◎ 黃曉韻，楊麗玉，巫 堅(jiān)

（1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530029；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全及其質(zhì)量越來(lái)越重視。特別是在深加工食品領(lǐng)域，由于復(fù)雜的加工工藝，摻偽、轉(zhuǎn)基因成分、過(guò)敏原性成分等的檢測(cè)問(wèn)題越來(lái)越突出?；诤怂岬姆肿由飳W(xué)檢測(cè)方法具有高特異性、高靈敏度和簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到深加工食品源性成分鑒定等檢測(cè)中。深加工食品加工過(guò)程中多種因素會(huì)對(duì)核酸造成破壞[1]，且內(nèi)含成分復(fù)雜，造成核酸提取難度加大。因而，深加工食品的核酸提取一直是研究的難點(diǎn)及熱點(diǎn)[2]。

柳州螺螄粉以其獨(dú)特的風(fēng)味在最近幾年迅速走紅，其中獨(dú)特的“鮮”味來(lái)源于螺螄肉湯包。《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 柳州螺螄粉》（DBS 45/034—2021）中規(guī)定，螺螄肉湯料包是以鮮（凍）螺螄或螺螄肉、鮮（凍）畜骨或禽骨、食用鹽、食用油脂（或不添加）、調(diào)味料等為原料，經(jīng)原料預(yù)處理、加水熬制、過(guò)濾、冷卻（或不冷卻）、包裝、殺菌（或不殺菌）等工藝加工制成的。其中，螺螄主要包括環(huán)棱螺屬（Bellamya）和圓田螺屬（Cipangopaludina）等淡水經(jīng)濟(jì)螺類，畜骨或禽骨也沒(méi)有明確的種類，動(dòng)物源性成分不明；甚至各種調(diào)味料還可能涉及轉(zhuǎn)基因成分或過(guò)敏原性成分?；诤怂岱肿犹貏e是脫氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid，DNA）分子的檢測(cè)方法，在鑒定源性成分領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)[4]、實(shí)時(shí)熒光PCR（Quantitative Real-Time PCR，qPCR）技術(shù)[5]和數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)[6]。

螺螄肉湯包內(nèi)含物成分復(fù)雜，多油脂、鹽類和色素，且經(jīng)高溫熬制，對(duì)核酸分子破壞嚴(yán)重。本研究通過(guò)比較分析常用的核酸提取方法，優(yōu)化改良適合類似深加工食品的核酸提取方法，盡量去除雜質(zhì)干擾，得到能進(jìn)行下一步分子檢測(cè)的有效核酸，為湯料包內(nèi)含物源性成分的分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

預(yù)包裝螺螄粉，均為市售。

十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、乙酸鉀、3 mol·L-1乙酸鈉、苯酚（Tris-飽和酚）及核酸抽提液（三氯甲烷和異戊醇的體積比為24 ∶1）：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；食品DNA 提取試劑盒：德國(guó)凱杰（QIAGEN）公司產(chǎn)品；深加工食品DNA 提取試劑盒、熒光PCR 試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

OSE-DB-03 型恒溫振蕩金屬浴、OSE-260-01TGem Plus 型全波長(zhǎng)微量分光光度計(jì)：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；MIKPO185 型小型離心機(jī)：德國(guó)赫提馳科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；Applied Biosystems 7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取方法

（1）CTAB 法提取DNA。 參考標(biāo)準(zhǔn)《 肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》（SB/T 10923—2012）中樣品的總DNA 提取方法。

（2）SDS 法提取DNA。參考《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) DNA 提取和純化》（農(nóng)業(yè)部2406 號(hào)公告-7-2016）中樣品的總DNA 提取方法。

（3）TIANGEN 沉淀式DNA 提取試劑盒（以下簡(jiǎn)稱TIANGEN 試劑盒）提取DNA。參考天根生化科技（北京）有限公司的深加工食品DNA 提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)。

（4）QIAGEN 過(guò)柱式DNA 提取試劑盒（以下簡(jiǎn)稱QIAGEN 試劑盒）提取DNA。參考德國(guó)凱杰（QIAGEN）食品DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)。

（5）改良CTAB 法提取DNA。吸取混勻的1.5 mL螺螄肉湯包樣品液于2 mL EP 管中，8 000 r·min-1離心5 min，用一次性無(wú)菌脫脂棉簽小心刮去凝結(jié)浮在上層的油脂，保留沉淀物。加入1 mL 無(wú)菌雙蒸水，渦旋振蕩洗滌，12 000 r·min-1離心5 min 后棄上清。再次用一次性無(wú)菌脫脂棉簽小心刮去凝結(jié)浮在上層的油脂，保留沉淀物。重復(fù)上述流程，直至離心后上層無(wú)明顯油脂且洗滌的液體顏色基本褪色變淡。向所得沉淀中加入700 μL DNA 提取裂解液，再加入20 μL蛋白酶K，混勻，置于65 ℃水浴3 h，并不時(shí)振蕩；12 000 r·min-1離心5 min，取上清液至新的1.5 mL 離心管中，加入等體積苯酚，充分混勻后12 000 r·min-1離心5 min；取上清，加入等體積核酸抽提液，充分混勻，12 000 r·min-1離心5 min；取上清，加入1/10 體積的3 mol·L-1乙酸鈉溶液，混勻后再加入2 倍體積-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20 ℃下靜置1 h，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清；70%乙醇洗滌3 次沉淀，于室溫下晾干，加入50 μL 雙蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 螺螄肉湯包中DNA 提取效果比較分析

