王耀梅，楊博璇，趙彥玲

（西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000）

牦牛被稱為“高原之舟”，是西藏特有的動物品種，促進著當?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有1 600余萬頭牦牛[2]，是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種類群最多的國家。娘亞牦牛是西藏自治區(qū)嘉黎縣的優(yōu)良牦牛品種，體型大、毛發(fā)多，其肉質(zhì)富含多種礦物質(zhì)、氨基酸和蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價值高。近年來，牦牛獨特的遺傳資源已成為研究熱點。血液生理生化指標可以快速客觀地反映牦牛機體的代謝水平和生理健康狀況，是判斷牦牛飼養(yǎng)管理水平的重要依據(jù)。大多數(shù)基因組生物的標記物是從侵入性程序里獲得的組織中鑒定，如肝臟、乳腺、腎臟等。但在臨床試驗或臨床篩選中，采取組織活檢往往是不現(xiàn)實的。因此，通過采用相對較易獲得的、具有代表性的一些組織，如血液、尿液、唾液等相關(guān)的分子標記。這意味著血液有利于對生物機制進行系統(tǒng)分析，逐步成為普遍使用的生物研究系統(tǒng)[3]。但還未見娘亞牦牛的相關(guān)報道，因此，本研究選取精液品質(zhì)有顯著差異的娘亞公牦牛為試驗對象，研究相關(guān)基因在娘亞牦牛血液中的表達差異，旨在為娘亞牦牛的分子育種、早期選育和開發(fā)血液DNA標志物的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗對象為飼養(yǎng)在拉薩市當雄縣當雄牦牛凍精站的健康成年娘亞公牦牛。

1.2 試驗材料

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PBS溶液、Trans Start Eco Green qPCR SuperMix試劑盒、2×PCR Mix。

1.3 試驗設計

用假陰道法采集精液，采精后立即進行精液品質(zhì)檢測，根據(jù)檢測結(jié)果（表1）選取精液品質(zhì)有顯著差異的娘亞公牦牛，分為高品質(zhì)組（3頭）和低品質(zhì)組（3頭）。分別采集2組娘亞牦牛頸靜脈全血各1份，將采集到的血液樣本置于-80 ℃冰箱備用。

表1 娘亞牦牛精液品質(zhì)分析

1.4 試驗方法

1.4.1 引物設計與合成 研究表明，GAPDH是哺乳動物中最好的管家基因之一[4]，用于研究多種哺乳動物的基因表達。本試驗選擇GAPDH基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中牦牛HSPB1、PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1和GAPDH基因的mRNA序列，應用Primer Premier 5.0軟件進行熒光定量PCR的引物設計，南京擎科生物技術(shù)有限公司合成引物序列，引物信息詳見表2。

表2 引物信息

1.4.2 實時熒光定量檢測 采用Trizol方法提取血液樣品的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行實時熒光定量PCR檢測。先對cDNA樣品進行5倍梯度稀釋，再對基因進行標準曲線擴增。PCR擴增體系（20 μL）：cDNA模板1 μL，2×TransStart Eco Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴增程序：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，激活熒光信號；95 ℃預變性10 min；95℃變性20 s，56 ℃退火20s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；95 ℃、60 ℃、95 ℃各15 s做熔解曲線。每個樣品重復3次，最后采用2-△△CT方法計算目的基因相對表達量。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析數(shù)據(jù)，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。使用Sigmaplot 10.0軟件對試驗結(jié)果進行柱狀圖制作。

2 結(jié)果

通過對高品質(zhì)組、低品質(zhì)組娘亞公牦牛全血中6個精液品質(zhì)相關(guān)基因的實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)這6個目的基因及內(nèi)參基因（GAPDH）的擴增曲線均能依次起跳，熔解曲線為單一峰，可見沒有特異性擴增，且擴增效率在90%以上，符合試驗質(zhì)量控制要求，可以用2-△△CT方法計算基因相對表達量。

如圖1所示，HSPB1基因在高品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的mRNA表達量顯著低于低品質(zhì)組，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1這5個基因在高品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的表達量顯著高于低品質(zhì)組。

注：H代表高品質(zhì)組，L代表低品質(zhì)組，*表示差異顯著（P＜0.05）。圖1 精液品質(zhì)相關(guān)基因在高、低品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的mRNA表達

3 討論

血液能把分散在全身的組織調(diào)節(jié)連接起來，有研究表明，在一些組織中會表達的基因，有80%的可能性會在血細胞中表達[5]，因此血液具備更直接、更全面的代表各個性能特征的潛力。

