趙 蓓 施小琪 唐雪梅 程 石*

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院(電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院)皮膚科(皮膚病性病研究所),成都 610000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,成都 610000)

黑色素瘤是一種由黑色素細胞惡性病變導(dǎo)致的皮膚癌癥,并且已經(jīng)成為男性癌癥發(fā)病率增長最快及女性發(fā)病率增長第二快的癌癥[1]。據(jù)統(tǒng)計,2020年全球范圍內(nèi)新增皮膚黑色素瘤患者324 635例,其中死亡57 043例[2]。如在發(fā)病早期完成診斷,大多數(shù)黑色素瘤是可以治愈的。而一旦黑色素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移,則預(yù)后較差,死亡病例甚至占到皮膚癌導(dǎo)致的死亡病例的80%以上[3]。晚期患者中位生存期僅為7.5個月,2年生存率約為15%,5年生存率僅為5%[4]。

針對早期皮膚黑色素瘤,外科手術(shù)是主要的治療手段,但是對于中晚期黑色素瘤患者,化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)等輔助治療或姑息性治療是改善預(yù)后的重要手段。其中,達卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)是經(jīng)美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的治療晚期黑色素瘤的常規(guī)化療藥物[5]。即便如此,由于內(nèi)在抗性或細胞抑制藥物導(dǎo)致黑色素瘤的耐藥性,目前化療效果不佳。耐藥性是限制化療治療惡性黑色素瘤療效的主要問題;如果能夠減少耐藥,患者生存率可能提高。因此,研究黑色素瘤的耐藥機制成為解決問題的關(guān)鍵。

Huang：Think carefully.Xi’er will have a happy life.

為進一步發(fā)掘與黑色素瘤耐藥性相關(guān)的基因及信號通路,闡明其耐藥機制,本研究以A375、M14黑色素瘤細胞為研究對象,通過逐漸提高DTIC濃度獲得耐藥性黑色素瘤細胞株[6],隨后通過轉(zhuǎn)錄物組學(xué),分析黑色素瘤細胞出發(fā)株及耐受株,獲得發(fā)生顯著差異表達的類泛素特異性蛋白酶1(SUMO-specific protease 1,SENP1)基因及信號通路,最后通過對相關(guān)基因的過表達及抑制,發(fā)現(xiàn)了其與黑色素瘤耐藥性的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 細胞株

本實驗使用A375、M14細胞株,由四川省人民醫(yī)院實驗室自行保存。

1.1.3 儀器

以A375、M14黑色素瘤細胞為對象,從初始誘導(dǎo)劑量2 μg/mL的DTIC處理處于對數(shù)生長期的A375、M14細胞培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)液,待其長至70%～80%密度時,再次加入2 μg/mL DTIC,同時開始成倍增加藥物誘導(dǎo)劑量,每個劑量培養(yǎng)10 d。出發(fā)細胞株為本實驗的對照組(A375-WT及M14-WT),最終獲得的耐藥性細胞株為本實驗的實驗組(DTIC-resistant,DR)。

1.1.2 試劑

第一，外?？既氡拘Ｑ芯可诒究齐A段只學(xué)習(xí)了工程熱力學(xué)和傳熱學(xué)等基本課程，缺乏對燃氣輪機專業(yè)知識的學(xué)習(xí)，導(dǎo)致入學(xué)之后學(xué)習(xí)我校研究生課程存在一定的困難，在課程結(jié)束之后也很難進入研究課題。第二，研究生入學(xué)后，以導(dǎo)師研究方向選擇相應(yīng)的課程和開展相關(guān)課題研究，學(xué)生畢業(yè)之后只熟悉自己的研究領(lǐng)域，不了解燃氣輪機其他研究方向的內(nèi)容。燃氣輪機的設(shè)計是一個團隊協(xié)作的工作，因此很難有效開展研究。第三，缺乏系統(tǒng)深入的了解，燃氣輪機整體性能知識儲備不足，不能滿足研究生階段及其參加工作后對于燃氣輪機系統(tǒng)分析的需要。

