◎ 劉 京，李榮喬，張勝楠，李 成，馬 軍

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050000）

山楂為薔薇科植物，在我國(guó)河北、山東、江西、遼寧等地均有廣泛種植，被列為主要樹(shù)種之一[1-2]。山楂，性味微酸、甘，微溫，入脾、胃、肝經(jīng)，具有消食積、行瘀、化滯等功效[3]。山楂是一種藥食同源的植物，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)功能食品的開(kāi)發(fā)。

糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水，并由糖苷鍵連接而成的高分子碳水化合物，與蛋白質(zhì)、核苷酸被稱作是維持生命活動(dòng)的三大物質(zhì)，也是中藥材的主要活性成分之一。多糖具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌和提高免疫力等多種生物活性，而且使用安全、不良反應(yīng)少，被認(rèn)為是藥品和食品開(kāi)發(fā)與利用的理想原料[4-5]。

多糖的提取方法有很多，包括水提法[6]、酶解提取法[7]、酸堿提取法[8-9]、超聲提取法[10]和微波提取法[11]等。為實(shí)現(xiàn)多糖提取的工業(yè)化生產(chǎn)，考慮到酸堿提法易腐蝕提取管道，超聲提取法和微波提取法的試驗(yàn)條件不易實(shí)現(xiàn)放大化，本試驗(yàn)選擇水提法和酶解提取法進(jìn)行條件優(yōu)化并對(duì)比，以多糖含量為指標(biāo)，采用苯酚-硫酸分光光度法進(jìn)行含量檢測(cè)，最終篩選出提取山楂多糖的最適條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂片，河北藺氏盛泰藥業(yè)有限公司；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶，夏盛生物技術(shù)有限公司；苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（QUINTIX2102-1CN），賽多利斯；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超聲波清洗器（KQ-700VDE），昆山舒美；離心機(jī)（X-15R），美國(guó)貝克曼公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Evolution 201），美國(guó)Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將山楂片置于40 ℃烘箱內(nèi)恒溫干燥4 h，烘干后粉碎，將所得粉末狀樣品低溫密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 山楂多糖酶解提取法的單因素試驗(yàn)

（1）酶種類的篩選。稱取4 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入純水，分別加入5‰的果膠酶、5‰的纖維素酶、5‰的半纖維素酶、5‰的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)至各酶適合的pH 值，50 ℃水浴酶解1.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

（2）酶用量的優(yōu)化。稱取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入純水，分別加入1‰、3‰、5‰、7‰和9‰的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)至pH=7，50 ℃水浴酶解1.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

（3）酶解時(shí)間的優(yōu)化。稱取4 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入純水，加入7‰的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)至pH=7，50 ℃水浴，分別酶解0 h、1.0 h、1.5 h 和2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

（4）酶解pH 值的優(yōu)化。稱取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入純水，加入7‰的木瓜蛋白酶，分別調(diào)節(jié)至pH=5、6、7、8 和9，50℃水浴酶解1.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

（5）酶解溫度的優(yōu)化。稱取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入純水，加入7‰的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)至pH=8，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴酶解1.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

（6）酶解料液比的優(yōu)化。稱取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）、1 ∶15（g ∶mL）、1 ∶20（g ∶mL）、1 ∶25（g ∶mL）和1 ∶30（g ∶mL）加入純水，加入7‰的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)至pH=8，40 ℃水浴酶解1.0 h，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水滅活10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定。

1.3.3 山楂多糖酶解提取法的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇影響較大的因素和水平，以酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解pH 值（D）為考察因素，以多糖提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表（表1）。

表1 酶解法正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 山楂多糖水提法的正交試驗(yàn)

由于水提法的影響因素較少，直接進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。以提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為考察因素，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2 水提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.5 多糖含量的測(cè)定

（1）沉淀多糖。準(zhǔn)確吸取樣品液5.0 mL 于離心管中，加入無(wú)水乙醇20 mL，混勻后置于冰箱過(guò)夜。取出樣品于離心機(jī)4 000 r·min-1離心10min，倒出上清液，殘?jiān)?0%乙醇溶液洗滌，再離心10 min，倒出上清液，反復(fù)操作3 次。最后將殘?jiān)盟芙舛ㄈ葜?0 mL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50 mg 于50 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得對(duì)照品母液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品母液0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL 和2.00 mL 于25 mL 比色管中，依次用水補(bǔ)足至2.0mL，加入1.0 mL 苯酚溶液和10 mL 濃硫酸，沸水浴2 min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)設(shè)置485nm 波長(zhǎng)，依次測(cè)定樣品吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

所得線性回歸方程為y=0.005+0.005x，相關(guān)系數(shù)r2=0.997。

（3）樣品測(cè)定。依次吸取各樣品液2.0 mL 按上述方法測(cè)定吸光值，計(jì)算多糖提取率。

（4）結(jié)果計(jì)算。多糖提取率的計(jì)算公式為

式中：X為多糖提取率，%；m1為樣品液中葡萄糖含量，g；V1為樣品液總體積，mL；V2為沉淀多糖所用樣品液體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；0.9為葡萄糖換算為多糖的系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)平行，計(jì)算樣品中多糖含量，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果采用正交設(shè)計(jì)助手專業(yè)版V 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂多糖酶解提取法單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶種類的優(yōu)化

