李玉佳 官德秀 郭 姝 郭 景 徐樨巍*

(1.國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院消化科,北京 100045;2.北京京都兒童醫(yī)院消化科,北京 102208)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是指原因不明的一組非特異性慢性胃腸道炎癥性疾病,包括克羅恩病(Crohn′s disease,CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和未定型IBD(IBD unclassified,IBDU)。極早發(fā)型炎癥性腸病(very early onset IBD,VEO-IBD)是指年齡小于6歲的IBD兒童[1]。與成人IBD的不同之處在于,兒童IBD,尤其是VEO-IBD往往是由于單基因突變所致,被報道最多的是白細(xì)胞介素(interleukin,IL)10及其受體基因突變所致[1]。VEO-IBD患兒除常見的消化系統(tǒng)癥狀,如腹痛、腹瀉、黏液血便外,常合并發(fā)熱、貧血、生長發(fā)育遲滯、營養(yǎng)不良等[1],嚴(yán)重影響患兒的生長發(fā)育,VEO-IBD往往發(fā)病年齡早、病情重,病死率高[2],臨床表現(xiàn)多樣,可伴有腸外表現(xiàn),部分患兒臨床癥狀不典型,因其缺乏特異性的臨床表現(xiàn),病例數(shù)相對少,故在臨床工作中診斷難度大,容易誤診、漏診。延誤診斷會直接影響患兒的預(yù)后,給患兒和家庭造成危害。本研究回顧性分析15例白細(xì)胞介素10受體A(interleukin 10 receptor A,IL-10RA)基因突變所致的VEO-IBD患兒的臨床病歷資料,總結(jié)其臨床特點并分析其基因報告,進(jìn)一步提高對本病的認(rèn)知,為VEO-IBD患兒的早期診斷提供臨床參考,早期識別、盡早完善基因檢測明確診斷,對改善預(yù)后十分重要。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析2007年3月到2019年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院消化科確診的30例VEO-IBD患兒,其中15例病因為IL-10RA基因突變所致的VEO-IBD患兒作為IL-10RA組,納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡:0～6歲;②VEO-IBD的診斷符合 2019年發(fā)布的《兒童炎癥性腸病診斷和治療專家共識》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1];③經(jīng)基因檢測確定存在IL-10RA突變。15例經(jīng)基因檢測明確為非IL-10RA突變所致的VEO-IBD患兒作為對照組,入組標(biāo)準(zhǔn)符合IL-10RA組第①、第②條標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:[2023]-E-072-R),通過查閱病歷獲取本研究患兒發(fā)病時的臨床病歷資料。本文為回顧性研究,經(jīng)倫理委員會審查免除患兒家長知情同意。

1.2 研究方法

通過查閱病歷,收集患兒的臨床病歷資料,包括:性別、年齡、起病年齡、家族史、入院時體格發(fā)育情況、實驗室檢查結(jié)果、胃腸鏡檢查結(jié)果、病理結(jié)果及基因檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。按照蒙特利爾標(biāo)準(zhǔn)和巴黎分型[3],CD 按照病變部位分型如下:回腸末段(L1)、結(jié)腸(L2)、回結(jié)腸(L3)、上消化道型(L4)。UC按照病變范圍分為直腸(E1)、左半結(jié)腸(E2)、廣泛結(jié)腸(E3)和全結(jié)腸(E4)。

評估營養(yǎng)不良[4]:測定患兒身高、體質(zhì)量,采用Z評分法評估患兒營養(yǎng)狀況,具體如下:Z評分=(體格指標(biāo)實際測定值-體格指標(biāo)參考值中位數(shù))/體格指標(biāo)參考值標(biāo)準(zhǔn)差,Z值在-2～+2之間為兒童體格生長正常。年齡別體質(zhì)量Z評分(weight for age,WAZ)、年齡別身高/長Z評分(height for age,HAZ),Z值<-2為營養(yǎng)不良,WAZ<-2為低體質(zhì)量,HAZ<-2為生長遲緩(反映兒童慢性營養(yǎng)不良)。

