◎ 羅亞惠，宿珠琳，馬永生，鄒 建

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000）

柚子，又名文旦、氣柑，蕓香科柑橘屬植物，具有清肺、健胃、促進(jìn)消化等功效[1]，還富含維生素、礦物質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)素。柚子皮占柚子鮮重的20%～50%[2]，是柚子的重要副產(chǎn)物，富含多酚、多糖、黃酮和果膠等天然活性成分[3]，其中多酚類化合物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]以及殺菌抗炎[7-9]等功效，在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。我國(guó)柚子栽培歷史悠久，產(chǎn)量豐富，年產(chǎn)量約500 萬(wàn)t[11]，除去鮮食果肉外，大量柚子皮被丟棄，不僅污染環(huán)境，還造成了天然資源的浪費(fèi)。

本文以柚子皮為原料，通過(guò)超聲輔助法提取柚子皮中的多酚，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為柚子皮的綜合利用及開發(fā)提供思路，以期減少天然多酚資源的浪費(fèi)與環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

柚子：產(chǎn)自福建漳州的琯溪蜜柚，形態(tài)良好，無(wú)病蟲害；福林酚試劑、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、碳酸鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)JW-2018H，安徽嘉文儀器裝備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-1500，上海美析儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140 型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；智能靜音超聲清洗機(jī)XM-700UVF，小美超聲儀器有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)FW177 型，上海本亭儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-4，國(guó)華（常州）儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚子皮樣品處理

將新鮮、無(wú)腐壞的柚子皮清洗干凈，置于30 ℃烘箱中烘干，隨后用萬(wàn)能粉碎機(jī)將烘干的柚子皮粉碎后過(guò)篩，密封避光保存?zhèn)溆茫? ℃）。

1.3.2 柚子皮中多酚的提取

稱取柚子皮粉末0.500 g 于錐形瓶中，加入10 mL、60%的乙醇溶液，搖勻后超聲處理，之后將溶液4 000 r·min-1離心處理10 min，將上清液置于燒杯中，剩余沉淀用10 mL、60%的乙醇溶液重復(fù)提取2 次，將離心后的所有上清液合并，低溫避光儲(chǔ)存。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定

分別配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取100 μL 不同濃度的沒(méi)食子酸溶液，加入0.5 mL 福林酚試劑和2 mL 15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至50 mL，于40 ℃水浴反應(yīng)20 min，在765 nm 處測(cè)定吸光值[12]。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.134 2x-0.035 8，R2=0.998 9。

取稀釋后的樣品溶液50 μL 與50 μL 福林酚試劑混合、搖勻，再加入800 μL 蒸餾水，混勻后室溫下放置5 min，將800 μL 7.5% Na2CO3溶液添加到混合液中，混合均勻，于黑暗處室溫反應(yīng)1 h，在765 nm 處測(cè)量吸光度值，通過(guò)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。利用公式（1）計(jì)算柚子皮多酚提取量。

柚子多酚提取量=(C×X×V)/M×100%

（1）

式中：C為柚子多酚質(zhì)量濃度，mg·mL-1；X為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以多酚提取量為考察指標(biāo)，按照1.3.2 多酚提取方法，基礎(chǔ)控制量為料液比1 ∶20（g ∶mL）、乙醇濃度60%、提取時(shí)間30 min、提取溫度35 ℃、超聲功率420 W。分別研究提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min 和60 min）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%和80%）、提取溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60，g ∶mL）及超聲功率（420 W、490 W、560 W、630 W 和700 W）對(duì)柚子皮多酚提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design Expert 13.0 軟件，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并分析結(jié)果得出最佳提取工藝，因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平設(shè)計(jì)表

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并取平均值。采用Office 2017及SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用Design Expert 13.0 進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間的篩選

由圖1 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，柚子皮中多酚提取量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。提取時(shí)間為30 min時(shí)，柚子皮多酚的提取量最高，為3.37 mg·g-1，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，柚子皮多酚提取量降低。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)短，柚子皮中多酚不能充分被提出，提取量較低；而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)造成多酚的氧化與破壞，繼而影響其提取量[13-14]。故本文將提取時(shí)間確定為30 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.2 提取溫度的篩選

由圖2 可知，提取溫度在25 ～40 ℃時(shí)，柚子皮多酚提取量隨溫度升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。在40 ℃時(shí)，提取量最高，達(dá)到2.82 mg·g-1，這可能是由于溫度的上升加快了分子的運(yùn)動(dòng)速率，軟化了柚子皮細(xì)胞內(nèi)組織，導(dǎo)致柚子細(xì)胞的細(xì)胞壁急劇破壞，加速了多酚物質(zhì)的析出。當(dāng)提取溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，隨著溫度上升提取量下降，這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)發(fā)生部分氧化，多酚提取量下降[14]。故提取溫度確定為40 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.3 料液比的篩選

