韓金育 郭晶晶 孟 歡 陳 瑾 王雅杰,*

(1.北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100015;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100015)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是引起慢性肝病的主要誘因[1],部分患者可發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌,全球約有1.6%的人口感染HCV,每年大約有40萬(wàn)人死于HCV感染相關(guān)疾病,對(duì)公眾生命健康造成嚴(yán)重威脅[2]。因此,對(duì)HCV感染進(jìn)行早期篩查、準(zhǔn)確診斷尤為重要。由于HCV抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、具有較高靈敏度等優(yōu)勢(shì),可作為實(shí)驗(yàn)室HCV篩查的首選方法,然而在方法學(xué)上不可避免地容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,尤其是弱陽(yáng)性患者,給臨床診斷造成了困擾,降低了檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心[3]建議對(duì)于HCV抗體陽(yáng)性的患者進(jìn)行更多確證試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。重組免疫印記試驗(yàn)(recombinant immunoblot assay,RIBA)因其特異度較高曾被廣泛作為HCV 抗體的補(bǔ)充確證試驗(yàn),但自2010年,RIBA試劑盒在美國(guó)停止生產(chǎn)后,不再推薦RIBA作為抗體補(bǔ)充確證試驗(yàn)。HCV抗體陽(yáng)性的患者進(jìn)行HCV RNA檢測(cè),但HCV RNA陰性并不能排除HCV感染。

丙型肝炎病毒抗體吸光度/臨界值(signal-to-cutoff,S/CO)值越高,抗體真陽(yáng)性率越高[3-4],近些年的研究表明抗體S/CO值在預(yù)測(cè)病毒血癥、診斷HCV感染中具有重要價(jià)值[5],可根據(jù)最佳S/CO值來(lái)限制非必要進(jìn)行補(bǔ)充確證試驗(yàn)的人數(shù)[6]。目前,由于不同醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用的儀器試劑以及方法學(xué)不同,尚無(wú)法統(tǒng)一HCV抗體的診斷臨界值?；谝陨纤?本研究對(duì)抗體初篩為有反應(yīng)性的樣本進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),并通過(guò)受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線(xiàn),得到本實(shí)驗(yàn)室抗體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 ≥ 95%的最佳S/CO值完善檢驗(yàn)報(bào)告,協(xié)助臨床診斷。同時(shí)為探索不同系統(tǒng)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑95%陽(yáng)性置信區(qū)間建立方法學(xué)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取2021年7月至2022年2月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院應(yīng)用雅培抗HCV抗體檢測(cè)試劑盒(chemiluminescence analysis,CLIA)進(jìn)行初篩檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)的患者血漿樣本共282例,其中男性138例、女性144例,患者年齡21～84歲,平均年齡(52.46±13.20)歲,丙型肝炎的臨床診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制訂的《丙型肝炎防治指南》2019年版[7]。納入標(biāo)準(zhǔn):① 進(jìn)行HCV抗體初篩;② 具有HCV RNA檢測(cè)結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn):① 哺乳、妊娠期婦女;② 合并人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)及其他肝炎病毒感染;③ 合并其他惡性腫瘤等疾病。該研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(文件編號(hào):DTEC-KY2022-027-01),并獲得免知情同意。

1.2 方法

1.2.1 HCV抗體檢測(cè)

采用購(gòu)自美國(guó)雅培公司的ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀(CLIA法)對(duì)丙型肝炎病毒抗體進(jìn)行初篩。

CLIA法陽(yáng)性判定:按照雅培說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判斷,S/CO ≥ 1為有反應(yīng)性。

1.2.2 HCV RNA檢測(cè)

采用購(gòu)自瑞士羅氏生物公司的cobas AmpliPrep儀器進(jìn)行核酸提取,并采用購(gòu)自瑞士羅氏生物公司的cobas TaqMan分析儀進(jìn)行自動(dòng)擴(kuò)增并檢測(cè)。

