陳 賀,鄭 洋,蔣旭燕,吳繼魁,2,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306;2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海 201306;3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

重金屬是環(huán)境中水資源的主要污染物之一,一些重金屬離子會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,特別是Pb2+[1]。研究表明,低濃度水平Pb2+就可對(duì)人體健康造成不可修復(fù)的損傷,對(duì)幼兒及青少年的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成嚴(yán)重?fù)p害,影響兒童智力發(fā)育[2-4]。因此,痕量Pb2+的監(jiān)測(cè)對(duì)環(huán)境保護(hù)、食品安全以及人類(lèi)健康具有重要意義。

Pb2+的傳統(tǒng)檢測(cè)方法如電感耦合等離子質(zhì)譜法(ICP-MS)、原子熒光光譜法(AFS)和原子吸收光譜法(AAS)等[5-7]往往存在儀器笨重和昂貴、預(yù)處理復(fù)雜、分析周期長(zhǎng)以及需要專(zhuān)業(yè)人員操作等缺點(diǎn),難以用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)測(cè)試,因此開(kāi)發(fā)低成本、簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、高選擇性的Pb2+檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

生物傳感器為金屬離子檢測(cè)提供了成本低、簡(jiǎn)單、高效的方法。脫氧核酶(DNAzyme)對(duì)金屬離子具有高選擇性和特異性,常作為生物傳感器的識(shí)別元件,廣泛應(yīng)用于各種靶標(biāo)如DNA、微RNA(microRNA)、蛋白質(zhì)和金屬離子等的檢測(cè)[8-10]。其中,GR-5 DNAzyme是經(jīng)體外篩選出來(lái)的能特異性識(shí)別Pb2+的功能核酸,它不僅具有高催化性、化學(xué)穩(wěn)定性和選擇性,成本也很低[11]。

核酸等溫?cái)U(kuò)增是在恒定溫度下,將具有特定功能及特定序列的蛋白酶及核酸引物等添加到特定反應(yīng)體系中,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增的技術(shù)[12-13]。其中:以輔助因子為蛋白酶或納米粒子的等溫?cái)U(kuò)增方法價(jià)格昂貴,操作復(fù)雜耗時(shí)[14];催化發(fā)夾自組裝(CHA)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種無(wú)酶、高效的信號(hào)擴(kuò)增策略,擴(kuò)增過(guò)程可由單鏈分析物引發(fā),底物發(fā)夾被依次打開(kāi),從而觸發(fā)連續(xù)組裝步驟,進(jìn)而完成擴(kuò)增[15-16]。由于該技術(shù)操作過(guò)程簡(jiǎn)單,具有無(wú)需聚合酶、擴(kuò)增效率高等突出優(yōu)勢(shì),已成為檢測(cè)Pb2+的一種重要信號(hào)擴(kuò)增策略[17-18]。目前CHA擴(kuò)增大都是線性擴(kuò)增,擴(kuò)增效率不高。本工作通過(guò)擴(kuò)展GR-5 DNAzyme序列,利用DNA樹(shù)枝狀聚合物動(dòng)態(tài)立體自組裝信號(hào)放大策略開(kāi)發(fā)了一種無(wú)酶、高靈敏的熒光傳感體系,并應(yīng)用于實(shí)際水樣中痕量Pb2+測(cè)定,取得了滿(mǎn)意結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FS5型愛(ài)丁堡熒光光譜儀;ThermoStat plusTM型孵育器;JY-SCZ2+型雙垂直電泳儀; hemiDoc XRS型凝膠成像掃描儀。

Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液:500 μmol·L-1,準(zhǔn)確稱(chēng)取0.016 g Pb(NO3)2,用水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加入硝酸0.5 mL與水5 mL,用水稀釋至刻度,搖勻。使用時(shí),用水稀釋至所需濃度。

羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液:pH 7.4,內(nèi)含10 mmol·L-1Tris-HCl 、10 mmol·L-1NaCl和10 mmol·L-1MgCl2。

核酸電泳緩沖液:根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)操作指南》(第三版),取適量Tris-HCl、硼酸以及乙二胺四乙酸二鈉,用水溶解和稀釋,配制10×TBE(Tris-HCl、硼酸以及乙二胺四乙酸二鈉簡(jiǎn)稱(chēng))緩沖液。

