也加劇了管路結(jié)焦現(xiàn)象的發(fā)生,從而導(dǎo)致管路清洗難度增大和能效降低等問題。在保障微生物安全性的前提下,降低熱敏蛋白質(zhì)在巴氏殺菌處理過程中的熱損傷程度,對全蛋液的加工及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用尤為重要。

微波作為一種新型的物理場加工方式,憑借其體積式靶向加熱原理,能夠?qū)崿F(xiàn)無需傳熱介質(zhì)的選擇性加熱過程,在縮短熱處理時間的同時可以針對性的改善傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的缺陷。微波的冷熱點(diǎn)現(xiàn)象一直是影響其進(jìn)一步應(yīng)用與發(fā)展的障礙。連續(xù)式微波熱處理通過改善內(nèi)部電磁場分布情況,可以有效改善溫度分布均勻性,減少熱失控[1-2]。目前連續(xù)式微波巴氏殺菌技術(shù)的研究多集中在牛奶和果汁上,盡管在一定程度上證明了其商業(yè)可行性,但連續(xù)式微波巴氏殺菌技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還處于起步階段,鮮有適用于流體食品的實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)規(guī)模的連續(xù)式微波處理系統(tǒng);針對不同類型食品的微波巴氏殺菌方法的工藝開發(fā)并不充分;亦缺乏全蛋液的連續(xù)式微波殺菌的研究,對于殺菌效果和熱敏蛋白質(zhì)的影響還需要進(jìn)一步探究[3]。

因此,本研究首先構(gòu)建了全蛋液的連續(xù)式微波巴氏殺菌系統(tǒng),探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動力學(xué)及全蛋液蛋白質(zhì)變化,全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的痛點(diǎn),為工業(yè)生產(chǎn)提供導(dǎo)向性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全蛋液,蘇州歐福蛋業(yè)股份有限公司;生雞蛋,北京正大蛋業(yè)有限公司;大腸桿菌CGMCC1.8745、金黃色葡萄球菌CGMCC1.1861、沙門氏菌CICC21482,保藏于江南大學(xué)生物技術(shù)中心。

1.1.2 試劑

去離子水,無錫華晶飄之霖有限公司;Tris、甘氨酸、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DTNB,美國西格瑪奧德里奇有限公司;BCA蛋白濃度增強(qiáng)型測定試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司;LB、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar,VRBA)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(xylose lysine desoxycholate,XLD)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3600紫外分光光度計(jì),日本Shimazu公司;F-7000熒光光譜儀,美國HORIBA公司;FX36型高速乳化均質(zhì)機(jī),德國弗魯克公司;XO-SM400微波反應(yīng)體系,南京先歐儀器制造有限公司;WT600-2J蠕動泵,蘇州諾方科精密設(shè)備有限公司;FOT-L-SD光纖溫度傳感器,加拿大FISO公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,三洋電子有限公司;BSC-1000 A2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZQZY-HC型振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋液原料制備

活化后菌液離心5 min(6 000×g,4 ℃),菌泥重新懸浮于全蛋液中,使樣品中的菌體濃度達(dá)到107～108CFU/mL,用于殺菌實(shí)驗(yàn)。用低速攪拌器對生雞蛋進(jìn)行均質(zhì)處理,過80目篩網(wǎng)除雜,得到新鮮均一的全蛋液用于品質(zhì)特性實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 微波巴氏殺菌系統(tǒng)構(gòu)建

如圖1所示,體系主要包括:原料桶、磁力攪拌器、蠕動泵、微波腔體(0.5 m×0.5 m×0.5 m)、4個矩形波導(dǎo)及磁控管、硅膠管、溫度傳感器、水浴鍋、酒精燈等。管路內(nèi)徑為0.010 m,外徑為0.015 m,螺旋管匝數(shù)為3.5,直徑為0.130 m,螺距為0.030 m。微波腔內(nèi)管路的有效長度為2.56 m。為了建立微波加熱的穩(wěn)態(tài)流動條件,全蛋液在體系中預(yù)循環(huán)一段時間后開啟微波,通過調(diào)節(jié)流速和微波功率使蛋液達(dá)到所需殺菌溫度(56、60、64 ℃),腔體出口處設(shè)置取樣點(diǎn),當(dāng)?shù)耙哼_(dá)到所需溫度時立即取樣,迅速置于水浴鍋中密封保溫處理(1、2、3 min),隨后置于冰水浴中冷卻。試驗(yàn)中所使用的器材均經(jīng)過滅菌處理,取樣處放置酒精燈保證無菌環(huán)境,所有接種、涂布等操作步驟均在生物安全柜中進(jìn)行。6組微波巴氏殺菌條件LPT 56 ℃、LPT 60 ℃、LPT 64 ℃、HPT 56 ℃、HPT 60 ℃和HPT 64 ℃對應(yīng)流速分別為0.146、0.131、0.119、0.292、0.263、0.239 m/s。低功率微波巴氏殺菌(low power treatment,LPT)和高功率微波巴氏殺菌(high power treatment,HPT)分別指實(shí)驗(yàn)所用微波功率密度8 W/mL和16 W/mL,56、60、64 ℃指殺菌溫度,例如LPT 56 ℃指的是在8 W/mL的微波功率密度下使蛋液樣品達(dá)到56 ℃的處理?xiàng)l件,RAW指未處理全蛋液。