HCV RNA檢測(cè):線(xiàn)性范圍為15.0～1.0×108IU·mL-1,分析靈敏度為9.2 IU·mL-1。

1.2.3 RIBA 檢測(cè)

采用北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體確證試劑盒對(duì)丙型肝炎病毒抗體初篩為陽(yáng)性的血漿樣本中的抗體進(jìn)行確認(rèn)。

RIBA法陽(yáng)性判定:根據(jù)各條帶顯色強(qiáng)度判斷結(jié)果陰、陽(yáng)性。至少出現(xiàn)兩種HCV抗體特異條帶(Core,NS3,NS4和NS5)強(qiáng)度1+及以上,結(jié)果判讀為陽(yáng)性;未出現(xiàn)HCV抗體特異條帶強(qiáng)度1+及以上,結(jié)果判讀為陰性;僅出現(xiàn)一種HCV抗體特異條帶(Core,NS3,NS4和NS5) 強(qiáng)度1+及以上,結(jié)果判讀為不確定,詳見(jiàn)圖1。

圖1 RIBA結(jié)果

1.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋

對(duì)本研究納入的282例研究對(duì)象查閱其HCV RNA檢測(cè)結(jié)果,并收集其血漿樣本進(jìn)行RIBA試驗(yàn),若HCV RNA、RIBA檢測(cè)結(jié)果均為陰性,考慮HCV抗體結(jié)果為假陽(yáng)性;若HCV RNA、RIBA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,臨床診斷為真陽(yáng)性(HCV現(xiàn)癥感染)[8];若HCV RNA結(jié)果為陰性,RIBA結(jié)果為陽(yáng)性,包含兩種情況:①臨床診斷為真陽(yáng)性(HCV既往感染);②對(duì)于無(wú)明確HCV感染史、無(wú)法證明其HCV感染的患者,則認(rèn)為偶然因素導(dǎo)致RIBA結(jié)果為陽(yáng)性,暫不納入研究;若HCV RNA結(jié)果為陰性,RIBA結(jié)果為不確定,則通過(guò)查閱患者病史、肝功能或既往抗體、HCV RNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用百分率進(jìn)行描述,組間率比較采用χ2檢驗(yàn)。HCV抗體S/CO值與抗體真陽(yáng)性率之間相關(guān)性進(jìn)行Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算,并應(yīng)用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析,得到最佳ROC曲線(xiàn)下面積(area under the curve,AUC)、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及最佳S/CO值。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV抗體初篩檢測(cè)患者臨床實(shí)驗(yàn)室特征

在282例進(jìn)行HCV抗體初篩的患者中,男性138例、女性144例,患者年齡21～84歲,221例患者(78.37%)HCV RNA結(jié)果為陰性,61例患者(21.63%)為HCV RNA陽(yáng)性;78例患者(27.66%)RIBA結(jié)果為陰性,162例患者(57.45%)RIBA結(jié)果為陽(yáng)性,42例患者(14.89%)RIBA結(jié)果為不確定,詳見(jiàn)表1。

表1 HCV抗體初篩檢測(cè)患者臨床實(shí)驗(yàn)室特征

2.2 HCV抗體初篩檢測(cè)患者HCV感染狀態(tài)判斷

HCV抗體初篩結(jié)果為陰性的患者經(jīng)HCV RNA及RIBA檢測(cè)后均為真陰性;在252例HCV抗體初篩陽(yáng)性的患者中,HCV RNA、RIBA均陰性的患者48例,臨床考慮為HCV抗體假陽(yáng)性;HCV RNA陽(yáng)性、RIBA陽(yáng)性的患者61例,臨床診斷為真陽(yáng)性,為HCV現(xiàn)癥感染;HCV RNA陰性、RIBA陽(yáng)性的患者共101例,通過(guò)查閱患者病史、肝功能結(jié)果、既往HCV抗體、HCV RNA檢測(cè)結(jié)果最終確定病毒已清除的HCV既往感染患者共95例,亦為HCV抗體真陽(yáng)性;剩余6例患者無(wú)明確的HCV感染史,無(wú)法確定是否HCV感染,因此暫不納入研究;HCV RNA陰性、RIBA不確定的患者共42例,經(jīng)過(guò)查閱病史及既往檢測(cè)結(jié)果,最終確定HCV既往感染患者32例,10例患者無(wú)法證明是否HCV感染,故暫不納入研究,詳見(jiàn)圖2。

