李甘 于妍妍 顧純林 楊淵

惡性腫瘤是威脅人類健康和導(dǎo)致死亡的主要原因之一。原發(fā)腫瘤的治療已經(jīng)取得了穩(wěn)定進(jìn)展,然而,原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)淋巴道,血管或體腔等途徑到達(dá)其他部位繼續(xù)生長,發(fā)生轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致約90%的惡性腫瘤患者死亡。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期,在腫瘤患者的外周血中已經(jīng)檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs),因而可將其作為液體活檢標(biāo)志物,對腫瘤的早期診斷、術(shù)后監(jiān)測以及評估腫瘤患者預(yù)后情況具有重要意義[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)有助于轉(zhuǎn)移的形成,因此是廣泛研究的主題[2],它作為轉(zhuǎn)移過程中的功能性生物標(biāo)志物,已用于科學(xué)研究和臨床應(yīng)用[3]。液體活檢區(qū)別于傳統(tǒng)活檢(手術(shù)活檢和穿刺活檢),它可以對分子或細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)和動(dòng)態(tài)分析,因此具有很大的診斷、預(yù)后、監(jiān)測疾病進(jìn)展和治療的潛力,并且也可以了解疾病藥物開發(fā)治療靶點(diǎn)的機(jī)制和鑒定[4-5]。大多數(shù)液體活檢方法包括從體液或外周血中富集靶標(biāo),然后對分離的目標(biāo)進(jìn)行表征和分析。CTCs的當(dāng)前分離和富集主要基于兩種方法：一種是基于CTCs的物理特征性質(zhì)(如尺寸[6],可變形性[7]),一種是基于免疫親和力的富集,通常需要借助于分子探針,如抗體[8],肽段[9]和適體[10],隨后通過熒光可視化,電化學(xué)和等離子體傳感等方法分離檢測CTCs,然后可以通過免疫染色,逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和測序等方法分析其分子生物標(biāo)志物(如蛋白質(zhì),DNA和RNA)[11,12]?，F(xiàn)已開發(fā)各種納米材料,納米結(jié)構(gòu)和分子探針用于CTCs的富集和分析,并已成功應(yīng)用于臨床,顯示了基于納米技術(shù)的液體活檢在早期診斷,動(dòng)態(tài)監(jiān)測,治療反應(yīng)評估和預(yù)后方面具有的極其重要意義[13]。下面討論了基于納米技術(shù)的液體活檢對循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲與檢測的進(jìn)展和突破。

2 基于納米技術(shù)的液體活檢的進(jìn)展和突破

2.1 基于納米結(jié)構(gòu)的分離與捕獲 納米結(jié)構(gòu)由于它們的納米尺寸大小及其形貌結(jié)構(gòu)類似于生物靶標(biāo),能夠通過增加生物材料接觸界面來增強(qiáng)捕獲效率。基于CTCs與血液中其他血細(xì)胞之間物理性質(zhì)的差異,納米多孔結(jié)構(gòu)已廣泛用于CTCs的分離[14]。有學(xué)者開發(fā)了一種用于捕獲CTCs的抗體功能化的電紡TiO2納米纖維(TiNF)基質(zhì)[15],與以前用于CTCs富集的垂直取向硅納米柱不同[16],TiNF水平包裝,更好的模仿嵌入支架中的納米結(jié)構(gòu)的水平方向,從而改善了細(xì)胞與納米結(jié)構(gòu)之間的親和力,利用抗EpCAM包被的TiNF底物,對結(jié)直腸癌和胃癌患者的外周血樣進(jìn)行了CTCs捕獲研究,結(jié)果顯示從3個(gè)病例中的2個(gè)樣品中捕獲到了CTCs,每0.5毫升結(jié)直腸癌患者的血液樣本中有0 ～ 2個(gè)CTCs,每0.5毫升胃癌患者血樣中有3～19個(gè)CTCs,這些結(jié)果證明了該平臺(tái)對CTCs捕獲的高靈敏度。

Hong等[17]在研究中提出了一種使用多功能磁性納米線(NWs)檢測CTCs的新策略,即使在癌癥的早期階段,它也能顯著提高從患者血液中分離CTCs的靈敏度和特異性。用抗體混合物修飾并且摻雜大量磁性納米顆粒(MNPs),旨在同時(shí)對捕獲的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別,分離和“肉眼”原位比色檢測,該方法的獨(dú)特之處在于NWs具有類似鉛筆的形態(tài),能夠消除血液中其他細(xì)胞元素(紅細(xì)胞和白細(xì)胞和血小板)的空間位阻,可以增加與CTCs接觸的頻率。此外,細(xì)長的幾何形狀不僅通過在細(xì)胞周圍纏繞NWs來確保細(xì)胞與NWs最大程度的附著,而且還提供用于靶向配體的多價(jià)結(jié)合位點(diǎn),平均長度為16 mm,直徑為200 nm的NWs足以通過生物素-鏈霉素相互作用來容納多種類型的抗體,實(shí)際上,上皮癌標(biāo)志物與典型的間充質(zhì)標(biāo)志物如EpCAM,EGFR,細(xì)胞表面糖蛋白(TROP-2),波形蛋白和鈣黏附蛋白的組合能夠鑒定出具有表型變異的CTCs群體,這會(huì)避免EpCAM陰性表達(dá)的CTCs的遺漏,從這個(gè)角度來看,他們所提出的使用多功能磁性納米線富集CTCs的策略是完全合理的。