（1）DNA 的濃度和純度測(cè)定分析。吸取1 μL DNA樣液，使用全波長(zhǎng)微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的質(zhì)量濃度與純度。在儀器上可直接讀出DNA 的質(zhì)量濃度以及A260/A280和A260/A230的值。根據(jù)A260/A280和A260/A230的值判斷所提取的基因組DNA 的純度，其中A260/A280表示DNA 中去除蛋白質(zhì)和酚物質(zhì)的情況，A260/A230的值表示DNA 中去除碳水化合物或有機(jī)溶劑的情況[7]。

（2）實(shí)時(shí)熒光PCR 上機(jī)檢測(cè)提取DNA 的有效性。參考《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》（GB/T 38164—2019）中的18S rRNA 基因內(nèi)參引物探針，上機(jī)檢測(cè)提取DNA 是否有效滿足下游分子檢測(cè)需要。其中上游引物序列為T(mén)CTGCCCTATC AACTTTCGATGGTA，下游引物序列為AATTTGCGC GCCTGCTGCCTTCCTT，熒光探針序列5’FAM-CCG TTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-3’TAMRA。

實(shí)時(shí)熒光PCR 總反應(yīng)體系為20 μL，體系組成為PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 5 μL（稀釋到5～50 ng·μL-1），內(nèi)參引物的上下游引物各0.6 μL，熒光探針0.4 μL，加雙蒸水至20 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min 并收集熒光，40 次循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取效果比較

2.1.1 DNA 濃度和純度的比較

用同一包預(yù)包裝螺螄粉的螺螄肉湯包，分別按照1.3.1 中的（1）～（4）4 種方法平行提取DNA 兩份，用全波長(zhǎng)微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的質(zhì)量濃度和純度，如表1 所示。

表1 4 種不同DNA 提取方法對(duì)螺螄肉湯包樣品的DNA 提取效果比較表

本試驗(yàn)采用的4 種方法取樣量均相同，經(jīng)儀器測(cè)定可直接比較DNA 的質(zhì)量濃度。4 種提取方法中TIANGEN 試劑盒法提取得到的DNA 質(zhì)量濃度最高，其次分別是CTAB 法和SDS 法，QIAGEN 試劑盒最低。4 種提取方法的DNA 提取濃度平均值之間最大相差近66 倍，說(shuō)明不同提取方法分離純化湯包中總DNA 的效率有較大差異。TIANGEN 試劑盒法使用的是沉淀法，裂解上清液損失最少，這可能是該方法DNA 提取濃度最大的原因；雖然QIAGEN 試劑盒法也使用了蛋白酶K 輔助裂解組織，但螺螄肉湯包的原料在經(jīng)過(guò)復(fù)雜加工后，核酸被破壞嚴(yán)重，特別是被打斷短小化，所以使用過(guò)柱吸附DNA 的方式損失量較大，這可能是該方法DNA 提取濃度最小的原因。

一般來(lái)說(shuō)，理想DNA 的A260/A280值在1.6 ～2.0，小于1.6 表明有蛋白質(zhì)污染，大于2.0 可能有RNA 污染；A260/A230值在2.0 左右，小于2.0 可能存在鹽類及其他有機(jī)化合物的污染。如表1 所示，4 種不同DNA提取方法提取得到的總DNA 的純度差別較大。其中，CTAB 法的A260/A280值更接近1.6，蛋白質(zhì)的去除較好，但還有提高的空間；其他3 種方法的A260/A280值相對(duì)較低。4 種提取方法的A260/A230值普遍較低，螺螄肉湯包的湯料含有大量的油脂沒(méi)有被去除，其可能會(huì)與某些鹽離子吸附，DNA 中鹽類雜質(zhì)殘留較多，在230 nm處亦有較高的吸收值，使得A260/A230值降低。

2.1.2 DNA 有效性的比較

以18S rRNA 基因內(nèi)參引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)。當(dāng)熒光通道有熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值≤30.0，表明提取得到的DNA的濃度及純度基本滿足分子檢測(cè)擴(kuò)增試驗(yàn)的要求。對(duì)4 種方法提取得到的DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，其擴(kuò)增曲線圖譜及擴(kuò)增效果如圖1 和表2 所示。

①～⑧的擴(kuò)增曲線分別表示相對(duì)應(yīng)的提取序號(hào)。圖1 4種DNA 提取方法提取的DNA 樣液實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線圖

表2 4 種DNA 提取方法提取的DNA 樣液實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增效果表