圖2 HCV抗體初篩檢測(cè)患者感染狀態(tài)判斷

2.3 HCV抗體不同S/CO區(qū)間HCV RNA、RIBA結(jié)果分析

本研究將HCV抗體初篩為有反應(yīng)性(S/CO ≥ 1)的樣本分成不同區(qū)間,分別統(tǒng)計(jì)不同S/CO區(qū)間的真陽(yáng)性率,分析抗體S/CO與真陽(yáng)性率之間的相關(guān)性。結(jié)果表明S/CO值越高,真陽(yáng)性率越高。詳見(jiàn)圖3。進(jìn)一步進(jìn)行Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算,r=0.608,P<0.000 1,呈正相關(guān),結(jié)果提示HCV抗體S/CO值越高,真陽(yáng)性率越高。詳見(jiàn)表2。

表2 HCV抗體不同S/CO區(qū)間HCV RNA、RIBA結(jié)果分析

圖3 HCV-Ab S/CO與真陽(yáng)性率的相關(guān)性分析

2.4 ROC曲線(xiàn)分析確定HCV抗體最佳S/CO值

將HCV抗體檢測(cè)結(jié)果與HCV RNA與RIBA結(jié)果進(jìn)行比較,通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析確定HCV抗體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 ≥ 95%的最佳S/CO值為7.83,此時(shí)靈敏度為93.09%,特異度為95.83%,AUC為0.98,詳見(jiàn)圖4。隨后本研究對(duì)HCV抗體S/CO ≥ 7.83的175例樣本進(jìn)行分析,其中HCV RNA、RIBA結(jié)果同時(shí)陽(yáng)性(HCV現(xiàn)癥感染)有56例,HCV RNA陰性、RIBA陽(yáng)性有92例(均為HCV既往感染),HCV RNA、RIBA結(jié)果均陰性(假陽(yáng)性)有2例,HCV RNA陰性、RIBA結(jié)果為不確定共25例,通過(guò)查閱病史或既往實(shí)驗(yàn)室結(jié)果確定其均為HCV既往感染,上述提到本研究HCV RNA陽(yáng)性即HCV現(xiàn)癥感染共61例,而有91.8%(56/61)的HCV現(xiàn)癥感染患者其抗體S/CO在7.83以上。此結(jié)果提示當(dāng)HCV抗體S/CO ≥ 7.83且HCV RNA為陽(yáng)性時(shí)意味著高風(fēng)險(xiǎn)活動(dòng)性HCV感染,對(duì)于HCV RNA陰性、S/CO ≥ 7.83的患者極有可能為HCV既往感染,詳見(jiàn)表3。