本工作使用的DNA均為高效液相色譜級(jí),包括GR-5 DNAzyme酶鏈GR-5E(5′-ATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGA-3′),底物鏈GR-5S(5′-TCACTATrAGGAAGAGATGATGTGATAGGGGT-3′),骨架鏈Y1(5′-ATGGTTGGTGGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG-3′)、 Y2(5′-GTGTGTCTGGTGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT-3′)、Y3(5′-CGAGAGGAAGGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA-3′),發(fā)夾鏈H1(5′-CCCACCAACCAT-Dabcyl-GATGATGTGATAGGGGTACAACACTAACCTTACCCCTATCACATCATCTCTTCC-FAM-3′)、H2(5′-CACCAGACACACGGGGTACAACACTAACCTGGAAGAGATGATAGGTTAGTGTTGTACCCCTATCAC-3′)、H3(5′-CCCTTCCTCTCGTAACCTGGAAGAGATGATGTGATAGGGGTAATCATCTCTTCCAGGTTAGTGTTG-3′)。Pb(NO3)2、Tris-HCl、四甲基乙二胺(TEMED)、冰乙酸、尿素等試驗(yàn)所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水均為超純水,電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 試驗(yàn)方法

取1∶1(物質(zhì)的量比)的GR-5E和GR-5S,于95 ℃恒溫孵育5 min,冷卻至室溫(25 ℃),將得到的復(fù)合物GR-5E-S置于4 ℃冰箱中冷藏備用。取1∶1∶1(物質(zhì)的量比)骨架鏈Y1、Y2和Y3,置于PCR管中,于95 ℃恒溫孵育5 min,冷卻至室溫,在此溫度下孵育2 h,制成Y型骨架。將適量發(fā)夾鏈H1、H2和H3分別溶解在Tris-HCl緩沖液中,先于95 ℃孵育5 min,放至室溫,再在此溫度下至少放置2 h,制得100 μmol·L-1發(fā)夾溶液備用。在Tris-HCl緩沖液加入適量Y型骨架和H1、H2和H3發(fā)夾溶液,使其濃度均達(dá)到10 μmol·L-1,渦旋混勻,于25 ℃孵育1 h,制成發(fā)夾三聚體溶液。將水樣( Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、干擾離子溶液) 4 μL分別添加到96 μL含400 nmol·L-1GR-5E-S和400 nmol·L-1發(fā)夾三聚體的反應(yīng)溶液中,于25 ℃孵育40 min,完成底物切割和自組裝信號(hào)擴(kuò)增。取100 μL上述溶液置于石英比色皿中,用熒光光譜儀測(cè)量其熒光強(qiáng)度,設(shè)置狹縫寬度為 1 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm,掃描范圍為500～650 nm。隨同進(jìn)行空白試驗(yàn)

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光傳感原理

3條DNA骨架鏈Y1、Y2、Y3反應(yīng)形成Y型骨架后和3個(gè)DNA發(fā)夾鏈H1、H2、H3形成發(fā)夾三聚體,其中H1上3′端修飾了熒光團(tuán)(FAM),5′端修飾了猝滅團(tuán)(Dabcyl),發(fā)夾三聚體因熒光團(tuán)和猝滅團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移而保持很低的熒光背景。底物鏈的部分序列被設(shè)計(jì)成可以觸發(fā)DNA動(dòng)態(tài)自組裝過(guò)程的目標(biāo)鏈T。Pb2+存在時(shí),底物鏈被切割釋放目標(biāo)鏈T。目標(biāo)鏈T與發(fā)夾三聚體上H1部分序列雜交,使熒光團(tuán)和猝滅團(tuán)分開(kāi),產(chǎn)生熒光;H1剩余序列打開(kāi)發(fā)夾三聚體上另一個(gè)發(fā)夾H2。重復(fù)上述過(guò)程,實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)自組裝,形成樹(shù)枝狀聚合物,產(chǎn)生高效放大的熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的高靈敏定量熒光檢測(cè)。熒光傳感原理如圖1所示。

圖1 Pb2+檢測(cè)的熒光傳感原理圖Fig.1 Schematic of fluorescence sensing principle for detection of Pb2+