在對A375及M14黑色素瘤細胞株連續(xù)添加DTIC培養(yǎng)(詳見方法部分)8個月后,本研究對兩株實驗組細胞(DR)與出發(fā)株(對照組,WT)的耐受性進行了比較。首先,本研究測定了各細胞株對DTIC的半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)。如圖1A所示,經(jīng)過8個月的處理后,無論A375還是M14黑色素瘤細胞株,其對DTIC的耐受能力都顯著增加。其中,A375耐受株(A375-DR)相比對照組(A375-WT),IC50從(22.5±2.1)μmol/L提升至(138.4±1.7)μmol/L(P<0.001);而M14耐受株(M14-DR)相比對照組(M14-WT),IC50從(27.3±2.3)μmol/L提升至(167.4±2.2)μmol/L(P<0.001)。隨后,本研究測定了耐受株與對照組在DTIC處理下的細胞凋亡情況。如圖1B及1C所示,在10 μg/mL DTIC處理48 h后,A375-DR相比A375-WT以及M14-DR相比M14-WT,活細胞數(shù)量明顯增加而凋亡細胞量均明顯減少。以上結(jié)果表明,本研究成功獲得了耐受DTIC的黑色素瘤細胞,同時也表明DTIC的長期使用可使得黑色素瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。

本研究所建立的青皮藥材的HPLC指紋圖譜，可反映藥材樣品的特異性和整體性信息。在11個共有峰中，通過與對照品HPLC圖譜比對指認出了橙皮苷峰。10批藥材樣品的相似度評價結(jié)果表明，各批藥材樣品間質(zhì)量存在差異。各共有峰相對保留時間的RSD差異小，但相對峰面積的RSD相差較大，提示不同產(chǎn)地藥材樣品的成分雖一致，但含量差異較大，這可能與藥材的生長環(huán)境、采收季節(jié)、加工炮制等因素有關(guān)。

1.2 方法

采用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。將對照組及實驗組細胞接種于24孔板(5×104個細胞/孔),分組培養(yǎng)48 h后收集細胞(1 000 r/min離心5 min),磷酸鹽緩沖液洗1次后加入100 μL Annevix Binding Buffer重懸,依次加入5 μL Annevix FITC及5μL PI,室溫避光15 min。上機前補加150 μL Annevix Binding Buffer后進行凋亡檢測。

本研究所用主要試劑包括:DTIC(D129847,阿拉丁,中國)、Annexin V-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(HR8284,百奧萊博,中國)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,D8371,索萊寶,中國)、脫脂奶粉(D8340,索萊寶,中國)、Tris-HCl-NaCl-Tween(TBST)緩沖液(T1081,索萊寶,中國)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)(P1022,索萊寶,中國)、放射免疫沉淀試驗緩沖液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)(R0020,索萊寶,中國)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(M128783,阿拉丁,中國)、四甲基乙二胺(TEMED,T105496,阿拉丁,中國)、過硫酸銨(A112450,阿拉丁,中國)、考馬斯亮藍(B104241,阿拉丁,中國)、SYBR qPCR Master Mix(Q711,諾唯贊,中國)。

1.2.2 細胞凋亡檢測

1.2.1 黑色素瘤耐藥細胞株的構(gòu)建

國有農(nóng)場辦社會職能改革和農(nóng)墾國有土地使用權(quán)確權(quán)登記發(fā)證任務(wù)基本完成。全國35個墾區(qū)中，21個墾區(qū)已全面完成國有農(nóng)場辦社會職能改革。全國農(nóng)墾國有農(nóng)場中已完成辦社會職能改革任務(wù)的超過80%。公檢法、基礎(chǔ)教育機構(gòu)、基本醫(yī)療和公共衛(wèi)生機構(gòu)等三項改革任務(wù)已基本完成。農(nóng)墾國有土地確權(quán)率、發(fā)證率基本達到預(yù)期目標(biāo)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析

將成功建立的黑色素瘤野生型和耐藥型細胞株用4℃預(yù)冷的1×PBS漂洗細胞2～3遍,加入Trizol。將樣本送公司進行RNA測序(華大基因,中國)。將結(jié)果進行兩組間基因表達水平分析、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、GO/KEGG富集分析、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析、基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,從而得到耐藥后黑色素瘤RNA轉(zhuǎn)錄水平變化的結(jié)果。用Trizol(Invitrogen)從骨髓間充質(zhì)干細胞中分離總RNA。cDNA文庫使用BGISEQ-500平臺(華大基因,深圳,中國)進行擴增和測序。使FastQC(版本0.11.8)檢查原始測序讀數(shù)。通過Cutadapt(v2.0)對適配器修剪和低質(zhì)量濾波進行分析,得到干凈的數(shù)據(jù)。采用featurets(v1.6.0)軟件對基因表達進行量化,采用DESeq2(R版本3.3.2)軟件創(chuàng)建處理組間差異表達基因。采用折次變化臨界值≥1.5,調(diào)整P值≤0.05。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析

