◎ 朱永樂(lè)，宋貴梅，喬榮更，湛劍龍，趙大洲，吳瓊琳

（廈門元之道生物科技有限公司，福建 廈門 361100）

γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA），又名氨酪酸[1]，為非蛋白質(zhì)的天然氨基酸，常由生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化而得[2]。GABA 作為一種活性氨基酸，具有促進(jìn)機(jī)體葡萄糖代謝、降血壓、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、預(yù)防或治療癲癇，改善肝臟、腎臟功能等多種作用[3-6]。目前GABA 已廣泛應(yīng)用于食品、保健品中，含GABA的主要產(chǎn)品有飲料、膠囊、壓片糖果以及軟糖等。

γ-氨基丁酸在天然物質(zhì)中含量較低，無(wú)法滿足工業(yè)上的需求[5-6]。目前獲得γ-氨基丁酸的主要方法有植物富集法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法，與其他兩種方法相比，微生物發(fā)酵法具有專一性強(qiáng)、生產(chǎn)周期短、環(huán)保、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[7-10]。植物乳植桿菌為可食用菌種，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的主要菌種之一，在開(kāi)發(fā)健康安全的GABA 功能性食品領(lǐng)域中具有重要意義[11]。然而，在發(fā)酵過(guò)程中，γ-氨基丁酸產(chǎn)量受多種因素的影響，不同來(lái)源的乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力也各有差異。

本課題在前期工作中分離篩選得到植物乳植桿菌BXM2，以該菌株為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以γ-氨基丁酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)菌株耐膽鹽、耐酸的特性進(jìn)行研究，以期為后續(xù)研究菌株BXM2 功能及應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳植桿菌BXM2（Lactiplantibacillus plantarumBXM2）： 中國(guó)微生物菌種保藏中心（CGMCC NO.16436）；甲醇、乙腈、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；鄰苯二醛、四氫呋喃、巰基乙醇：阿拉丁試劑（上海）有限公司；三乙胺：西亞試劑；γ-氨基丁酸標(biāo)品：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；豬膽鹽：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化

從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌株植物乳植桿菌BXM2，于MRS 液體培養(yǎng)基中活化至二代，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，培養(yǎng)條件為厭氧培養(yǎng)，備用。

1.3.2 菌株耐受性分析

（1）耐酸實(shí)驗(yàn)。用稀鹽酸將配制好的MRS 液體培養(yǎng)基的pH 值調(diào)節(jié)至1.5、2.5、3.5，于121 ℃滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，將培養(yǎng)至二代的菌液以3%（體積分?jǐn)?shù)）接種至培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，并測(cè)定發(fā)酵2 h 的活菌數(shù)。

（2）耐膽鹽實(shí)驗(yàn)。向MRS 液體培養(yǎng)基中添加0.03%、0.30%、0.50%的膽鹽于121 ℃下滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻后向其加入3%的二代菌液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵2 h 的活菌數(shù)。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

以5%的菌株接種量向MRS 培養(yǎng)基中接入活化至二代的菌液，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液離心（5 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液并測(cè)定γ-氨基丁酸含量。

（1）單因素實(shí)驗(yàn)。按1%、3%、5%、7%和9%（體積分?jǐn)?shù)）接入二代活化菌液，其余條件固定，測(cè)定培養(yǎng)基上清液γ-氨基丁酸含量；調(diào)整發(fā)酵時(shí)間為20 h、24 h、28 h、32 h 和36 h，其他條件固定，測(cè)定γ-氨基丁酸含量；調(diào)整發(fā)酵溫度為27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃和45 ℃，其他條件固定，測(cè)定γ-氨基丁酸含量。

（2）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以γ-氨基丁酸含量為響應(yīng)值，使用Design Expert 10 對(duì)其進(jìn)行分析，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)表

1.3.4 γ-氨基丁酸含量測(cè)定

本文采用高效液相色譜法測(cè)定γ-氨基丁酸含量，檢測(cè)器為紫外分光光度檢測(cè)器，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

（1）色譜條件。色譜柱：C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A：8 g·L-1結(jié)晶乙酸鈉+三乙胺+四氫呋喃（pH 值為7.2±0.02）；流動(dòng)相B：8 g·L-1結(jié)晶乙酸鈉∶乙腈∶甲醇=1 ∶2 ∶2（體積比）（pH 值為7.2)；檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1。梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 洗脫程序表

（2）試劑及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。衍生試劑：0.1 g鄰苯二醛（OPA）+1 mL 乙腈+13 μL 巰基乙醇，用0.4 mol·L-1硼酸緩沖液定容至10 mL。氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)QB/T 4587—2013 方法有所調(diào)整，將標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為12 μg·mL-1、22 μg·mL-1、42 μg·mL-1和58 μg·mL-1的系列溶液，添加等體積的衍生試劑，衍生2 min，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為y=12 034.4x，R2=0.999 6。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2021 處理數(shù)據(jù)，采用Origin 2018 作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；通過(guò)SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），Duncan 法進(jìn)行顯著性差異分析（n=3）；由Design Expert 10 設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