由圖3 可知，料液比為1 ∶50 時(shí)，柚子皮多酚的提取量最高，為3.41 mg·g-1。繼續(xù)增大提取液用量，柚子皮多酚的提取量降低，可能是由于此時(shí)乙醇對(duì)多酚的提取量已經(jīng)達(dá)到了飽和，多酚不再溶出。故料液比確定為1 ∶50（g ∶mL）。

圖3 料液比對(duì)柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.4 乙醇濃度的篩選

由圖4 可知，乙醇濃度在40%～80%時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，多酚提取量先升高后降低后又升高。當(dāng)乙醇濃度在60%時(shí)多酚提取量最大（2.18 mg·g-1）；繼續(xù)增大乙醇濃度至70%，多酚提取量逐漸降低。這可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^(guò)高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而阻礙了酚類物質(zhì)的溶出[15]。乙醇濃度為60%和80%時(shí)，多酚提取量并無(wú)明顯差異，為節(jié)約提取成本，將乙醇濃度確定為60%。

圖4 乙醇濃度對(duì)柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.5 提取功率的篩選

由圖5 可知，超聲功率在420 ～560 W 時(shí)，柚子皮多酚的提取量呈先降低后升高的趨勢(shì)，在560 W 時(shí)達(dá)到最高，為2.49 mg·g-1，但與該范圍其他功率下的提取量無(wú)明顯差異。超聲功率超過(guò)560 W，隨著功率的增大，柚子多酚的提取量逐漸下降。這可能是超聲功率的增大，破壞了酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量下降[16]。故超聲功率確定為560 W。

圖5 超聲功率對(duì)柚子皮多酚提取量的影響圖

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取柚子皮多酚的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。利用Design Expert 13.0 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到實(shí)驗(yàn)條件與響應(yīng)值之間的回歸模型方程式為

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

對(duì)表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。回歸模型中P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05 不顯著，表示未知因素對(duì)結(jié)果影響?。籖2=0.989 6，，說(shuō)明該模型擬合性良好，可以用作超聲提取柚子皮多酚的工藝優(yōu)化[17-18]?；貧w方程的一次項(xiàng)B和二次項(xiàng)A2、C2都達(dá)到極顯著水平，且提取時(shí)間A、料液比B、提取溫度C3 個(gè)因素對(duì)柚子皮多酚提取量的影響大小為B＞C＞A。此外，提取時(shí)間和料液比（AB）、提取時(shí)間和提取溫度（AC）的交互作用對(duì)多酚提取率也有顯著影響。

表3 回歸模型的方差分析表

2.2.2 不同因素間交互作用的響應(yīng)面分析

二維等高線圖的形狀和密集程度及三維響應(yīng)面圖的陡峭程度可以判斷不同因素間的交互作用，等高線趨于橢圓、越密集代表兩個(gè)因素的交互作用越明顯，反之，則表示兩個(gè)因素之間的交互作用不明顯[19-20]。

圖6 ～圖8為各因素的交互情況?？梢钥闯?，料液比和提取時(shí)間（AB）、溫度和提取時(shí)間（AC）的等高線較密集，并呈橢圓，響應(yīng)面坡度較陡，說(shuō)明AB、AC兩兩的交互作用對(duì)多酚提取量的影響較大。而料液比和提取溫度（BC）的等高線較稀疏，說(shuō)明BC交互作用對(duì)多酚提取量的影響不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 提取時(shí)間和料液比交互作用圖

圖7 提取時(shí)間和提取溫度交互作用圖

圖8 提取溫度和料液比交互作用圖

2.2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

利用DesignExpert 13.0 軟件，通過(guò)響應(yīng)面分析及預(yù)測(cè)，得到超聲提取柚子皮多酚的最佳工藝條件為提取時(shí)間32.83 min、料液比1 ∶54.86（g ∶mL）、提取溫度39.53 ℃，在此條件下柚子皮多酚提取量的預(yù)測(cè)值為7.655 mg·g-1。為驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，本文結(jié)合實(shí)際將實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整為提取時(shí)間33 min、料液比1 ∶55（g ∶mL）、提取溫度40 ℃，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，得到的柚子皮多酚提取量為7.589 mg·g-1，RSD為0.61%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明此模型可靠，可以用來(lái)預(yù)測(cè)柚子皮多酚的提取量。

3 結(jié)論

本文以超聲輔助提取法為基礎(chǔ)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化法確定了柚子皮多酚的最佳提取工藝。優(yōu)化得到柚子皮多酚最佳提取工藝為提取時(shí)間33 min、提取溫度40 ℃、料液比1 ∶55（g ∶mL）、乙醇濃度60%、提取功率560 W。在此工藝下，柚子皮多酚提取量為7.589 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)值基本一致。