古人有詩云：“綠蟻新醅酒，紅泥小火爐，晚來天欲雪，能飲一杯無？”嚴寒冬日的晚上，無論是約三五好友，還是獨自一人，守著熱氣騰騰的火鍋，喝兩杯小酒，那都是一件心曠神怡的事情。不過，吃火鍋可絕對不是中國人的專利，在外國許多地方也是有火鍋的，而且五花八門，各具特色，非常有意思。

在黑色素瘤細胞裂解液中,加入YAP蛋白質(zhì)單克隆抗體,混旋儀4 ℃孵育過夜,加入適量PierceTMProteinA/G Magnetic Beads,置于4 ℃混合儀,旋轉(zhuǎn)孵育2～4 h。將離心管置于磁力架上,靜止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,棄上清。加入4 ℃預(yù)冷的NP-40蛋白裂解液去除磁珠上未結(jié)合的蛋白質(zhì),棄上清。加入100 μL 1×loading buffer重懸管中的磁珠。混勻,煮沸10 min,冷卻。將離心管置于磁力架上,靜止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,取上清進行WB,SUMO一抗孵育全膜,檢測SUMO化修飾。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB)

采用WB檢測不同處理因素對A375細胞蛋白質(zhì)水平的影響。收集不同處理因素的細胞,使用RIPA強裂解液進行裂解,提取總蛋白質(zhì),采用超微量紫外-可見分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度;每個樣品取50 μg總蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜]后用5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉/洗膜緩沖液(TBST緩沖液)室溫搖床封閉1 h,一抗結(jié)合4 ℃冰箱過夜;TBST洗滌3次后進行二抗結(jié)合并在室溫搖床孵育1 h,TBST洗滌3次;加入增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL),顯色1.5～2 min,采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

HCC AM伴IVCTT患者臨床可表現(xiàn)為腰痛。影像學(xué)表現(xiàn)可表現(xiàn)為腎上腺區(qū)占位伴隨下腔靜脈內(nèi)充盈缺損，而缺乏肝臟原發(fā)腫瘤的表現(xiàn)?；蛘吣I上腺轉(zhuǎn)移瘤與肝臟病變分界不清。當(dāng)影像學(xué)檢查同時發(fā)現(xiàn)肝臟病變和腎上腺病變時，常不易辨別原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶。泌尿系增強CT或MRI亦有誤診可能。診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為活檢或手術(shù)切除后的病理確診?；颊呒韧范嘤胁《拘愿窝赘腥静∈?。

1.3 SENP1基因敲除細胞系構(gòu)建

本研究使用第三代慢病毒包裝體系,在HEK293T細胞系中包裝,經(jīng)過表達鑒定之后,使用0.1 mg/L PEG 8000濃縮,之后按照體積比1∶100加入病毒液和polybrene (8 μg/mL)感染黑色素瘤細胞。感染后12 h更換培養(yǎng)基。48 h后換入含puromycine的新鮮培養(yǎng)基,篩選14 d建立穩(wěn)定表達細胞系。所有細胞經(jīng)過WB檢測YAP蛋白(Yes associated protein,YAP)的含量。

1.4 SENP1對YAP的SUMO化修飾

采用RT-qPCR對對照組和實驗組中的目標(biāo)基因的mRNA水平進行驗證,檢測是否符合轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DTIC處理8個月后顯著提升了黑色素瘤細胞的耐藥性

多功能微孔板檢測儀(Synergy HTX,Biotek,美國)、凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+,Bio-rad,美國)、流式細胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences,美國)、實時定量PCR儀(QuantStudioTM3 Real-Time PCR System,ABI,美國)。

圖1 黑色素瘤耐受性細胞株與對照組的差異

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析揭示類泛素特異性蛋白酶SENP1在耐藥細胞株中表達量提升