1.3 二代基因測序和驗證

1.3.1 基因組 DNA 提取

經(jīng)患者家屬知情同意,抽取患兒、患兒父母的外周血各2 mL(EDTA 抗凝),用QIAamp 全血 DNA 提取試劑盒(德國Qiagen公司)按其說明書提取基因組 DNA。

1.3.2 目標(biāo)基因捕獲和高通量測序

應(yīng)用 GenCap 液相捕獲目標(biāo)基因技術(shù),捕獲患兒所有基因編碼外顯子和側(cè)翼區(qū)域,進(jìn)行全外顯子檢測(北京邁基諾公司)。目標(biāo)區(qū)域測序后,運(yùn)用 BWA 軟件比對到參考基因組上(hg19 版本),對測序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)篩選和生物信息學(xué)分析

通過 Sentieon 軟件的參數(shù)驅(qū)動程序檢測單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失突變(insertion deletion mutation,INDEL)的變異,并與多個數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián),如千人基因組、ESP6500、dbSNP、EXAC、gnomAD、內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(Mygenotics),并用 REVEL、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster、GERP++等軟件進(jìn)行變異有害性預(yù)測。突變位點關(guān)聯(lián) HGMD 數(shù)據(jù)庫,用 phenolyzer 和 exomiser 軟件根據(jù)疾病表型關(guān)聯(lián)基因,對變異位點和基因打分評估,獲得致病性排序。最終篩選的潛在致病變異通過Sanger測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IL-10RA組一般情況

IL-10RA組15例VEO-IBD患兒,其中男性9例(60%)、女性6例(40%);其中CD 11例(73%)、UC 4例(27%)。入院年齡2～15月齡,發(fā)病中位年齡2(1,3)月齡,診斷中位年齡6(5,8)月齡。4例(27%)患兒有家族史,其中1例患兒父親有UC病史,3例患兒哥哥或姐姐因類似癥狀死亡。

2.2 IL-10RA組患兒的臨床特點

本組VEO-IBD患兒臨床表現(xiàn)多樣,消化道癥狀依次為慢性腹瀉(15/15例,100.0%)、便血(15/15例,100.0%);腸外表現(xiàn)依次為口腔黏膜潰瘍(6/15例,40.0%)、皮膚紅斑(5/15例,33.3%);肛周表現(xiàn)依次為直腸會陰瘺5例(5/15,33.3%),肛瘺4例(4/15,26.7%),肛裂3例(3/15,20.0%),直腸會陰瘺、皮贅并存1例(1/15,6.7%);全身表現(xiàn)依次為發(fā)熱(15/15例,100.0%)、體質(zhì)量減輕(15/15例,100.0%)、貧血(13/15例,86.7%)、營養(yǎng)不良(13/15例,86.7%)、脫水(12/15例,80.0%)、電解質(zhì)紊亂(11/15例,73.3%)、生長發(fā)育遲緩(7/15例,46.7%)、低蛋白血癥3例(3/15例,20.0%)、肝損害2例(2/15例,13.3%)。并發(fā)癥方面,VEO-IBD患兒反復(fù)腹瀉、免疫力低,容易合并感染,本研究中合并膿毒癥5例(5/15例,33.3%)、肺部感染5例(5/15例,33.3%)、偽膜性腸炎2例(2/15例,13.3%),合并腸狹窄4例(4/15例,26.7%)。與對照組相比,從發(fā)病年齡方面來看,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,IL-10RA突變組發(fā)病年齡更早;臨床癥狀方面,兩組患兒在發(fā)熱、便血、皮膚改變、口腔潰瘍、生長發(fā)育遲緩、合并感染方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義,在肛周病變和營養(yǎng)不良方面,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,IL-10RA突變組更容易出現(xiàn)肛周病變、營養(yǎng)不良。詳見表1。