益生菌進(jìn)入人體胃腸道后可發(fā)揮本身的益生功能，但是乳酸菌的存活力會(huì)受到胃酸及膽鹽的影響，因此對(duì)乳酸菌消化環(huán)境的耐受力篩選至關(guān)重要。體外消化模擬環(huán)境可為益生菌的定植能力提供理論依據(jù)[12]。研究表明，人體胃環(huán)境的pH 值一般在1.3 ～2.0，食物排空時(shí)間一般為1 ～2 h[13-14]。因此本實(shí)驗(yàn)選取pH 值為1.5、2.5、3.5，消化時(shí)間為2 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖1（a）所示，發(fā)酵原液中活菌數(shù)與各pH 條件下消化2 h 的活菌數(shù)有顯著差異（P＜0.05）；pH 值為1.5、2.5、3.5 的條件下，活菌數(shù)由原液中的9.2×108CFU·mL-1分別降至1.1×105CFU·mL-1、1.2×105CFU·mL-1、6×106CFU·mL-1。

圖1 菌株BXM2 在不同pH、不同濃度膽鹽條件下的活菌數(shù)變化圖注：不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）。下同。

據(jù)報(bào)道，膽鹽對(duì)乳酸菌的耐受性有一定影響，而人體膽汁中含有大量的膽鹽[15]。從圖1（b）中可以看出，BXM2 植物乳植桿菌對(duì)膽鹽的耐受性與膽鹽添加量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。膽鹽濃度為0.50%、消化2 h 時(shí)，BXM2 植物乳植桿菌活菌數(shù)為9.8×105CFU·mL-1。

綜上，BXM2 植物乳植桿菌在膽鹽和酸性環(huán)境下均有一定耐受能力，能在發(fā)酵液中存活，有利于在腸道中定植，發(fā)揮益生功效。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間

從圖2 可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，γ-氨基丁酸含量整體上呈先增大后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間為32 h時(shí)，γ-氨基丁酸含量達(dá)到最大值，為（153.55±8.76）μg·g-1；繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，γ-氨基丁酸含量顯著降低（P＜0.05），可能是由于發(fā)酵體系中菌種為滿足自身營(yíng)養(yǎng)需求充分利用了代謝產(chǎn)物[16]。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ- 氨基丁酸含量的影響圖

2.2.2 發(fā)酵溫度

如圖3 所示，隨著溫度的升高，γ-氨基丁酸含量先增大后顯著減?。≒＜0.05），可能是溫度的升高有利于乳酸菌生長(zhǎng)和谷氨酸脫羧酶的產(chǎn)生[17]。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，γ-氨基丁酸的產(chǎn)量最大，其含量為（359.64±19.77）μg·g-1；當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)其含量顯著降低（P＜0.05），可能是溫度過(guò)高，影響了菌株的生長(zhǎng)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響圖

2.2.3 接種量

如圖4 所示，隨著菌株接種量的增加，γ-氨基丁酸的含量先增大后減小。當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)率降低；當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，會(huì)過(guò)早消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而消耗菌株生長(zhǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)生的γ-氨基丁酸[18]；當(dāng)菌株接種量為3%時(shí)，γ-氨基丁酸含量達(dá)到最大值，為（308.23±8.12）μg·g-1。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，以γ-氨基丁酸含量（Y）為響應(yīng)值，結(jié)合Box-Behnken 對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，多元回歸分析結(jié)果見(jiàn)表4?；貧w方程為Y=481.26+1.98A-0.25B+15.81C+18.01AB+13.43AC-1.05BC-70.63A2-53.29B2-24.83C2。方程模型顯著，P＜0.05；失擬項(xiàng)R=0.637 2 ＞0.5，不顯著。通過(guò)以上分析可以得出該模型可應(yīng)用于預(yù)測(cè)植物乳植桿菌BXM2 最佳發(fā)酵條件下γ-氨基丁酸含量。從表4 可以得出，對(duì)BXM2 產(chǎn)γ-氨基丁酸含量影響的順序?yàn)榻臃N量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度。其中發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度二次項(xiàng)對(duì)γ-氨基丁酸含量有極顯著影響，P＜0.01。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表4 回歸方程分析表

各因素對(duì)γ-氨基丁酸含量的交互影響見(jiàn)圖5 ～圖7。響應(yīng)面曲線越陡峭，影響越明顯，因素間交互作用越顯著；等高線越趨近于橢圓形[19]，則說(shuō)明兩因素間的影響越顯著。由此可知，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互作用與其他兩組交互作用相比影響更加明顯，與方差分析中結(jié)果一致。

圖5 AB 交互作用圖

圖6 AC 交互作用圖

圖7 BC 交互作用圖

經(jīng)模型擬合得到的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為發(fā)酵時(shí)間32.18 h、發(fā)酵溫度37.010 ℃、接種量3.66%，預(yù)測(cè)γ-氨基丁酸最含量為483.924 μg·g-1?？紤]實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在誤差，將發(fā)酵條件調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間32.2 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.7%，該條件下的γ-氨基丁酸含量為479.23 μg·g-1，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值相比誤差率為0.969%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論預(yù)測(cè)相差不大，由此說(shuō)明該模型具有可靠性。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)BXM2 發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間32.2 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3.7%，該條件下γ-氨基丁酸的含量為479.23 μg·g-1。通過(guò)測(cè)定BXM2 在不同pH 值、不同膽鹽濃度下的活菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)BXM2 具有良好的耐受力，有利于在腸道中定植，發(fā)揮益生功效，可選作優(yōu)秀菌株進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)。