2.2 熒光傳感原理的驗(yàn)證

2.2.1 Pb2+對(duì)目標(biāo)鏈T的釋放

通過(guò)17%(聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù))尿素-聚丙烯酰胺電泳(Urea-PAGE)驗(yàn)證底物鏈擴(kuò)展的目標(biāo)鏈T能否有效釋放。取30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))丙烯酰胺凝膠液 6.8 mL、尿素 5.04 g、10×TBE緩沖液 1.2 mL、10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過(guò)硫酸銨(APS)溶液100 μL、TEMED 8 μL,混合后用水定容至12 mL,注入膠板,于25 ℃聚合30 min,制得17% Urea-PAGE膠。在10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中分別引入10 μmol·L-1GR-5E、10 μmol·L-1GR-5S以及0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0 nmol·L-1內(nèi)含10 μmol·L-1GR-5E-S的Pb2+,各取6 μL,分別于膠板泳道1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#上樣,于 90 V電泳30 min,然后于140 V電泳直至結(jié)束,用凝膠成像掃描儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示:引入GR-5E以及GR-5S時(shí),在凝膠中觀察不到目標(biāo)鏈T條帶;引入Pb2+時(shí),可以在凝膠中觀察到目標(biāo)鏈T條帶,這是因?yàn)镻b2+會(huì)激發(fā)GR-5 DNAzyme的催化活性,使之切割底物鏈并釋放目標(biāo)鏈T;隨著Pb2+濃度的增加,目標(biāo)鏈T條帶顏色逐漸變深,被切割的底物鏈條帶顏色逐漸變淺。以上結(jié)果表明,設(shè)計(jì)目標(biāo)鏈T能被Pb2+有效釋放,且其釋放量依賴(lài)于Pb2+濃度。

2.2.2 Y型骨架的形成和擴(kuò)增產(chǎn)物的生成

利用8%(聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù))非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)驗(yàn)證Y型骨架的形成和擴(kuò)增產(chǎn)物的生成。將30%丙烯酰胺凝膠液2.7 mL、10×TAE 緩沖液1 mL、6.2 mL水、10% APS溶液90 μL、TEMED 10 μL混合后注入膠板,于25 ℃聚合30 min,即制得Native-PAGE膠。取溶液Y1、Y2、Y3、Y1+Y2、Y1+Y3、Y2+Y3、Y型骨架、H1+H2+H3、H1、H2、H3、Y型骨架、發(fā)夾三聚體、發(fā)夾三聚體+Pb2++GR-5E-S各5 μL,濃度均為2 μmol·L-1,分別于膠板泳道1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#上樣,于170 V電泳5 min,然后于110 V電泳直至結(jié)束,用 凝膠成像掃描儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示:泳道1#～3#分別對(duì)應(yīng)Y1、Y2、Y3,三者遷移速率基本一致;泳道4#～6#分別對(duì)應(yīng)Y1+Y2、Y1+Y3、Y2+Y3,遷移速率基本一致且慢于前3條泳道,這是因?yàn)楣羌苕渻蓛芍g發(fā)生了相同的交叉反應(yīng),相對(duì)分子質(zhì)量增加;泳道7#對(duì)應(yīng)Y型骨架,其條帶較前6條泳道的遷移速率更慢,說(shuō)明3個(gè)骨架鏈之間發(fā)生交叉反應(yīng)形成了Y型骨架;泳道8#～11#分別對(duì)應(yīng)H1+H2+H3、H1、H2、H3,其遷移速率基本一致,證明3個(gè)發(fā)夾之間不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng);泳道13#對(duì)應(yīng)的是發(fā)夾三聚體的條帶,其遷移速率較Y型骨架(泳道12#)以及H1+H2+H3(泳道8#)的更慢,這是由于Y型骨架分別和H1、H2、H3之間發(fā)生了堿基互補(bǔ)配對(duì)而形成發(fā)夾三聚體;在Pb2+加入后,GR-5E-S中的底物鏈被切割并釋放目標(biāo)鏈T,觸發(fā)發(fā)夾三聚體的動(dòng)態(tài)自組裝過(guò)程,在泳道14#中出現(xiàn)擴(kuò)增后形成的樹(shù)枝狀聚合物條帶,表明設(shè)計(jì)的熒光擴(kuò)增策略是可行的。

為進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的生成,取20 μL發(fā)夾三聚體溶液以及80 μL傳感體系(內(nèi)含擴(kuò)增產(chǎn)物)溶液,用水稀釋至1 mL,采用納米粒度儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試[19],發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的粒徑約是發(fā)夾三聚體的10倍(圖2),進(jìn)一步證明擴(kuò)增策略的可行性。

圖2 發(fā)夾三聚體以及擴(kuò)增產(chǎn)物的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of hairpin trimers and amplicon

為了驗(yàn)證熒光傳感檢測(cè)Pb2+的可行性,考察了100.0 nmol·L-1Pb2+加入前后傳感體系的熒光光譜,見(jiàn)圖3。

圖3 Pb2+加入前后傳感體系的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of the sensing system before and after the addition of Pb2+

由圖3可知,在加入100.0 nmol·L-1Pb2+后,傳感體系的熒光強(qiáng)度顯著增加,約為加入前的3倍。這主要?dú)w因于Pb2+使底物鏈裂解并釋放目標(biāo)鏈T,觸發(fā)動(dòng)態(tài)自組裝過(guò)程,從而實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的放大。