2.2 納米生物界面提高特異性和靈敏度 特異性和靈敏度是生物檢測的兩個(gè)主要問題,特別是用于檢測復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)物時(shí),例如,從血液中的數(shù)十億正常血細(xì)胞中鑒定CTCs[18]。此外,還要有足夠的靈敏度能夠捕獲液體活檢的微小變化,這對于癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)的早期診斷和監(jiān)測至關(guān)重要?，F(xiàn)已經(jīng)應(yīng)用各種探針(如抗體,肽段,適體等)來改善生物檢測的特異性。同時(shí),也已開發(fā)出許多納米材料,如納米粒和氧化石墨烯及納米線和納米纖維等納米結(jié)構(gòu),以提高CTCs的捕獲能力[19]。如Peng等[9]對MNPs進(jìn)行了改進(jìn),他們用重新設(shè)計(jì)的肽段修飾了MNPs,這些肽段對CTCs上的標(biāo)記膜蛋白具有高度親和力(如EpCAM和Her-2),肽功能化的MNPs對CTCs具有很高的捕獲效率,對乳腺癌,前列腺癌和肝癌的CTCs的捕獲率達(dá)到90%以上,對Her-2陽性CTCs的捕獲率達(dá)到68%,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示修飾了高親和力肽段的MNPs可以提高檢測靈敏度。這些免疫物質(zhì)與新型納米材料和納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合,顯著改善了檢測CTCs的效率,已經(jīng)取得了很多臨床應(yīng)用,例如本課題組在四氧化三鐵磁性納米粒子(Fe3O4)表面逐步修飾二氧化硅(SiO2)及明膠(Gel)層,并進(jìn)一步與上皮細(xì)胞黏附分子適體(EpCAM Apt)連接,制得了一種能夠特異性捕獲痕量 CTCs 的免疫磁珠。利用單壁碳納米管(SWCNT)的類過氧化物酶活性以及非特異性DNA 序列對該活性的影響,構(gòu)建了一種納米比色探針,實(shí)現(xiàn)了對CTCs 的光學(xué)測定。進(jìn)一步將該比色探針應(yīng)用于對 CTCs 的定量檢測,可行性分析結(jié)果表明,MCF-7 細(xì)胞與免疫磁珠反應(yīng)后的上清液中存在被置換下來的 mDNA,因而加入SWCNT 比色探針后,652 nm 處的吸光度明顯增加,且不同濃度的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7) 引起的吸光度增加的程度也不同。因此,根據(jù)細(xì)胞加入前后所引起的 SWCNT 比色探針在652 nm 處的吸光度值的變化(△A),可以實(shí)現(xiàn)對 CTCs 的定量分析。在最佳條件下,該比色探針在 652 nm 處的吸光度值增加值(△A)與 MCF-7 細(xì)胞在 10～500/mL內(nèi)有較強(qiáng)的靈敏度,呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[20]。見圖1。

圖1 A. Fe3O4-SiO2-Gel/P1/mRNA的制備B. SWCNTs對CTCs的捕獲與檢測

2.3 納米探針提高檢測能力 基于免疫原性的捕獲是分離CTCs的最常見策略之一。這些標(biāo)志物包括癌癥特異性蛋白,如在各種上皮癌中高表達(dá)的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM),在肺癌,膠質(zhì)瘤,胃癌中高表達(dá)的表皮生長因子受體(EGFR),乳腺癌中高表達(dá)的表皮生長因子受體-2(Her-2)以及在前列腺癌中高度表達(dá)的重要診斷和預(yù)后標(biāo)志物前列腺特異性膜抗原(PSMA)和前列腺特異性抗原(PSA)[18,21-22]?？贵w、肽段和適體廣泛用于涂覆各種納米材料和納米結(jié)構(gòu),是最常見的捕獲檢測CTCs的探針[23-24]。例如,Bai等[25]報(bào)道的一種從頭設(shè)計(jì)的EpCAM識(shí)別肽,與抗體相比,它具有更好的穩(wěn)定性和更高的EpCAM親和力,他們使用靶向EpCAM的肽段功能化MNPs來捕獲CTCs,并達(dá)到90%以上的捕獲率。幾年后,該組又報(bào)道了一種對Her-2具有高度親和力的肽,并使用這種肽功能化MNPs,捕獲乳腺癌中的CTCs,捕獲效率達(dá)到68.56%～79.26%[9]。