圖1 微波巴氏殺菌系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the microwave pasteurization system

1.3.3 微生物培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

根據(jù)GB 4789.1—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》進(jìn)行微生物的培養(yǎng)與計(jì)數(shù),培養(yǎng)基選擇:大腸桿菌-VRBA;沙門氏菌-XLD;金黃色葡萄球菌-TSB。

1.3.4 殺菌動力學(xué)

殺菌動力學(xué)的計(jì)算如公式(1)～公式(4)所示:

Log-Logistic模型[4]:

(1)

Log-linear+Shoulder模型[5]:

(2)

Log-linear+Tail模型[6]:

log10(N)=log10{[10log10(N0)-10log10(Nres)]× e(-kmax×t)+10log10(Nres)}

(3)

用均方根誤差(root mean square error,RMSE)和R2來評價殺菌動力學(xué)模型的預(yù)測優(yōu)度:

(4)

式中:α,曲線上漸近線,lg CFU/mL;ω,曲線下漸近線,lg CFU/mL;σ,最大失活速率,min-1;τ,最大失活速率對應(yīng)殺菌時間的對數(shù)值;kmax,曲線對數(shù)線性部分的失活率,min-1;Sl,肩長,min;log10(N0),初始菌群預(yù)測對數(shù),CFU/mL;log10(Nres),剩余菌群預(yù)測對數(shù),CFU/mL;n,觀測值的數(shù)量,個。

1.3.5 溶解度測定

樣品離心15 min(10 000×g,4 ℃),取上清液和原樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定,溶解度的計(jì)算如公式(5)所示[7]:

(5)

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜測定

首先用PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)將樣品稀釋到0.5 mg/mL。激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為280、300～500 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min。PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)作為空白對照[8]。

1.3.7 表面疏水性測定

用ANS熒光探針法對表面疏水性進(jìn)行測定,用外源熒光強(qiáng)度大小來表示疏水性大小。取40 μL的8.0 mmol/L ANS溶液加入4 mL的稀釋后的樣品溶液中。室溫下避光孵育20 min后進(jìn)行熒光掃描。激發(fā)及發(fā)射波長分別為390、400 nm,狹縫寬5 nm,掃描速度1 200 nm/min[9]。

1.3.8 游離巰基含量測定

將樣品與Tris-甘氨酸緩沖液以體積比1∶3混勻,加入40 μL Ellman試劑混勻,25 ℃水浴保溫30 min后測定吸光度。Ellman試劑用作空白對照[10],游離巰基含量測定的計(jì)算如公式(6)所示:

(6)

式中:A412為412 nm處吸光度;ρ為樣品質(zhì)量濃度,mg/mL;D為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄。使用Origin 2018C進(jìn)行繪圖,SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Duncan’s multiple range test分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波巴氏殺菌動力學(xué)分析

螺旋連續(xù)式微波巴氏殺菌系統(tǒng)可以避免因電磁場分布不均勻和微波穿透深度短引起的加熱不均勻現(xiàn)象,有效改善傳質(zhì)傳熱速率和溫度分布均勻性,實(shí)現(xiàn)對全蛋液的均勻高效加熱[11-12]。微波巴氏殺菌升溫迅速,可在50 s內(nèi)到達(dá)穩(wěn)態(tài)(圖2)。不同微波巴氏殺菌條件下大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的存活率分別降低3.84～5.85 log10、4.11～6.19 log10和3.11～5.54 log10。金黃色葡萄球菌對巴氏殺菌處理的抗性略高于大腸桿菌和沙門氏菌,可能與革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌在結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁分子組織上的差異有關(guān),革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上較厚的肽聚糖結(jié)構(gòu)可以抑制失活[13]。

圖2 微波巴氏殺菌處理升溫曲線Fig.2 Temperature-rising curve of microwave pasteurization treatments

傳統(tǒng)一級線性動力學(xué)模型只與時間相關(guān),認(rèn)為存活曲線呈線性趨勢,然而非等溫微波巴氏殺菌過程中,存活曲線呈現(xiàn)明顯的非線性趨勢(圖3),這會導(dǎo)致使用線性模型擬合可能發(fā)生致死率過高或過低程度的預(yù)測,不能準(zhǔn)確描述微生物的失活行為,因而本文使用3種非線性模型進(jìn)行回歸擬合分析[4-5]。圖4～圖6可以看出,Log-Logistic模型具有最好的擬合精度和穩(wěn)定性(R2:0.998～0.999,RMSE:0.002～0.072),其次是Log-linear+Tail模型(R2:0.982～0.999,RMSE:0.026～0.298),Log-linear+Shoulder模型擬合效果相對較差(R2:0.980～0.999,RMSE:0.041～0.314)。本研究中存活曲線出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象,可能是由于較高耐熱性的微生物細(xì)胞亞群的存在[14-15]。