表1 IL-10RA突變組和非IL-10RA突變組VEO-IBD患兒臨床特征比較

2.3 IL-10RA組患兒結(jié)腸鏡檢查結(jié)果及病理表現(xiàn)

本研究中15例患兒均進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查,鏡下表現(xiàn)以結(jié)腸多發(fā)潰瘍?yōu)橹?多發(fā)深潰瘍、淺潰瘍,其次為炎性息肉,病變部位依次為L2(結(jié)腸型)6例、L3(回結(jié)腸型)5例、E3(廣泛結(jié)腸)型4例,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)隱窩膿腫、隱窩結(jié)構(gòu)變形,15例均有中性粒細(xì)胞浸潤。本研究中患兒結(jié)腸鏡鏡下與病理表現(xiàn)詳見表2。

表2 15例IL-10RA突變所致VEO-IBD患兒的基本信息、臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡及病理表現(xiàn)

2.4 VEO-IBD患兒部分實驗室檢查結(jié)果

實驗室檢查結(jié)果方面,30例患兒中,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高2例。便常規(guī)紅白細(xì)胞增多。炎癥指標(biāo)均有不同程度增高,對比15例非IL-10RA突變組VEO-IBD患兒的實驗室檢驗結(jié)果,比較患兒的炎性指標(biāo)(白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、降鈣素原、鐵蛋白、血紅蛋白、白蛋白及凝血指標(biāo)(血小板計數(shù)、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間),兩組患兒在白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNF-α、降鈣素原、鐵蛋白這幾項炎癥指標(biāo)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,IL-10RA突變組明顯高于非IL-10RA突變組。兩組血小板數(shù)量均有升高,IL-10RA突變組凝血酶原時間和部分凝血活酶時間均明顯延長。詳見表3。

表3 IL-10RA突變組和非IL-10RA突變組VEO-IBD患兒部分實驗室結(jié)果比較

2.5 IL-10RA組患兒的基因檢測結(jié)果

本研究中15例VEO-IBD患兒突變基因均為IL-10RA,共檢測到9個突變位點,13例復(fù)合雜合突變,2例純合突變,2例純合突變均為c.301c>T(p.R101W),13例雜合突變中6例突變類型為c.301c>T(p.R101W)和c.537G>A(p.T179T)。患兒均為非近親結(jié)婚家庭。結(jié)果詳見表4。

表4 IL-10RA組患兒基因檢測結(jié)果

3 討論

兒童IBD的發(fā)病率近年來呈逐年增加的趨勢[5],病因不明確,通常認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素有關(guān),VEO-IBD是指6歲以內(nèi)發(fā)病的患兒[1],占兒童 IBD 的 4%～10%[6]。VEO-IBD往往是由于先天遺傳性因素所致,2009年Glocker等[2]首次報道了IL-10RA基因突變導(dǎo)致的VEO-IBD 病例,目前為止,關(guān)于VEO-IBD的發(fā)病機(jī)制至少報道了與之有關(guān)的50余種單基因突變,如IL-10、IL-10R、FOXP3、XIAP、TTC37等[2],單基因突變是引起VEO-IBD的重要原因,并且這類患兒常規(guī)藥物治療通常療效差,病死率較高[2]。報道最多的為IL-10及IL-10R基因突變導(dǎo)致的VEO-IBD病例,王福萍等[7]、潘思蕊等[8]、許永彬等[9]及蘇雯等[10]均報道了VEO-IBD,經(jīng)基因測序證實均存在IL-10RA基因突變。

IL-10RA基因突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳病,疾病表型為早發(fā)型炎癥性腸病28型。IL-10主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌,是人體重要的抗炎細(xì)胞因子。IL-10RA定位于染色體11q23.3,其基因編碼一個578個氨基酸的蛋白,為一個90 000～110 000的糖基化蛋白,IL-10RA可以在造血組織、結(jié)腸上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞表達(dá),但在造血組織中表達(dá)水平比較低,每個細(xì)胞約表達(dá)100～800個分子,單核巨噬細(xì)胞表達(dá)最多[2]。IL-10是具有抗炎作用的細(xì)胞因子,會抑制過度的促炎反應(yīng)維持體內(nèi)平衡,與IL-10RA結(jié)合后激活信號傳導(dǎo)通路,抑制促炎基因表達(dá)發(fā)揮抗炎作用,從而引起腸道發(fā)生嚴(yán)重免疫炎癥反應(yīng)[11]。據(jù)報道[7,10-12],目前為止,已知與 VEO-IBD 相關(guān)的基因變異作用主要通過以下幾種途徑:干擾腸上皮屏障功能、損害適應(yīng)性免疫發(fā)展、IL-10和 IL-10R途徑、影響吞噬細(xì)胞識別和細(xì)菌清除及自身免疫性疾病相關(guān)基因缺陷等。