HSPB1蛋白又稱HSP27（或HSP25）[6]，目前有大量研究證實，HSPB1在細胞的氧化應激損傷方面發(fā)揮著一定保護作用[7-8]。HSPB1可以通過增加谷胱甘肽還原酶的活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶使谷胱甘肽保持還原狀態(tài)，從而減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生[9]。機體在低氧刺激下會出現(xiàn)血管增生等生理反應，以此增加血液氧氣運輸能力，而HSPB1對血管生成平衡具有重要調(diào)控作用[10]，以上研究提示，HSPB1在調(diào)控氧化應激水平中具有重要作用。PSMC5是泛素化蛋白識別和蛋白酶體轉(zhuǎn)移的調(diào)控成分之一[11]。除了調(diào)節(jié)蛋白酶體功能外，越來越多的證據(jù)表明PSMC5通過與轉(zhuǎn)錄活性啟動子的相互作用和共激活子的招募直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。如有研究者發(fā)現(xiàn)在腺病毒感染過程中，PSMC5可以被招募到病毒轉(zhuǎn)錄因子E1A中，并能增強下游靶點的轉(zhuǎn)錄[13]。PSMC5可能與p53轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，并以一種與p53招募相關(guān)的方式被招募到p53響應性p21啟動子中。然而，PSMC5在腫瘤尤其是CRC中的作用和功能尚未得到充分研究，而在本研究中，娘亞牦牛精子中PSMC5主要參與蛋白質(zhì)的分解代謝過程，對其精液品質(zhì)有一定影響，在血液中表達量不顯著且關(guān)于這一方面的研究報道也少有研究。PSMB3是蛋白酶體20S核心微粒的重要組成部分，被發(fā)現(xiàn)與癌癥有關(guān)，目前在牦牛中的相關(guān)研究較少。Blijlevens[14]等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體β3亞基在非小細胞肺癌的臨床樣品中過表達。李天然[15]的研究表明，PSMB3基因在雌性橘小實蠅性成熟時卵巢組織表達較高，利用RNAi沉默PSMB3之后，卵巢發(fā)育受阻導致繁殖力下降。Yi等[16]發(fā)現(xiàn)，由于免疫阻斷PSMD8亞基可增加豬受精過程中的多精分化率，因此19S復合物的活性可能是豬受精過程中抗多精分化防御的速率限制因子。PSMD8亞基的確切功能尚不清楚。除了多泛素鏈識別，PSMD8可能通過與蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶相互作用參與底物去泛素化[17]或與具有去泛素化活性的19S非atpase亞基PSMD14相互作用。抑制去泛素化實際上可以通過促進底物蛋白質(zhì)和共價連接的泛素標簽的整體降解來增加蛋白酶體蛋白水解的速率[18-19]。Mitsuhiro等[20]的研究表明，PSMD8的部分缺失可以損害蛋白酶體的功能。因此，PSMD8是影響精子受精過程中的一個重要蛋白，但在本研究中PSMD8在血液中的表達量不顯著，且關(guān)于這方面的研究報道也少有研究。UGP2是核苷酸糖代謝中必不可少的八聚體酶[21]。Perenthaler等[22]的研究表明，UGP2蛋白較短亞型的缺失，可以導致神經(jīng)干細胞中功能性UGP酶減少，從而使糖原代謝改變、未折疊蛋白反應上調(diào)以及神經(jīng)元過早分化。UGP2產(chǎn)物UDP-Glc是糖綴合物生物合成和半乳糖代謝所必需的，所以UGP2在細胞中占有核心地位[23]。有研究者[24]證明UGP2在腫瘤生長及其調(diào)控細胞代謝過程中起關(guān)鍵作用。而本研究中發(fā)現(xiàn)UGP2在高品質(zhì)組的血液中表達量上調(diào)但不顯著，主要參與代謝過程，可能通過代謝過程影響精子活力，對牦牛精子的繁殖繁育能力產(chǎn)生一定影響。HSP90AA1基因定位于染色體14q32.2，編碼熱休克蛋白90a(HSP90a)[25]。HSP90AA1參與其客戶蛋白的操作、折疊、組裝和降解，對其內(nèi)部平衡至關(guān)重要，更重要的是許多HSP90AA1的客戶蛋白參與腫瘤發(fā)病過程，因此HSP90AA1在調(diào)節(jié)癌細胞的生長和生存中發(fā)揮著重要作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP90AA1表達水平在高品質(zhì)組顯著高于低品質(zhì)組。

4 結(jié)論

本研究條件下，HSPB1基因在高品質(zhì)組精液娘亞公牦牛血液中的mRNA表達量顯著低于低品質(zhì)組，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1這5個基因在高品質(zhì)組娘亞牦牛血液中的表達量顯著高于低品質(zhì)組。本研究結(jié)果可為研究娘亞牦牛血液中基因表達與精液質(zhì)量的相關(guān)性提供基礎(chǔ)資料，也為娘亞牦牛的分子育種、早期選育和開發(fā)血液DNA標志物的相關(guān)研究提供參考。