◎ 呂藝揚(yáng)

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

馬蹄，又叫荸薺，在我國多地均有種植。其營養(yǎng)豐富，具有清熱明目、生津止渴、清肺化痰、利腸通便等功效，含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素等[1-2]。馬蹄是廣西產(chǎn)量較高的一種傳統(tǒng)優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品，大多數(shù)企業(yè)將馬蹄加工成“清水馬蹄”罐頭，其余鮮銷馬蹄占馬蹄總產(chǎn)量的80%以上，但存在損壞率高、運(yùn)輸不方便等問題[3]。新鮮的馬蹄在加工過程中會(huì)因機(jī)械傷造成的組織外露而導(dǎo)致褐變[4]，如能研究出一種馬蹄抗性淀粉的生產(chǎn)方法，將極大提升馬蹄的深加工水平，同時(shí)作為馬蹄高值化的一個(gè)方向，將大幅促進(jìn)賀州馬蹄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）具有類似溶解性纖維的性質(zhì)，能夠起到與膳食纖維相似的功效，是膳食纖維很好的替代品，能夠預(yù)防人們由于缺乏膳食纖維而導(dǎo)致的一系列疾病。它的主要生理功能有降血糖血脂、控制體重和抗癌，同時(shí)可改善人體腸道菌群結(jié)構(gòu)[5]。呂明彧等[6]通過建立肥胖小鼠模型對(duì)小鼠進(jìn)行多元復(fù)合抗性淀粉灌胃，發(fā)現(xiàn)多元復(fù)合抗性淀粉可以增強(qiáng)飽腹感使小鼠攝入食物量降低，可達(dá)到減肥降脂的效果。此外，抗性淀粉在棉花糖、巧克力等糖果的制造以及固體飲料的生產(chǎn)、面條的生產(chǎn)、糕點(diǎn)的生產(chǎn)中均有應(yīng)用，可以調(diào)整產(chǎn)品的黏度，具有良好的保水性[7]。

抗性淀粉除了天然存在外，還可以通過對(duì)淀粉進(jìn)行改性得到。根據(jù)其不同的來源和不同的抗酶解性能，可分物理包埋、老化回生和化學(xué)改性幾種淀粉[8-9]。在制備抗性淀粉的方法中，物理方法改性和酶法改性由于所得產(chǎn)品相對(duì)安全[10]，現(xiàn)階段研究人員較多，是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，但物理方法往往會(huì)對(duì)淀粉顆粒結(jié)構(gòu)造成破壞。范會(huì)平等[11]對(duì)比了經(jīng)過蒸制、老化、冷凍等處理后的全粉蒸煮損失率、微觀結(jié)構(gòu)、流變特性以及抗性淀粉含量變化，得出不同處理方法對(duì)全粉影響顯著的結(jié)論。熱處理時(shí)間過長將使抗性淀粉含量大幅降低，且伴隨的壓熱處理等處理方式也會(huì)對(duì)能源產(chǎn)生極大的消耗，給環(huán)境帶來一定的負(fù)擔(dān)。化學(xué)法制備抗性淀粉所需要的溫度較低，無須冷凍處理，相對(duì)節(jié)能、節(jié)時(shí)，具有極大的研究價(jià)值。牛博文等[12]對(duì)比了3 種化學(xué)方法制得的紅薯抗性淀粉的酶解性、溶解性、持水性、膨潤度、透明度、凍融性等指標(biāo)，結(jié)果表明醚化淀粉各方面性質(zhì)為最優(yōu)。羧甲基醚化淀粉是醚化劑與淀粉中糖苷鍵或活性羥基在堿性的淀粉乳液條件下，發(fā)生取代反應(yīng)得到的一種淀粉衍生物。彭麗等[13]以一氯乙酸為醚化劑，對(duì)大米淀粉進(jìn)行改性，成功制得羧甲基醚化大米抗性淀粉，其產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性，各項(xiàng)理化性質(zhì)均較優(yōu)，由此可考慮以一氯乙酸作醚化劑，對(duì)馬蹄抗性淀粉進(jìn)行醚化處理。

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉的工藝參數(shù)，以期為羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉提供理論依據(jù)及生產(chǎn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文所用材料與試劑見表1。

表1 材料與試劑表

1.2 儀器與設(shè)備

本文使用的儀器與設(shè)備見表2。

表2 儀器與設(shè)備表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬蹄抗性淀粉的制備

用與淀粉質(zhì)量比為1.058 ∶1 的氫氧化鈉和85%乙醇配制一定梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的淀粉乳液，移入30 ℃恒溫水浴鍋中加熱堿化60 min，加入一定量的一氯乙酸固體，攪拌均勻，設(shè)置一定的反應(yīng)溫度，醚化一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用鹽酸滴定溶液pH 值至中性，用85%乙醇沖洗4 ～5 次至溶液中無氯離子，抽濾得到白色或淡黃色的固體或粉末，在45 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h 以上，粉碎并過100 目篩，得到羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉與馬蹄淀粉的混合物[14]。