表3 HCV抗體S/CO ≥ 7.83區(qū)間HCV RNA、RIBA結(jié)果分析

圖4 ROC曲線(xiàn)分析

3 討論

HCV感染是引起慢性肝病的主要原因,全球約有7 000萬(wàn)人感染HCV,是全世界不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題[9],因此,對(duì)HCV感染進(jìn)行及時(shí)而準(zhǔn)確的診斷十分重要。HCV感染的診斷基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),HCV抗體檢測(cè)因其操作簡(jiǎn)便,靈敏度高成為HCV感染篩查的首選方法,然而HCV抗體陽(yáng)性并不能明確區(qū)分HCV現(xiàn)癥感染、HCV既往感染以及抗體假陽(yáng)性,HCV抗體陽(yáng)性結(jié)果提示HCV活動(dòng)性感染、病毒清除的HCV既往感染或HCV抗體假陽(yáng)性[10-12]。研究[5]顯示,對(duì)于HCV低流行率的人群以及抗體弱陽(yáng)性的人群,其抗體假陽(yáng)性的概率更高。在實(shí)際工作中,常會(huì)遇到HCV抗體弱陽(yáng)性的樣本,其抗體檢測(cè)結(jié)果往往是造成臨床診斷困惑的主要原因,同時(shí)也降低了檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性。HCV抗體陽(yáng)性的患者是否需要進(jìn)一步處理一直是困擾臨床的難題[13],RIBA因其高特異性曾被廣泛作為HCV抗體的補(bǔ)充確證試驗(yàn)[14],現(xiàn)階段對(duì)于HCV抗體陽(yáng)性的患者進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)證實(shí)HCV 抗體結(jié)果,但HCV RNA陰性并不能排除HCV感染[15]。因此對(duì)HCV抗體陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確解釋,區(qū)分HCV現(xiàn)癥感染、既往感染與假陽(yáng)性是亟須解決的。近些年,有研究[3-4]證實(shí)HCV抗體S/CO值可預(yù)測(cè)病毒血癥,S/CO越高,抗體陽(yáng)性率越高,對(duì)預(yù)測(cè)HCV感染具有重要價(jià)值。實(shí)驗(yàn)室可確定抗體檢測(cè)臨界值來(lái)預(yù)測(cè)臨床診斷的真陽(yáng)性[16]。不同實(shí)驗(yàn)室由于所用儀器、試劑及方法學(xué)不同,因此尚無(wú)法統(tǒng)一抗體弱陽(yáng)性臨界值,因此本研究擬確定本實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)決定水平,確定陽(yáng)性預(yù)測(cè)值≥95%的最佳S/CO值,提高檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性,協(xié)助臨床診斷,最大限度縮小非必要進(jìn)行抗體補(bǔ)充確證試驗(yàn)的人數(shù)。同時(shí)為探索不同系統(tǒng)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑95%陽(yáng)性置信區(qū)間建立方法學(xué)。

本研究收取了2021年7月至2022年2月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院進(jìn)行雅培化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)抗體同時(shí)進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)的患者血漿樣本共282例,進(jìn)行RIBA確證試驗(yàn)并查閱其HCV RNA結(jié)果,并統(tǒng)計(jì)HCV RNA及RIBA結(jié)果的分布情況,接下來(lái)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果對(duì)HCV感染狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分,確定HCV抗體真陽(yáng)性。根據(jù)丙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果解讀指南[3],HCV RNA、RIBA結(jié)果均陽(yáng)性樣本61例,臨床診斷為HCV現(xiàn)癥感染,為真陽(yáng)性。HCV RNA及RIBA結(jié)果均陰性樣本48例,臨床考慮為抗體假陽(yáng)性,當(dāng)1

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于HCV感染的診斷至關(guān)重要,其中HCV抗體檢測(cè)由于其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)成為HCV感染篩查的首個(gè)環(huán)節(jié)。但其方法學(xué)上存在假陽(yáng)性,給臨床診斷造成一定的困惑。因此對(duì)于HCV抗體陽(yáng)性的患者需進(jìn)一步進(jìn)行補(bǔ)充確證實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。近些年,有研究[3]證明HCV抗體S/CO值對(duì)于診斷HCV感染至關(guān)重要,疾病預(yù)防控制中心亦推薦不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 ≥ 95%的S/CO臨界值,預(yù)測(cè)HCV感染,協(xié)助臨床診斷同時(shí)減少假陽(yáng)性報(bào)告的出現(xiàn),同時(shí)臨床可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室確定的S/CO臨界值做出正確決策,由此可見(jiàn)本研究具有很好的臨床價(jià)值。

由于不同的實(shí)驗(yàn)室HCV抗體檢測(cè)的儀器試劑不同,尚無(wú)統(tǒng)一的S/CO臨界值,因此各實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)建立本實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)學(xué)決定水平。本研究也希望為探索不同系統(tǒng)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑95%陽(yáng)性置信區(qū)間建立方法學(xué)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明韓金育:進(jìn)行實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)分析,論文撰寫(xiě);郭晶晶:文章潤(rùn)色;孟歡、陳瑾:臨床數(shù)據(jù)收集,協(xié)助數(shù)據(jù)分析;王雅杰:研究命題的提出,論文總體把關(guān)、審定。