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

a-大腸桿菌;b-沙門氏菌;c-金黃色葡萄球菌

2.2 微波巴氏殺菌對全蛋液蛋白質(zhì)的影響

2.2.1 微波巴氏殺菌對蛋白質(zhì)溶解度的影響

如表1所示,相較于未處理樣品,微波巴氏殺菌并未使全蛋液的蛋白質(zhì)溶解度降低。LPT處理下,蛋白質(zhì)溶解度顯著提高(P<0.05),功率密度相同處理溫度不同的組別溶解度無顯著差異(P>0.05),HPT處理下樣品溶解度略低于LPT處理,但與未處理樣品相比溶解度無顯著差異(P>0.05)。

表1 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)溶解度Table 1 Solubility of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.2 微波巴氏殺菌對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)熒光光譜圖的變化有效表征其三級結(jié)構(gòu)的變化。內(nèi)源熒光光譜利用蛋白質(zhì)自身具有的發(fā)色基團(tuán)來檢測熒光強(qiáng)度的變化[16],微波處理后樣品的最大波長藍(lán)移,表明微波處理影響了內(nèi)部微環(huán)境的極性(圖7)。微波處理后全蛋液樣品的熒光強(qiáng)度降低,可能是由于微波促使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部包埋的色氨酸殘基暴露在強(qiáng)極性水溶液中,微環(huán)境極性增加,激發(fā)態(tài)和基態(tài)顯色基團(tuán)的能量受影響,從而造成本征熒光強(qiáng)度降低。

圖7 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜Fig.7 Endogenous fluorescent spectrometry of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.3 微波巴氏殺菌對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

如圖8所示,微波巴氏殺菌處理后全蛋液樣品的外源熒光強(qiáng)度增加,說明微波巴氏殺菌處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子展開,埋藏在分子內(nèi)部的疏水鏈暴露,表面疏水性增加,有利于功能特性的改善[17]。

圖8 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)表面疏水性Fig.8 Surface hydrophobicity of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

2.2.4 微波巴氏殺菌對巰基含量的影響

巰基在蛋白質(zhì)的凝膠、泡沫等特定結(jié)構(gòu)的形成中起重要作用[7]。與未處理樣品相比(表2),微波巴氏殺菌處理后的全蛋液樣品巰基含量呈上升趨勢,隨著微波功率和處理溫度的增加,巰基含量整體呈增加趨勢(P<0.05)。可能是由于微波巴氏殺菌處理使蛋白質(zhì)去折疊或離子化程度有所增加,游離巰基暴露,巰基含量增加[18-19]。

表2 微波巴氏殺菌全蛋液蛋白質(zhì)巰基含量Table 2 Sulfhydryl contents of proteins in liquid whole egg under microwave pasteurization treatments

3 結(jié)論與討論

本文研究了全蛋液的微波巴氏殺菌,探究了不同微波功率-溫度組合下的微生物致死效果、微波殺菌動力學(xué)及全蛋液蛋白質(zhì)變化,具體內(nèi)容如下:

a)微波巴氏殺菌升溫時間短,可以有效縮短全蛋液在巴氏殺菌過程中的非等溫加熱滯后期。通過對微波功率密度及殺菌溫度的調(diào)控,微波巴氏殺菌可以使大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌存活率降低5 log10以上,殺菌效果顯著。

b)非線性模型是擬合非等溫微波巴氏殺菌過程的有效模型(R2≥0.980,RMSE≤0.314)。Log-Logistic模型擬合精度和穩(wěn)定性最好,Log-linear+Tail模型擬合效果好且變量少。模型擬合結(jié)果與存活曲線趨勢呈現(xiàn)良好的一致性,進(jìn)一步證明非線性模型的準(zhǔn)確性和有效性。

c)微波誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子適度展開,更多帶電和極性基團(tuán)暴露,溶解度有所提高,游離巰基含量增加,有利于全蛋液品質(zhì)特性的改善。

微波巴氏殺菌針對性地彌補(bǔ)了全蛋液傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的缺陷,通過降低高溫處理時間和熱加工程度,減少全蛋液在熱敏溫度下的停留時間,降低蛋白質(zhì)熱損傷程度,有助于全蛋液品質(zhì)的改善以及在食品加工領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。全蛋液微波巴氏殺菌的研究有助于解決傳統(tǒng)巴氏殺菌方法的痛點(diǎn),為工業(yè)生產(chǎn)提供導(dǎo)向性。連續(xù)式微波加熱模式的開發(fā)以及在全蛋液殺菌領(lǐng)域中的應(yīng)用,對黏稠態(tài)熱敏性流體食品高效微波熱處理技術(shù)的開發(fā)具有重要意義。