◎ 詹 清，周阿容，林夢丹，揭小玲，鄭孝賢，王海龍，方東升

（福建省微生物研究所，福建 福州 350007）

微生物檢測實驗室是否能避免潛在生物污染是其質(zhì)量評估的重要指標(biāo)之一[1]，一旦檢測環(huán)境發(fā)生微生物污染可能會造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，檢測機(jī)構(gòu)在檢出樣品微生物超標(biāo)或致病微生物污染時往往出現(xiàn)溯源難、應(yīng)變慢等問題，因此檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)監(jiān)測、控制環(huán)境條件，最大限度地降低微生物污染以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。王似錦等[3]提出了環(huán)境分離菌更能夠反映樣品或環(huán)境實際存在微生物的情況，利用環(huán)境分離菌可使檢測結(jié)果對樣品質(zhì)量做出更客觀和科學(xué)的評價。因此了解微生物檢測環(huán)境的微生物負(fù)載情況，建立檢測環(huán)境的微生物信息庫，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，對于檢測機(jī)構(gòu)排除實驗過程中的污染隱患、減少假陽性微生物干擾和提高檢測結(jié)果公信力具有重要意義[4]。目前，國內(nèi)對藥品生產(chǎn)和檢驗環(huán)境建立環(huán)境菌庫方面的研究較多。例如，劉亞茹等[5]采用分子生物學(xué)鑒定方法對5 家制藥企業(yè)潔凈區(qū)微生物群落進(jìn)行鑒定和分析，但在微生物檢測實驗室建立環(huán)境微生物菌庫的研究相對較少。

本研究通過采集福建省微生物研究所（以下簡稱研究所）分析測試中心微生物檢測實驗室的環(huán)境微生物，結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)技術(shù)對微生物進(jìn)行鑒定和分類，初步構(gòu)建了研究所分析測試中心微生物檢測實驗室的環(huán)境菌株信息庫，為今后本實驗室檢測結(jié)果的溯源提供了方向，對檢測實驗室的污染控制和風(fēng)險評估具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖沙氏瓊脂培養(yǎng)基（廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司）；PCR 引物、2×TaqPCR Master Mix（生工生物工程股份有限公司）；TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒（通用型，貨號：TSP 101，擎科生物科技有限公司）。

細(xì)菌采用16S rDNA 通用引物27 F 和1492 R，真菌采用引物ITS 1 和ITS 4，以上引物均購于生工生物工程股份有限公司，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2 儀器

FKC-III 浮游菌采樣器（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；PCR 儀（Biometra）；電泳儀（上海百賽生物技術(shù)有限公司）；HVE-50 高壓蒸滅菌鍋（HIRAYAMA）；MIR-154-PC 低溫恒溫培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；CX 31 生物顯微（OLYMPUS）；NVT 6201ZH 電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；SW-CJ-1CU 潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣與培養(yǎng)

依據(jù)《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》（GB/T 16293—2010）和《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》（GB/T 16294—2010）[6-7]布置采樣點，連續(xù)12 個月對微生物檢測實驗室的不同部位和檢測人員，分別通過浮游菌采樣器法（采集環(huán)境浮游微生物）、空氣沉降法（采集環(huán)境沉降微生物）和接觸碟取樣法（采集檢測人員攜帶微生物）進(jìn)行樣本采集。采集完成后將樣本置于 37 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)48 h 和5 d。

1.3.2 分離純化

用無菌接種環(huán)挑取平板中非真菌菌落至TSA 平板，真菌菌落至SDA 平板分別進(jìn)行兩次以上平板劃線分離純化。

1.3.3 微生物鑒定

分離的微生物經(jīng)純化后進(jìn)行革蘭氏染色涂片鏡檢，初步判斷所得菌株類型后采用分子生物學(xué)方法對菌株進(jìn)行鑒定。

（1）基因組提取。用接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌，用50 μL雙蒸水懸浮成液，振蕩混勻后，放置在PCR 儀中，99 ℃加熱15 min；6 000 r·min-1離心10 min 后取上清液，作為后續(xù)PCR 反應(yīng)體系的DNA 模板。依據(jù)TSINGK 植物DNA 提取試劑盒（通用型）產(chǎn)品說明書提取真菌基因組。

（2）PCR 反應(yīng)體系。DNA 模板5 μL，正反引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊體系至50 μL。