為進一步發(fā)掘DTIC耐受細胞中參與耐受機制相關(guān)的基因及信號通路,本研究針對耐藥型的黑色素瘤細胞系A(chǔ)375-DR、M14-DR以及對照組A375-WT及M14-WT進行了轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析(各包含3個生物學(xué)重復(fù))。如圖2A所示,轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),相比對照組,黑色素瘤耐藥性細胞株中有51個顯著上調(diào)及61個顯著下調(diào)的基因(fold change≥2,P<0.05)。類泛素蛋白質(zhì)修飾分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)是一類小泛素樣蛋白質(zhì)修飾物。其中,SENP1是泛素化和去泛素化過程中所需的關(guān)鍵蛋白酶,影響細胞周期、細胞增殖和凋亡狀態(tài),也是研究最深入并與腫瘤密切相關(guān)的SUMO化蛋白酶[7]。之前已有報道[8]表明SENP1與黑色素瘤的發(fā)生相關(guān),而本文研究轉(zhuǎn)錄物組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SENP1在耐受細胞株中發(fā)生了顯著上調(diào)(圖2A紅色箭頭所示)。通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析對差異基因進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)差異基因聚集于多個代謝途徑(圖2B)。其中,Hippo信號通路參與調(diào)控細胞生長、增殖、存活、遷移、分化等關(guān)鍵過程,在器官發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用[9]。其中,Hippo信號通路的關(guān)鍵基因YAP在DTIC耐受細胞株中同樣出現(xiàn)顯著上調(diào)。Vittoria等[10]發(fā)現(xiàn)Hippo抑制通路的失活可促進黑色素瘤發(fā)展。而在筆者團隊先前的研究[11]中,也發(fā)現(xiàn)YAP的激活有助于黑色素瘤的失巢凋亡抵抗和轉(zhuǎn)移。

圖2 對照組和耐藥性A375及M14細胞的全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq結(jié)果

2.3 Rt-qPCR及WB分析

為進一步驗證轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到的可能與黑色素瘤耐藥性相關(guān)的重要基因及信號通路,本研究采用Rt-qPCR及WB分析驗證SENP1、YAP在不同細胞株中的表達情況。Rt-qPCR結(jié)果如圖3A及3B所示,無論對于A375還是M14黑色素瘤細胞株,耐受株的SENP1、YAP表達水平都出現(xiàn)顯著上調(diào)。其中,A375耐受株(A375-DR)相比對照組(A375-WT),SENP1相對表達量提升了2.2±0.12倍(P<0.001)而YAP相對表達量提升了0.7±0.1倍(P<0.01);相比對照組(M14-WT),M14耐受株(M14-DR)的SENP1相對表達量提升了1.7±0.14倍(P<0.001)、YAP相對表達量提升了2.5±0.18倍(P<0.01)。WB檢測同樣證實了相似的結(jié)論(圖3C)。以上結(jié)果表明SENP1、YAP在耐藥細胞株中表達量的確提升,且有可能與黑色素瘤的耐藥性相關(guān)。

圖3 Rt-qPCR及WB分析SENP1及YAP在不同細胞株中的表達量

2.4 SENP1參與黑色素瘤耐藥性并對YAP存在泛素化調(diào)控

為進一步明確SENP1在黑色素瘤耐藥性中的作用,本研究構(gòu)建了表達空質(zhì)粒的細胞株A375-CT及SENP1敲除細胞株A375-SEKO,通過蛋白質(zhì)雜交確定A375-SEKO細胞株中SENP1的含量顯著下降(圖4A)。隨后,本研究測定了添加不同濃度DTIC下A375-CT和A375-SEKO的細胞活性。正如預(yù)期的那樣,盡管A375-CT和A375-SEKO的活力均隨著DTIC濃度的增加而下降,但A375-SEKO的活力下降速度明顯高于A375-CT(圖4B)。本文研究結(jié)果表明,SENP1參與了DTIC的耐受性的形成。最后,本文研究探究了SENP1與YAP之間是否存在相互作用?？紤]到SENP1是泛素化修飾蛋白質(zhì),因此我們探究了SENP1對YAP的泛素化修飾作用。如圖4C所示,YAP與泛素B(HA-Ub)孵育顯著提高了其泛素化修飾程度。然而,與HA-Ub和SENP1共孵育后,YAP的泛素化修飾程度降低,表明SENP1可能調(diào)節(jié)YAP的去泛素化修飾作用。