1.3.2 馬蹄抗性淀粉純化

稱量上述方法制得的馬蹄抗性淀粉1 g于離心管中，將pH 值為6 的磷酸鹽緩沖液按1 ∶12.5 的質(zhì)量比加入離心管，振蕩均勻后，加入0.2 mL（20 000 U·mL-1）的耐高溫α-淀粉酶溶液，混勻，將離心管放進(jìn)95 ℃的水浴恒溫振蕩器中水浴2 h，取出后冷卻至室溫，用4 mol·L-1檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 值為4.6 ～4.8，加入1 mL（100 U·mL-1）糖化酶溶液，于60 ℃水浴恒溫振蕩器中水浴1.5 h，取出后冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心5 min，取出后倒去上清液，將沉淀依次用95%、85%、75%的乙醇溶液洗滌4 ～5 次，將沉淀45 ℃干燥烘干24 h 以上，得到羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉[15-16]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）淀粉乳液濃度對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇5%、10%、15%、20%、25%、30% 6 種馬蹄淀粉乳濃度，保持一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比為1∶1（即醚化劑一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質(zhì)量的100%，下同），設(shè)置醚化反應(yīng)條件為溫度40 ℃，醚化反應(yīng)時(shí)間4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（2）醚化劑用量對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比為1 ∶4、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1（即醚化劑一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質(zhì)量的25%、50%、100%、200%、400%）這5 個(gè)不同的醚化劑用量，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，設(shè)置醚化反應(yīng)條件為溫度40 ℃，醚化反應(yīng)時(shí)間4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（3）醚化溫度對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 6 個(gè)不同的醚化溫度，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比為1 ∶1，醚化時(shí)間為4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（4）醚化時(shí)間對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 5 個(gè)不同的醚化時(shí)間，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比為1 ∶1，設(shè)置醚化溫度為40 ℃。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，參考Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，選擇淀粉乳液濃度、一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比、醚化溫度作為研究因素，響應(yīng)值設(shè)置為馬蹄抗性淀粉得率，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)。因素水平及相應(yīng)編碼設(shè)計(jì)情況見表3。

表3 因素水平及編碼表

1.3.5 指標(biāo)測定及表征

（1）馬蹄抗性淀粉得率。單次試驗(yàn)純化得到的羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉質(zhì)量m1與單次試驗(yàn)所用到的馬蹄淀粉質(zhì)量m2的比值即為馬蹄抗性淀粉得率。計(jì)算公式為

（2）感官分析。從醚化后性狀、分離純化后性狀、塊狀物性狀、干燥后產(chǎn)品質(zhì)地幾個(gè)方面對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)過程中及結(jié)束后的產(chǎn)品性狀進(jìn)行比較。

（3）持水性。參考劉云芬等[17]的方法，分別稱取馬蹄抗性淀粉和馬蹄淀粉1 g 溶解于10 mL 去離子水，計(jì)為m3，置于80 ℃水中，進(jìn)行水浴加熱30 min，冷卻到室溫后，13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，稱量離心管和沉淀重量計(jì)為m5[18]；離心管的重量計(jì)為m4。持水性計(jì)算公式為

（4）透明度。參考邵華為等[18]的方法，將樣品配制成1%（m/V）的淀粉乳，沸水浴中加熱攪拌30 min，充分糊化后，冷至室溫，保持原體積。用1 cm比色皿于650 nm 波長下測定糊的透光率，以蒸餾水作為空白。

（5）掃描電鏡。參考彭麗等[13]的方法，將樣品提純后，充分干燥，于掃描電鏡下觀察樣品形態(tài)。

（6）紅外光譜分析。參考相關(guān)研究[19-20]方法，將樣品提純后，充分干燥，將樣品放入研缽中，加入干燥的光譜純KBr 200 mg，混合研磨均勻（在紅外燈下），使其粒度在2.5 μm 以下，裝入壓片模具，抽氣壓片，紅外光譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 淀粉乳液濃度對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖1 可知，當(dāng)馬蹄淀粉乳濃度為15%時(shí)，羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率最高，為38.27%；繼續(xù)增大馬蹄淀粉乳濃度，羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率呈下降趨勢。羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的形成與馬蹄淀粉乳體系的濃度有關(guān)，當(dāng)馬蹄淀粉乳的濃度較低時(shí)，淀粉分子分離程度較大，有序結(jié)晶序列不易形成[21]。當(dāng)馬蹄淀粉乳的濃度較高時(shí)，不利于分子流動(dòng)，亦將影響分子重排列和結(jié)晶[22]；試驗(yàn)中觀察到，濃度過高的馬蹄淀粉乳液難以混勻和分散，導(dǎo)致后期加入一氯乙酸后可能反應(yīng)不完全，致使產(chǎn)品得率降低。