由于癌癥的異質(zhì)性,生物標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。例如,上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)導(dǎo)致上皮標(biāo)志物的減少或丟失以及液體活檢標(biāo)記物中間質(zhì)標(biāo)志物的增加[26]。針對單一生物標(biāo)志物的技術(shù)可能導(dǎo)致有的CTCs不能被有效捕獲,在這方面,針對不同生物標(biāo)記物的多種探針的組合提供了相對較好的策略,因此提高了檢測能力[27-28]。除了基于免疫特異性分離CTCs的傳統(tǒng)方法外,還開發(fā)了一些新的捕獲方法,例如,Mirkin的小組開發(fā)了一種NanoFlare系統(tǒng),將球形金納米粒子功能化,其中密集排列的單鏈DNA單層(ssDNA),能夠靶向細(xì)胞內(nèi)mRNA,并且ssDNA與Cy5標(biāo)記的短鏈DNA補(bǔ)體雜交,熒光由于其相互接近而發(fā)生猝滅現(xiàn)象[29],當(dāng)與靶mRNA結(jié)合后,補(bǔ)體被置換,從而熒光得以恢復(fù),NanoFlare系統(tǒng)與流式細(xì)胞儀分析相結(jié)合,可以應(yīng)用于乳腺癌CTCs的檢測和分子分析[30]。

2.4 基于納米結(jié)構(gòu)的檢測與分析：MNPs是用于檢測CTCs的最早和最經(jīng)典的納米材料之一。最具代表性的例子是CellSearch系統(tǒng),它是迄今為止美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸直腸癌患者的診斷和預(yù)后效果的惟一系統(tǒng)。由于納米顆粒的尺寸小,因此慢的磁響應(yīng)和高損失率已成為MNPs的問題。為了解決這些問題,Wen等[31]通過逐層(LBL)組裝方法構(gòu)建的磁性納米球(MNs)能夠有效控制納米球的大小和磁響應(yīng),在聚苯乙烯/丙烯酰胺共聚物納米球(Pst-Aam-COOH)的表面上組裝五層疏水性納米γ-Fe2O3以獲得快速磁響應(yīng),并且在外層引入二氧化硅以增加穩(wěn)定性并減少納米球的聚集,使用乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3作為模型系統(tǒng)摻入健康人血液中,用抗EpCAM功能化的MNs與CTCs孵育5 min,結(jié)果產(chǎn)生高于94%的捕獲效率,且分離的CTCs存活率保持在(90.5±1.2)%,并可對CTCs進(jìn)行再培養(yǎng),PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)分析后證明了該方法的良好再現(xiàn)性和可靠性,最后LBL-MNs成功將患有結(jié)腸癌,肝癌,肺癌或乳腺癌的患者與健康個(gè)體區(qū)分開來,顯示該材料可用于分析臨床樣品。MNPs還可涂覆其他材料,例如碳納米材料,以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和生物相容性,以防止磁芯氧化和降解,從而保持高磁性。例如,使用石墨涂層的MNPs微陣列檢測CTCs,穩(wěn)定且生物相容性良好的石墨涂覆的MNPs,是從像全血這樣的復(fù)雜系統(tǒng)中富集CTCs的良好工具[32]。MNPs也可用細(xì)胞膜包被,以減少血液中雜質(zhì)如正常血細(xì)胞的非特異性結(jié)合,從而改善分離方法和技術(shù)的特異性。例如,用工程白細(xì)胞膜(通過溫和有效的化學(xué)裝飾EpCAM抗體)涂覆Fe3O4磁性納米團(tuán)簇(MNCs)[33],用于從血液中富集CTCs,白細(xì)胞膜功能化的MNCs由于其與白細(xì)胞的同源性,而在遇到白細(xì)胞時(shí)會(huì)被排斥[34],因此白細(xì)胞的非特異性吸附顯著降低,結(jié)果90%的CTCs可以在15 min內(nèi)從全血中捕獲。