以往的研究[12-13]表明,IL-10信號通路相關(guān)基因突變的患兒通常都是新生兒期起病,主要表現(xiàn)為結(jié)腸廣泛病變和肛周病變。本研究中IL-10RA突變引起VEO-IBD的患兒發(fā)病中位年齡2(1,3)月齡,結(jié)腸鏡下病變廣泛,13例患兒有不同程度的肛周病變,與以往的研究[12-13]結(jié)果一致。本研究中VEO-IBD患兒消化道癥狀以慢性腹瀉、便血為主;腸外表現(xiàn)為口腔黏膜潰瘍、皮膚紅斑,肛周表現(xiàn)依次為直腸會陰瘺、肛瘺、肛裂、皮贅;全身表現(xiàn)為發(fā)熱、體質(zhì)量減輕、貧血、營養(yǎng)不良、脫水、電解質(zhì)紊亂、生長發(fā)育遲緩、低蛋白血癥、肝損害。生長發(fā)育遲緩可能與發(fā)病年齡早、腹瀉便血嚴(yán)重、攝入不足、營養(yǎng)素丟失嚴(yán)重有關(guān)。與非IL-10RA突變組相比,IL-10RA組更容易出現(xiàn)肛周病變,營養(yǎng)不良。既往Beser等[14]報道肛周病變更多見于IL-10或IL-10R基因突變患兒,其他文獻(xiàn)[2,15-18]亦有類似報道。

2009年,Glocker等[2]首次報道證實IL-10R基因突變可以導(dǎo)致VEO-IBD,IL-10通路信號異常傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活蛋白磷酸化,TNF-α等表達(dá)異常增高,IL-10和受體結(jié)合后,激活JAK1和Tyk2信號通路,通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT-3,激活下游的抗炎因子的表達(dá),包括IL-6,IL-8和TNF-α等,從而起到抑制炎癥的作用(圖1)[19]。本研究中觀察到的IL-6和TNF-α增高,說明IL-10突變導(dǎo)致的炎癥因子增高是致病的重要環(huán)節(jié)。IL-10A受體突變后,導(dǎo)致IL-10對腸道炎癥的調(diào)節(jié)作用失衡,臨床表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)過度,在臨床上會有各種的臨床表現(xiàn)。

圖1 IL-10和IL-10R信號通路圖示[19]

血小板參與凝血的各環(huán)節(jié),其數(shù)量升高提示患兒處于高凝狀態(tài),本研究中對比兩組患兒,兩組在血小板數(shù)量方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究還存在不足之處,樣本量小,還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究對比。就目前的研究結(jié)果而言,在臨床工作中,對于可疑VEO-IBD患兒,如發(fā)現(xiàn)患兒白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNF、降鈣素原、鐵蛋白炎癥指標(biāo)明顯升高,貧血、白蛋白減低、凝血功能異常,需提高警惕,在明確診斷的過程中,需考慮患兒是否存在IL-10RA突變。