圖1 淀粉乳濃度對(duì)抗性淀粉得率的影響圖

2.1.2 醚化劑用量對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖2 可知，在一氯乙酸與馬蹄淀粉的質(zhì)量比為1 ∶1（即一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質(zhì)量的100%）時(shí)，馬蹄抗性淀粉得率達(dá)到最高，為57.89%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。該試驗(yàn)結(jié)果說明，醚化劑用量并非越多越好，足量的醚化劑能使淀粉得到充分的反應(yīng)，提高馬蹄抗性淀粉的得率；而過量的一氯乙酸則無法繼續(xù)提高馬蹄抗性淀粉的得率，且會(huì)導(dǎo)致淀粉乳液整體偏酸性。羧甲基醚化淀粉是由淀粉與氯乙酸在堿性條件下發(fā)生雙分子親核取代反應(yīng)制得，故酸性的乳液條件將不利于反應(yīng)進(jìn)行[23-25]。

圖2 醚化劑用量對(duì)抗性淀粉得率的影響圖

2.1.3 醚化溫度對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖3 可知，在醚化溫度為40 ℃時(shí)，馬蹄抗性淀粉得率最高，為62.38%；繼續(xù)升高醚化溫度，馬蹄抗性淀粉得率基本呈下降趨勢。原因是醚化溫度如果過低，分子運(yùn)動(dòng)較慢，反應(yīng)速度較慢，影響抗性淀粉的形成；醚化溫度過高，溶液會(huì)形成膠黏結(jié)構(gòu)，溫度越高，膠黏越明顯，越接近固態(tài)，不利于分子運(yùn)動(dòng)，不利于反應(yīng)進(jìn)行。此外，隨醚化溫度的升高，水分揮發(fā)流失較多，淀粉乳液濃度增大，也會(huì)使溶液越發(fā)黏稠。同時(shí)，副反應(yīng)的發(fā)生亦不利于馬蹄抗性淀粉的形成[26-29]。

圖3 醚化溫度對(duì)抗性淀粉得率的影響圖

2.1.4 醚化時(shí)間對(duì)馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖4 可知，醚化時(shí)間為2 h 時(shí)馬蹄抗性淀粉得率最高，為64.02%。初步判斷醚化1 h 時(shí)反應(yīng)不充分，故馬蹄抗性淀粉得率較低。從整體上看，隨時(shí)間的延長，馬蹄抗性淀粉得率逐漸上升；但時(shí)間過長可能會(huì)使部分馬蹄抗性淀粉遭到破壞，出現(xiàn)大分子降解等，導(dǎo)致馬蹄抗性淀粉得率有所下降[30]。由于醚化時(shí)間的單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)呈波浪形，無法看出規(guī)律，而造成數(shù)據(jù)波動(dòng)的原因亦尚未確定，無法判斷最優(yōu)，故不作為響應(yīng)面優(yōu)化中的自變量。

圖4 醚化時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響圖

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4 所示。因素（A、B、C）和響應(yīng)值（Y）之間的多元二次回歸方程為

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

由表5 可知，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的整體模型差異顯著（P＜0.01），制備馬蹄抗性淀粉的條件可預(yù)測得到。失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.347 9 ＞0.05），表明二次回歸模型與實(shí)際情況吻合良好，可靠性高，回歸方程的擬合度較高。試驗(yàn)考察的3 個(gè)因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系，它們的相互改變對(duì)羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的收率影響較大。A、B、C3 個(gè)因素對(duì)羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率的影響主次順序?yàn)锽＞C＞A，即醚化劑用量＞醚化溫度＞淀粉乳液濃度。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表

2.2.2 最佳工藝參數(shù)確定與驗(yàn)證

采用Desigin-Expert 8.06 軟件進(jìn)行分析，得出羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的最佳制備工藝條件為馬蹄淀粉乳濃度12.26%，醚化劑用量117.92%（即一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質(zhì)量的117.92%），醚化溫度43.35 ℃，預(yù)測的最大得率為76.02%。為方便試驗(yàn)的開展，將所得試驗(yàn)參數(shù)調(diào)整為馬蹄淀粉乳濃度12%，醚化劑用量120%，醚化溫度43 ℃，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，取平均值，測得羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的得率為75.85%，基本接近預(yù)測值76.02%，模型與實(shí)際情況擬合度較好，表明工藝設(shè)計(jì)可靠性較高，有效地對(duì)制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3 感官分析