2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

為使熒光傳感性能達(dá)到最佳,以100.0 nmol·L-1Pb2+為待測(cè)對(duì)象,對(duì)傳感體系中的發(fā)夾三聚體濃度(0～600 nmol·L-1)、Tris-HCl緩沖液酸度(pH 7.0～8.0)、GR-5E-S濃度(0～1000 nmol·L-1)以及擴(kuò)增反應(yīng)的孵育時(shí)間(0～60 min)等試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,所得的最優(yōu)條件:400 nmol·L-1發(fā)夾三聚體、Tris-HCl緩沖液酸度pH 7.4、400 nmol·L-1GR-5E-S、孵育時(shí)間40 min。

2.4 選擇性試驗(yàn)

在反應(yīng)溶液中不添加金屬離子(Blank),加入100 nmol·L-1Pb2+,分別加入500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+,加入500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+的混合離子(Mix)或加入100 nmol·L-1Pb2+和500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+(Mix+ Pb2+)的混合離子,上機(jī)測(cè)試,不同情況下傳感體系的熒光強(qiáng)度如圖4所示。

圖4 傳感體系對(duì)pb2+的選擇性Fig.4 Selectivity of sensing system for pb2+

由圖4可知:加入500 nmol·L-1各干擾離子后,傳感體系的熒光強(qiáng)度相較Blank的變化很小;加入100 nmol·L-1Pb2+,傳感體系的熒光強(qiáng)度明顯增大,說(shuō)明傳感體系對(duì)Pb2+具有良好的選擇性;加入混合干擾離子后,傳感體系熒光強(qiáng)度相較Blank的也沒(méi)有顯著變化;混合干擾離子與Pb2+共存時(shí),傳感體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),相較Pb2+單獨(dú)存在時(shí)略微降低,表明該傳感體系基本不受其他金屬離子的干擾,對(duì)Pb2+具有良好的選擇性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在反應(yīng)溶液中分別添加0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0, 200.0, 400.0 nmol·L-1Pb2+,按照試驗(yàn)方法測(cè)量上述溶液的熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)傳感體系的熒光強(qiáng)度隨著Pb2+濃度的增加而增加。以Pb2+濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的傳感體系的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,Pb2+濃度在0.1～10.0 nmol·L-1內(nèi)和對(duì)應(yīng)的傳感體系的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=0.032 13x+ 0.486 4,相關(guān)系數(shù)為0.993 4。

按照試驗(yàn)方法重復(fù)分析空白樣品10次,以3倍傳感體系熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)的比值計(jì)算檢出限(3s/k),結(jié)果為19 pmol·L-1。

將本方法建立的熒光傳感體系的檢測(cè)時(shí)間、線性范圍以及檢出限與文獻(xiàn)報(bào)道的其他熒光傳感體系的進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見(jiàn)表1。其中ExoⅢ代表核酸外切酶Ⅲ,UCNPs-MNPs-GNPs代表上轉(zhuǎn)換納米粒子、磁性納米粒子和金納米粒子組成的熒光探針, CDAu代表?yè)浇鹛键c(diǎn)。

表1 不同熒光傳感體系檢測(cè)Pb2+的性能比較

由表1可知,與已報(bào)道的熒光傳感體系相比,本工作開(kāi)發(fā)的GR-5 DNAzyme + DNA動(dòng)態(tài)自組裝熒光傳感體系具有較高的靈敏度和檢測(cè)效率。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

采集湖水和實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水水樣,于6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min,加入適量Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成Pb2+濃度為1.0,5.0,10.0 nmol·L-1的加標(biāo)水樣,每個(gè)加標(biāo)濃度水平重復(fù)測(cè)定5次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表2可知,各加標(biāo)水樣所得Pb2+測(cè)定值的RSD不大于15%,回收率為98.0%～108%,表明本工作所建熒光傳感體系對(duì)Pb2+的檢測(cè)是準(zhǔn)確可靠的,可用于實(shí)際水樣中Pb2+的快速檢測(cè)。

本工作利用GR-5 DNAzyme對(duì)Pb2+的特異性識(shí)別性能,通過(guò)發(fā)夾DNA動(dòng)態(tài)自組裝信號(hào)放大策略構(gòu)建了一種新型無(wú)酶、高靈敏的Pb2+熒光傳感體系。該熒光傳感體系無(wú)需額外的DNA模板或引物,由靶標(biāo)觸發(fā)自組裝擴(kuò)增,大大提高了檢測(cè)靈敏度,簡(jiǎn)化了操作步驟,降低了制作成本,在環(huán)境水樣的質(zhì)量監(jiān)測(cè)中具有良好的發(fā)展前景,且其設(shè)計(jì)概念有望應(yīng)用到其他目標(biāo)物的檢測(cè),為生物傳感和成像領(lǐng)域提供借鑒。