圖4 SENP1敲除后細胞株DTIC耐藥性變化及其對YAP的去泛素化調(diào)控作用

3 討論

黑色素瘤起源于黑色素細胞的基因突變,可在皮膚、眼睛、內(nèi)耳和軟腦膜中發(fā)現(xiàn)[12]。黑色素瘤約占所有皮膚惡性腫瘤的1%,是最具侵襲性和最致命的皮膚癌[13]。對于Ⅰ～Ⅲ B期黑色素瘤患者,手術(shù)是主要的治療方法,此外還包括化療、放射性治療、免疫治療、靶向治療等[14]。除了由于藥物缺乏特異性導(dǎo)致皮膚和消化道毒性產(chǎn)生的不良反應(yīng)外[15],因病灶對化療等產(chǎn)生的耐藥性同樣是黑色素瘤治療目前面臨的困境[16]。因此,研究黑色素瘤耐藥性的產(chǎn)生機制對于未來改善其化療治療效果具有重要意義。

收集廣東省惠州市第一人民醫(yī)院、惠州市中心人民醫(yī)院、惠州市第三人民醫(yī)院于2013年1月1日—2016年12月31日的面神經(jīng)炎住院患者合計882例作為研究對象。其中，惠州市第一人民醫(yī)院294例、惠州市中心人民醫(yī)院306例、惠州市第三人民醫(yī)院282例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依照中國特發(fā)性面神經(jīng)炎診治指南[1]。

黃連對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，這與以往文獻報道一致。當(dāng)用不同溶劑提取時，黃連對2種試驗菌的抑菌活性大小順序為醇提物＞50%醇提物＞水提物；把黃連分成非生物堿、多糖、總堿時，發(fā)現(xiàn)這3種組分均有抑菌活性，其中總堿的抑菌活性最強，多糖的抗菌活性較弱。進一步將總堿分離得到4種主要生物堿，其中小檗堿和黃連堿對2種試驗菌的活性較強，并且4種主要生物堿之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

蛋白質(zhì)泛素化修飾是維持底物蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要方式,對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用、亞細胞定位、基因轉(zhuǎn)錄的活性及靶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等具有重要的調(diào)節(jié)作用[17-18]。研究[19-20]表明,SENP1與腫瘤乏氧微環(huán)境、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移及多個信號通路的調(diào)控有關(guān)。除此之外,已有研究表明SENP1與腫瘤耐藥性相關(guān),如:Gao等[21]發(fā)現(xiàn)SENP1在肺癌細胞中異常過表達,且其過表達對愛拉斯汀或順鉑處理的肺癌細胞具有保護作用;Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn),在構(gòu)建的耐受伊立替康的人結(jié)腸癌細胞株中,SENP1蛋白質(zhì)大量積累;而SENP1的敲低降低了癌細胞的遷移能力,并再次觸發(fā)了其對伊立替康的敏感性。在本文研究中,發(fā)現(xiàn)SENP1在DTIC耐受的黑色素瘤細胞中表達量顯著上升,其很有可能在黑色素瘤的耐藥性中發(fā)揮了重要作用,本研究通過對其編碼基因進行敲除進一步確認了其與耐藥性的相關(guān)關(guān)系。

Hippo信號通路最先在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),在哺乳動物中具有高度保守性[9]。Hippo通路缺失或過度激活有可能導(dǎo)致細胞異常生長,進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)在肝癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種癌癥中Hippo通路相關(guān)基因通常發(fā)生異常表達并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。哺乳動物Hippo信號通路的核心成分包括細胞質(zhì)激酶模塊和核轉(zhuǎn)錄模塊。其中,YAP屬于核轉(zhuǎn)錄模塊,具有促癌功能。在本文研究中,轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到Hippo通路在黑色素瘤耐受細胞株中出現(xiàn)富集,表明該信號通路發(fā)生了顯著異常表達。其中,YAP表達的上調(diào)得到了Rt-qPCR及WB的驗證。通過泛素化修飾實驗驗證,本文證實了SENP1對YAP存在泛素化修飾作用。綜上,本文研究構(gòu)建了DTIC耐受的黑色素瘤細胞株并通過轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到了異常表達的SENP1基因及Hippo信號通路,證實了SENP1與黑色素瘤耐藥性相關(guān)并可調(diào)控YAP的泛素化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明趙蓓:實驗、撰寫及修改論文;施小琪、唐雪梅:數(shù)據(jù)處理及分析;程石:總體把關(guān),審定論文。