（3）PCR 反應(yīng)條件。95 ℃預(yù)變性，5 min；95 ℃變性，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，1 min；循環(huán)35 次；72 ℃后延伸，10 min；10 ℃暫存。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物測序及比對。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取電泳結(jié)果中條帶單一、明亮的擴(kuò)增產(chǎn)物送往鉑尚生物股份有限公司進(jìn)行測序，將測序序列結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行Blast 同源性比對，取同源性在98.65%以上的結(jié)果作為比對結(jié)果[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境微生物分布

2.1.1 時間分布情況

本研究連續(xù)12 個月對微生物檢測實驗室不同部位和檢測人員進(jìn)行了樣本采集，每個月采集的菌株數(shù)如圖1 所示。其中第一季度平均采集到73 株菌，第二季度平均采集到103 株菌，第三季度平均采集到98 株菌，第四季度平均采集到88 株菌。

圖1 不同時間收集菌株數(shù)統(tǒng)計圖

2.1.2 區(qū)域分布情況

通過連續(xù)12 個月的樣本采集發(fā)現(xiàn)，不同月份的環(huán)境菌數(shù)量有所不同，但是種類并無顯著差別，9 月采集到的環(huán)境菌數(shù)量最多，共收集到109 株環(huán)境菌，詳見表2。其中非受控區(qū)域共采集到58 株菌，占全部菌株的53.21%；潔凈室共采集到36 株菌，占全部菌株的33.03%；從檢測人員身上共采集到15 株菌，占全部菌株的13.76%。

表2 9 月份樣本采集各區(qū)域菌株分布情況表

2.2 菌株鑒定結(jié)果

結(jié)合微生物菌落形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，對采集到的不同菌株進(jìn)行16S rDNA 測序鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果將采集到的菌株分為7 個屬，其中數(shù)量最多的葡萄球菌屬占37.61%，芽孢桿菌屬和微球菌屬分別占24.77%和13.76%。詳見表3。

表3 分離菌株的菌屬分布及數(shù)量表

2.3 環(huán)境菌信息庫的建立

根據(jù)采集到環(huán)境菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及測序比對結(jié)果，將收集到的環(huán)境微生物進(jìn)行歸納總結(jié)，詳見表4。

表4 環(huán)境菌信息統(tǒng)計表

3 結(jié)論與討論

從連續(xù)12 個月采集獲得菌株的結(jié)果分析，3—4 月采集獲得的真菌數(shù)量較多，經(jīng)分析認(rèn)為，3—4 月為當(dāng)?shù)氐拿酚昙竟?jié)，自然環(huán)境空氣濕度較高，檢測實驗室環(huán)境濕度高于設(shè)定的限值，容易導(dǎo)致真菌繁殖，主要為曲霉菌屬和青霉菌屬，這兩類真菌均能產(chǎn)生孢子，能在室內(nèi)空氣和灰塵中存活。因此在每年濕度較高的季節(jié)應(yīng)注意控制潔凈室的濕度，同時增加潔凈室清潔消毒的頻率，及時清潔與更換潔凈區(qū)空氣過濾器。9—10 月檢測人員進(jìn)出潔凈室較為頻繁，采集獲得的細(xì)菌數(shù)量也較多，容易在人類皮膚上棲居的微生物，如葡萄球菌屬和微球菌屬在多個采樣點均有發(fā)現(xiàn)，分析可能是由于檢測人員的頻繁活動或接觸造成的污染。這也表明，檢測人員身上容易攜帶的微生物是微生物檢測實驗室環(huán)境菌的主要來源之一，這與國內(nèi)外相關(guān)報道基本一致[9-11]。因此，為降低人為污染的風(fēng)險，應(yīng)嚴(yán)格控制潔凈區(qū)人員數(shù)量，強(qiáng)化檢測人員的無菌意識，避免過多接觸物料，規(guī)范進(jìn)入潔凈區(qū)的人員操作和清潔程序，同時在檢測活動頻繁時要及時制定更高頻率的清潔消毒程序。從采集獲得菌株的結(jié)果分析得知，檢測環(huán)境中還存在多種芽孢桿菌，可選擇消殺效能高的消毒劑，從而達(dá)到控制潛在污染微生物的風(fēng)險。本研究通過連續(xù)12 個月對實驗室不同部位進(jìn)行采樣收集，初步建立了研究所微生物檢測實驗室的環(huán)境菌庫，但是建立環(huán)境菌庫是一個動態(tài)管理的過程，后期需要進(jìn)行日常監(jiān)測追蹤，不斷更新和完善環(huán)境菌庫溯源體系，當(dāng)出現(xiàn)趨勢變化或異常情況應(yīng)及時采取有效整改措施。