本研究中15例IL-10RA基因突變患兒中13例為復(fù)合雜合突變,2例為純合突變。其中c.301c>T(p.R101W)和c.537G>A(p.T179T)為最常見的突變位點。C.537G>A是編碼區(qū)第 537 號核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤,導(dǎo)致氨基酸改變,p.T179T(第179 號氨基酸由蘇氨酸變異為蘇氨酸)為同義突變,該變異不屬于多態(tài)性位點,在人群中發(fā)生頻率極低,與許永彬等[9]報道的2例新生兒期起病的IO-IBD患兒突變位點一致。臨床表現(xiàn)方面,亦是在新生兒期即出現(xiàn)腹瀉、便血。姜毅等[20]報道的5例新生兒期起病的VEO-IBD患兒,基因檢測結(jié)果顯示5例為IL-10RA基因突變,其中1例純合突變,4例 復(fù)合雜合突變,4例雜合突變位點均有c.301c>T(p.R101W),與本研究中最常見的突變位點一致,臨床表現(xiàn)方面5例均伴有不同程度的血便或便潛血陽性,主要表現(xiàn)有發(fā)熱、貧血、口腔或肛周潰瘍,均有體質(zhì)量增長遲緩,與本研究一致。方優(yōu)紅等[21]報道的55例VEO-IBD患兒中,21例行基因檢測,9例檢出為單基因突變,其中4例為IL-10RA基因突變,臨床表現(xiàn)以腹瀉、便血為主,易合并營養(yǎng)不良、生長遲緩,肛周病變發(fā)生率高,與本研究一致。宮幼喆等[17]回顧性分析的39例VEO-IBD患兒,其中17例患兒進(jìn)行基因測序,10例患兒為單基因突變,其中 7 例患兒為IL-10RA基因突變。一項關(guān)于中國兒童 VEO-IBD 的研究[22]中,顯示IL-10RA突變率為 45.2% (42/93),其中 c.301C>T(p.R101W)和c.537G>A(p.T179T)是最常見的突變位點,與本研究常見突變點位一致。張伯瑋等[23]報道的3例VEO-IBD患兒均為IL-10RA基因突變,c.301C>T(p.R101W)為最熱點突變。謝雨婕等[24]報道的2例新生兒期起病的IL-10RA基因突變所致的VEO-IBD,其中1例基因突變位點為c.301C>T、c.537G>A,與本研究中常見突變位點相同,臨床癥狀以反復(fù)腹瀉、便血為主,存在營養(yǎng)不良、口腔潰瘍、肛周膿腫,與本研究一致。

部分患兒合并腸狹窄與Pigneur等[25]、謝雨婕等[24]的IL-10或IL-10R基因突變所致VEO-IBD患兒內(nèi)鏡及病理表現(xiàn)一致。姜毅[20]等報道的IL-10RA突變患兒的結(jié)腸鏡下表現(xiàn)、病理表現(xiàn)亦與本研究一致。Ye等[26]的研究中10例患兒發(fā)現(xiàn)隱窩/絨毛結(jié)構(gòu)異常、炎性浸潤。臨床中高度懷疑VEO-IBD的患兒,除盡早完善基因檢測外,同時結(jié)合消化內(nèi)鏡檢查、HE染色分析以及特異性免疫組織化學(xué)檢查可以進(jìn)一步協(xié)助診斷、評估腸道病變嚴(yán)重程度。

本文通過總結(jié)分析15例IL-10RA基因突變所致VEO-IBD患兒的臨床特點和基因檢測結(jié)果,與非IL-10RA基因突變所致VEO-IBD患兒對比分析,發(fā)現(xiàn)IL-10RA基因突變所致VEO-IBD患兒具有發(fā)病年齡早的特點,在臨床工作中對于生命早期反復(fù)出現(xiàn)腹瀉、便血等消化道癥狀的患兒,尤其是病情相對嚴(yán)重、容易反復(fù)感染、存在腸外表現(xiàn)、肛周病變的患兒,炎癥因子增高,凝血功能異常,需警惕單基因遺傳病,盡早完善基因檢測以明確病因,精準(zhǔn)治療,改善預(yù)后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李玉佳:研究選題和設(shè)計,數(shù)據(jù)分析整理,統(tǒng)計學(xué)分析,論文撰寫及修改;官德秀:研究設(shè)計、指導(dǎo);郭姝、郭景:數(shù)據(jù)收集與整理;徐樨巍:總體把關(guān),研究指導(dǎo),審定論文。