苗會娟，徐艷梅，王茉莉，郝麗娟，高燕霞

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評價重點實驗室，河北 石家莊 050200）

復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏是由魚肝油、呋喃西林、氧化鋅、凡士林、石蠟等制成的復(fù)方脂溶性軟膏，主要用于尿布炎、膿瘡、濕疹等的治療，與其他藥物聯(lián)用的效果更好［1-3］。該軟膏處方為每克含氧化鋅200 mg、魚肝油80 mg（每1 g含維生素A 10 000 IU與維生素D 1 000 IU、呋喃西林1 mg）。魚肝油含維生素A、維生素D、角鯊烯等營養(yǎng)物質(zhì)，有抗炎、營養(yǎng)皮膚、加快創(chuàng)傷愈合的效果［4］。復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于《國家藥品標準·化學(xué)藥品地標升國標第六冊》WS1-10001 -（HD - 0549）- 2002。該標準中僅對氧化鋅的含量進行了控制，缺少魚肝油中有效成分維生素A和維生素D 的含量測定。為提高藥品質(zhì)量標準，保障用藥的安全性與有效性，本研究中建立了測定復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏中維生素A含量的高效液相色譜法，并進行了方法學(xué)驗證，為其質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo 公司）；AS 3120 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為120 W，頻率為40 kHz）；XS105 型電子天平（Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

維生素A 醋酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100368 - 201803，每1 g 含維生素A 醋酸酯344 mg ＜100 萬IU ＞，其中含反式維生素A 醋酸酯98.0%）；復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏（天津市金耀藥業(yè)有限公司，批號分別為19030401，19030402，19030403）；正己烷、異丙醇（色譜純，德國Merck公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters silica 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇（997∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：325 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取維生素A 醋酸酯對照品10 mg（相當于維生素A 10 000 IU），精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用正己烷溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2 mL，置25 mL 容量瓶中，用正己烷定容，即得每1 mL約含80 IU維生素A的對照品溶液。

供試品溶液：取樣品0.5 g（約相當于維生素A 400 IU），精密稱定，置離心管中，精密加入50 mL正己烷，精密稱定質(zhì)量，80 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，用正己烷補足減失的質(zhì)量，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/ min）5 min，取上清液，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備缺魚肝油的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取維生素A醋酸酯對照品300 mg，置200 mL 容量瓶中，用正己烷定容，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用正己烷定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下4 種溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果維生素A峰與其順式異構(gòu)體峰的分離度均大于3.0，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

1. 維生素AA. 系統(tǒng)適用性溶液 B. 供試品溶液 C. 對照品溶液 D. 陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Vitamin AC.System suitability solution B.Test solution C.Reference solution D.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取維生素A醋酸酯對照品28.60 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加正己烷溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液（286.0 IU/mL）；再用正己烷逐級稀釋為維生素A 活性單位濃度分別為28.60，14.30，7.15，5.72，1.43 IU/ mL 的系列溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以對照品的活性單位濃度（X，IU/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.510 7X-0.090 7（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，維生素A 醋酸酯活性單位濃度在1.43～28.60 IU/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限確定：取2.2 項下陰性對照品溶液，加入適量對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）分別為10∶1 和3∶1 時的信號響應(yīng)值為定量限和檢測限。結(jié)果檢測限為30 μg/g，定量限為100 μg/g。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為19030401）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果的RSD為2.04%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗：取重復(fù)性試驗測定用第1份供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液（批號為19030401）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8 h 時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.42%（n=4），表明供試品溶液在室溫下放置8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為19030401）0.5 g，精密稱定，共6 份，分別置100 mL 容量瓶中，精密加入對照品貯備液1.4 mL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 維生素A加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of vitamin A（n=6）

耐用性試驗：取樣品（批號為19030401）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別設(shè)置色譜柱［鈉譜硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Waters Silica 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），月旭硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］和液相色譜儀［日本Shimadzu LC - 20AT 型、美國Agilent 1260 型、美國Thermo Fisher U3000 型］，分別按2.1 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果均能滿足系統(tǒng)適用性試驗要求。

2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為19030401，19030402，19030403）樣品內(nèi)容物，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果3 批樣品中維生素A的含量分別為760.34，794.62，747.67 IU/g。

3 討論

維生素A 的含量測定方法主要有高效液相色譜-紫外檢測器法［5-6］、紫外-分光光度法［7］、液相-熒光分光光度法［8］、超高效液相色譜-質(zhì)譜法［9-10］、二維色譜法［11］等。但液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價格昂貴，紫外-可見分光光度法靈敏度低、專屬性差，熒光檢測器不常見，二維色譜的應(yīng)用受限，故本研究中采用正相高效液相色譜法測定樣品中維生素A的含量。

與2020年版《中國藥典（四部）》通則0731 第二法［12］相比，本研究中簡化了系統(tǒng)適用性溶液的配制過程?？紤]到維生素A醋酸酯對照品含有順式維生素A醋酸酯，且碘試液具有較強的刺激性氣味和腐蝕性，不需再添加碘試液。故直接用作系統(tǒng)適用性溶液，安全性更高。

維生素A的提取方法主要有皂化法和直接提取法。魚肝油是由鮫類動物Squahdae 等無毒海魚肝臟中提取的一種脂肪油，在0 ℃左右脫去部分固體脂肪后，用精煉食用植物油、濃度較高的魚肝油或維生素A與維生素D3調(diào)節(jié)濃度，再加適量穩(wěn)定劑制成［13］，具有較強的脂溶性，用皂化法提取相對煩瑣。故采用直接提取法進行提取。曾考察甲醇［11］、乙醇［10］、異丙醇［14］、二甲基亞砜［15］、正己烷［12］、正庚烷等有機溶劑作為提取劑的提取效果，結(jié)果正己烷的提取液澄清度最佳，維生素A的提取率最高。故最終選擇正己烷作為提取溶劑。曾采用正交試驗法考察水浴溫度、提取時間和溶劑體積對維生素A的提取率的影響。結(jié)果80 ℃水浴加熱15 min，溶劑體積為50 mL的提取效果最佳。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便、重復(fù)性好、結(jié)果準確，可用于復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏中維生素A的含量測定。