如表6 所示，醚化溫度為50 ℃的試驗(yàn)組在醚化完成后均呈較硬的質(zhì)地（試驗(yàn)號(hào)2、5、10、11）；一氯乙酸用量150%的試驗(yàn)組制得的抗性淀粉在分離純化后大多呈絮狀（試驗(yàn)號(hào)6、9、11、14），一氯乙酸用量50%的試驗(yàn)組醚化后多成沙狀，未形成膠黏結(jié)構(gòu)，幾乎無抗性淀粉生成，或制得量較低（試驗(yàn)號(hào)1、10、12、15），產(chǎn)品性狀的差異可能是造成羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率差異的因素之一。用羧甲基醚化法制得的馬蹄抗性淀粉產(chǎn)品均為膠質(zhì)，緊緊貼合于干燥時(shí)所用的容器上，持水性較好，干燥時(shí)間長。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)過程中產(chǎn)品性狀比較表

2.4 理化指標(biāo)測定與表征分析

2.4.1 持水性、透明度測定

由表7 可知，上述最優(yōu)工藝下制得的羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的持水性優(yōu)于原馬蹄淀粉，可能是因?yàn)轸燃谆鸦矸垡肓擞H水性的羧甲基基團(tuán)[31]。馬蹄抗性淀粉的透明度也優(yōu)于原馬蹄淀粉，這是因?yàn)橛H水基團(tuán)的引入會(huì)阻礙分子締合而減弱光的反射與折射；分子膨脹亦會(huì)使淀粉分子體積增大，使光的透過率有所提高[32]。

表7 原淀粉與馬蹄抗性淀粉持水性、透明度比較表

2.4.2 掃描電鏡分析

從圖5可以看出，原馬蹄淀粉顆粒較小，多為圓形，呈規(guī)律的顆粒狀，表面光滑；羧甲基醚化淀粉形貌遭到破壞，分子表面有些許凹陷和裂痕，顆粒較大，形狀不規(guī)則且存在粘連，顆粒表面有大量細(xì)小顆粒附著。由此可知，羧甲基醚化法會(huì)對(duì)淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)造成破壞和腐蝕，小顆粒的成分可能是被破壞后的淀粉小顆粒和一氯乙酸、氫氧化鈉顆粒[12]。

圖5 原淀粉與醚化淀粉形態(tài)觀察圖

2.4.3 紅外光譜分析

本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14]選取4 000 ～1 000 cm-1圖譜進(jìn)行分析。由圖6 可知，原馬蹄淀粉在3 356 cm-1出現(xiàn)的峰是締合-OH 的伸縮振動(dòng)峰，在2 931 cm-1出現(xiàn)的峰是C-H 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 650 cm-1出現(xiàn)淀粉所吸收水分子的2個(gè)-OH剪切形成的吸收峰，在1 158 cm-1出現(xiàn)C-O-C 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 018 cm-1出現(xiàn)C-(OH)對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，在929 cm-1、861 cm-1、764 cm-1、577 cm-1出現(xiàn)的峰是糖環(huán)伸縮振動(dòng)吸收峰[33]。與原馬蹄淀粉圖譜相比，羧甲基醚化淀粉在1 590 cm-1、1 413 cm-1和1 320 cm-1出現(xiàn)明顯的吸收峰，為羧酸鹽-COO-的對(duì)稱和非對(duì)稱的收縮振動(dòng)峰，可以證明原馬蹄淀粉中的-OH 已被羧甲基取代，羧基已經(jīng)接入馬蹄淀粉的分子鏈中[14,30]。

圖6 原淀粉與醚化淀粉紅外圖譜

3 結(jié)論

本文以馬蹄淀粉為原料，采用羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)中，馬蹄淀粉乳濃度、醚化劑用量和醚化溫度對(duì)羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率均存在明顯影響，而醚化時(shí)間的影響趨勢呈波浪形，綜合考慮后，選擇馬蹄淀粉乳濃度、醚化劑用量、醚化溫度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。最終得到的最佳工藝條件為馬蹄淀粉乳濃度12.26%，醚化劑用量117.92%，醚化溫度43.35 ℃。為方便實(shí)驗(yàn)開展，調(diào)整馬蹄淀粉乳濃度為12%，醚化劑用量為120%，醚化溫度為43 ℃，該工藝下馬蹄抗性淀粉得率為75.85%，與預(yù)測值76.02%接近，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。羧甲基醚化法制得的馬蹄抗性淀粉質(zhì)地膠黏、持水度高、工藝簡單，且得率較高，生產(chǎn)成本較低，制得產(chǎn)品可用作增稠劑、涂膜劑等，用途廣泛。