酶種類對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。木瓜蛋白酶的多糖提取率最高，為5.8%，所以選擇木瓜蛋白酶作為提取酶。

圖1 酶種類對(duì)多糖提取率的影響圖

2.1.2 酶用量的優(yōu)化

酶用量對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。隨著酶用量的增加，多糖提取率逐漸升高，當(dāng)酶量超過(guò)7‰時(shí)，增加不明顯，可能是由于酶的用量會(huì)影響酶的水解程度[12]?？紤]到成本，確定最佳酶用量為7‰。

圖2 酶用量對(duì)多糖提取率的影響圖

2.1.3 酶解時(shí)間的優(yōu)化

酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。酶解1.0 h后多糖提取率的變化不明顯，可能是由于1.0 h 時(shí)底物已與酶完全反應(yīng)，所以選擇1.0 h 作為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響圖

2.1.4 酶解pH 值的優(yōu)化

酶解pH 值對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。隨著pH值的升高，多糖提取率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為8 時(shí)，提取率達(dá)到最大值11.5%，但當(dāng)進(jìn)一步提高pH 值時(shí)，提取率明顯下降，說(shuō)明pH 值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制酶的活性。因此，確定最佳pH 值為8。

圖4 酶解pH 值對(duì)多糖提取率的影響圖

2.1.5 酶解溫度的優(yōu)化

酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。隨著酶解溫度的提高，多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，多糖提取率最高，為10.06%；隨著酶解溫度的進(jìn)一步升高，提取率開(kāi)始下降，可能是由于酶在最佳溫度時(shí)活性最高，而高溫則使酶失活。因此，選擇40 ℃作為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響圖

2.1.6 酶解料液比的優(yōu)化

料液比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖6，料液比對(duì)多糖提取率無(wú)明顯影響，為節(jié)約實(shí)際生產(chǎn)成本，確定最佳料液比為1 ∶10（g ∶mL）。

圖6 料液比對(duì)多糖提取率的影響圖

2.2 山楂多糖酶解提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，根據(jù)k值得到酶解法提取山楂多糖的最佳工藝為A1B2C1D3，即酶用量3‰、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間1.0 h、酶解pH=8；根據(jù)多糖提取率最高值得到酶解法提取山楂多糖的最佳工藝為A3B2C1D3，即酶用量7‰、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間1.0 h、酶解pH=8。由表4 可知，酶解時(shí)間（C）與酶解pH（D）對(duì)多糖提取率有顯著影響（P＜0.05），而酶用量和酶解溫度對(duì)多糖提取率無(wú)顯著影響?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本，選定A1B2C1D3為酶解法提取山楂多糖的最佳工藝。

表3 酶解法正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 山楂多糖水提法正交試驗(yàn)結(jié)果

水提法正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)k值得到水提法提取山楂多糖的最佳工藝為A3B3C3，即提取次數(shù)3 次、提取時(shí)間120 min、料液比1 ∶12；根據(jù)多糖提取率最高值得到水提法提取山楂多糖的最佳工藝為A3B3C2，即提取次數(shù)3 次、提取時(shí)間120 min、料液比1 ∶10。由表6 可知，提取次數(shù)（A）對(duì)多糖提取率有顯著影響（P＜0.05），而提取時(shí)間（B）與料液比（C）對(duì)多糖提取率無(wú)顯著影響?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本，選定A3B3C2為水提法提取山楂多糖的最佳工藝。

表5 水提法正交試驗(yàn)結(jié)果表

表6 水提法正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 酶解與水提工藝的對(duì)比

為確定山楂多糖的最終提取工藝，并考慮到試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的誤差以及實(shí)際節(jié)能減排的生產(chǎn)情況，在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選定酶解法最佳工藝和水提法最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，對(duì)比結(jié)果如表7 所示。酶解法提取率高于水提法，酶解工藝優(yōu)于水提工藝，所以選定酶解工藝作為山楂多糖的最終提取工藝。

表7 酶解法與水提法工藝對(duì)比分析表

3 結(jié)論

植物多糖在自然界中廣泛存在，是許多藥物和食品中的功能成分，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種生物學(xué)功能。對(duì)多糖的生物活性研究是當(dāng)前天然成分研究的熱點(diǎn)之一[13]。有關(guān)山楂多糖提取的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，本文對(duì)比了酶解法和水提法對(duì)山楂多糖提取率的影響，得出酶解最佳工藝為酶用量3‰、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間1.0 h、酶解pH=8、料液比1 ∶10、多糖提取率為11.72%；水提最佳工藝為提取次數(shù)3 次、提取時(shí)間120 min、料液比1 ∶10，多糖提取率為9.47%。并通過(guò)對(duì)比得出酶解工藝優(yōu)于水提工藝，此工藝方法簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。