結(jié)合圖1 及表2，可見(jiàn)CTAB 法、SDS 法和QIAGEN試劑盒法所提取的總DNA 以18S rRNA 基因內(nèi)參引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)均有較好的熒光擴(kuò)增曲線，且Ct 值均在30.0 以內(nèi)，即表明以上3 種方法提取的DNA 是有效可行的。其中CTAB 法提取的總DNA 擴(kuò)增的Ct 值最低，效果最好。TIANGEN 試劑盒法所提取的總DNA 未檢測(cè)到有效熒光，可能是提取得到的DNA 中雜質(zhì)較多，含有抑制熒光擴(kuò)增的物質(zhì)。

2.2 改良CTAB 法提取螺螄肉湯包中DNA 的效果及分析

螺螄肉湯包包含了大量的鹽類、脂肪以及色素等物質(zhì)，嚴(yán)重降低提取DNA 的效果。針對(duì)前述4 種提取DNA 方法的結(jié)果，選取初步提取效果較好的CTAB法進(jìn)行改良。在加入裂解提取液前，用無(wú)菌雙蒸水多次洗滌沉淀，去除水溶性的鹽類及色素，同時(shí)脂肪由于離心作用凝結(jié)浮在液體上層，可用無(wú)菌脫脂棉簽去除。此外，由于提取的DNA 的A260/A230值普遍較低，所以在乙醇沉淀DNA 后用70%乙醇洗滌時(shí)，增加兩次洗滌，盡量去除殘留鹽類等雜質(zhì)。經(jīng)相同取樣，按照改良CTAB 法提取的DNA 的質(zhì)量濃度如表3 所示。對(duì)改良CTAB 法提取的DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 上機(jī)檢測(cè)，有效性如圖2 及表4 所示。

①和②的擴(kuò)增曲線分別表示相對(duì)應(yīng)的提取重復(fù)序號(hào)。圖2 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線圖

表3 改良CTAB 法對(duì)螺螄肉湯包樣品的DNA 提取效果比較表

表4 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增效果表

結(jié)合表1 及表3 可知，CTAB 法經(jīng)改良后，提取DNA 的A260/A280值明顯提高且在正常范圍內(nèi)，表明提取過(guò)程中蛋白質(zhì)去除比較徹底。這可能是因?yàn)樵诩尤氲鞍酌窴 恒溫酶解前用無(wú)菌雙蒸水去除湯包中的雜質(zhì)，特別是水溶性的鹽類以及脂肪，減少了抑制蛋白酶K 酶活的物質(zhì)，提高了酶解效率。這也從最后的質(zhì)量濃度提高了接近一倍得到佐證。此外，改良CTAB法由于在加入提取裂解液前用無(wú)菌雙蒸水去除湯包中的雜質(zhì)，特別是水溶性的鹽類以及脂肪，使得最后A260/A230值大大提高。雖然還達(dá)不到理想值，但實(shí)時(shí)熒光PCR 上機(jī)檢測(cè)結(jié)果表明其完全滿足后續(xù)分子檢測(cè)擴(kuò)增試驗(yàn)的要求，改良提取方法后，降低了Ct 值（表4）。

2.3 多批次不同品牌預(yù)包裝螺螄粉螺螄肉湯包中DNA的提取及效果分析

按照改良CTAB 法對(duì)多批次不同品牌預(yù)包裝螺螄粉螺肉湯包中的DNA 進(jìn)行提取，對(duì)得到的DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 效果分析，結(jié)果見(jiàn)圖3 和表5。改良后的CTAB 法提取多批次不同品牌實(shí)際樣品DNA 的效果良好，DNA 的濃度和純度滿足實(shí)時(shí)熒光PCR 要求，且有典型擴(kuò)增曲線，各樣品的擴(kuò)增Ct 值在16.045 ～26.116，適宜進(jìn)行下一步物源性成分分子檢測(cè)。

表5 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增效果表

3 結(jié)語(yǔ)

湯料包類深加工食品內(nèi)含成分既包含動(dòng)物源性成分，也包含植物源性成分，在食品安全監(jiān)管中對(duì)源性成分的檢測(cè)還是空白。這是因?yàn)檫@類深加工食品工藝復(fù)雜，對(duì)其中的成分物質(zhì)破壞嚴(yán)重，如特征蛋白質(zhì)完全變性；同時(shí)各種成分物質(zhì)含量較少，傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法對(duì)微量成分進(jìn)行檢測(cè)?；诤怂嵛镔|(zhì)的分子檢測(cè)方法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，但是必須提取到有效可行的核酸。本研究針對(duì)預(yù)包裝柳州螺螄粉螺螄肉湯包，比較了4 種常見(jiàn)DNA 提取方法的提取效果，選取提取效果較好的CTAB 法進(jìn)行改良，通過(guò)真核生物通用18S rRNA 內(nèi)參基因設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 驗(yàn)證提取效果，并進(jìn)一步用多批次實(shí)際樣品進(jìn)行提取DNA 上機(jī)確認(rèn)，成功尋找到一種簡(jiǎn)單、快捷、可行的提取預(yù)包裝柳州螺螄粉中螺螄肉湯包DNA 的方法，為下一步的源性成分鑒定奠定基礎(chǔ)。