除了MNPs之外,其他納米材料如石墨烯/氧化石墨烯(GO)[35],金納米粒子[36]和硅納米線[37]也被用于生物檢測。眾所周知,納米結(jié)構(gòu)材料通過在納米尺度的形貌上提供增加的界面來改善細(xì)胞附著,以便細(xì)胞黏附[38]。這些納米結(jié)構(gòu)的材料,當(dāng)用免疫原性物質(zhì)功能化時(shí),可以作為生物檢測的理想支架。有學(xué)者使用3D納米結(jié)構(gòu)聚二甲基硅氧烷(PDMS)底物,利用特異性識(shí)別EGFR的適體捕獲CTCs,與玻璃載玻片或普通PDMS相比,CTCs捕獲靈敏度提高了2倍[39]。由于其納米紋理形態(tài)和易于修飾的化學(xué)性質(zhì),GO在CTCs的鑒定中獲得了很多關(guān)注。Yoon等[40]開發(fā)了涂有EpCAM抗體功能化GO納米片的圖案化金表面,并將其用于鑒定來自轉(zhuǎn)移性乳腺癌,轉(zhuǎn)移性胰腺癌和早期肺癌的血液中的CTCs,GO納米片通過靜電吸引吸附在圖案化的金表面上,隨后通過親和素和生物素相互作用,用生物素化的EpCAM抗體功能化,能夠以高靈敏度捕獲低濃度的CTCs,結(jié)果顯示了GO材料在液體活檢中的潛力。

2.5 光敏與熱敏納米平臺(tái)探索CTCs的檢測與診斷 光敏納米顆粒是癌癥治療和診斷的常見材料之一。這些響應(yīng)型納米粒子已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究,能夠產(chǎn)生患病細(xì)胞的獨(dú)特視覺圖像。 一些研究人員開發(fā)了多種成像探針,這些探針采用熒光技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)等技術(shù)[41]進(jìn)一步達(dá)到檢測的目的。但是,CTCs 診斷需要特殊的技術(shù)才能為診斷干預(yù)提供準(zhǔn)確的結(jié)果。因此,許多研究小組使用了納米復(fù)合材料,當(dāng)用于CTCs時(shí),它們能夠產(chǎn)生清晰的結(jié)果。這種基于納米的方法被稱為“金納米火炬”,它可以通過基于基因特征的上皮標(biāo)記,靶向上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Vimentin 和纖連蛋白)以及 E-鈣粘蛋白。具體方案是利用金納米顆粒(AuNPs)提供一個(gè)用于熒光激發(fā)的外場來增強(qiáng)熒光,然后制備合適的金屬熒光探針,通過與CTCs特征性的競爭結(jié)合,從而釋放熒光團(tuán)來診斷CTCs[42]。另用預(yù)先雜交的核苷酸標(biāo)記上熒光分子,如果目標(biāo)序列與探針序列互補(bǔ),則可以啟動(dòng)熒光標(biāo)記的DNA序列,以讀出CTCs中的目標(biāo) DNA。這種基于納米平臺(tái)的熒光探針可用于有效檢測CTCs中的 mRNA。另一方面,采用近紅外激發(fā)成像的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP)也已用于基于光敏的 CTCs 診斷?？紤]到這一原理,Fang 等[43]使用 UCNPs 對CTCs進(jìn)行成像,他們利用靶向 PTK-7 的適體連接的 NaYF4(Yb：Er)UCNPs 靶向癌細(xì)胞,以證明熒光強(qiáng)度與血樣中摻入的 PTK-7 陽性 CCRF-CEM 細(xì)胞數(shù)量之間存在線性關(guān)系。其成功地結(jié)合了超順磁性 Fe3O4納米粒子的磁性富集,從而觀察到10 mL血樣中摻入的10個(gè)細(xì)胞[43]。最終用顯微鏡將捕獲的細(xì)胞可視化,以觀察捕獲的細(xì)胞的性質(zhì)?；赟ERS的CTCs 檢測和分析技術(shù)也因其特異性而取得了重大進(jìn)展。例如,由涂銀的金納米棒(NR)與四種類型的拉曼響應(yīng)分子結(jié)合制成了四色SERS納米粒子。每個(gè)納米顆粒都與靶向 IGF-1,抗EpCAM,抗CD 44和抗角蛋白18(乳腺癌生物標(biāo)記物)的特異性抗體相連。在SERS探針混合物存在的情況下,用共聚焦拉曼顯微鏡觀察同一細(xì)胞上的四個(gè)標(biāo)記,每個(gè)報(bào)告基因的特征性 SERS 峰都可見。在此,這些信號(hào)為多色生物成像和CTCs 的檢測提供了出色的多路應(yīng)用性[44]。上述研究總結(jié)了各種用于檢測 CTCs的光敏納米材料,這些技術(shù)的優(yōu)勢使它們更有可能轉(zhuǎn)化為臨床用途。

另外,研究者們已經(jīng)開發(fā)出對溫度敏感的納米材料來提供另一種檢測思路。在許多情況下,已經(jīng)開發(fā)出了幾種針對 CTCs 的開發(fā)平臺(tái),因此,溫度敏感性在癌癥研究中的相關(guān)性已成功應(yīng)用于 CTCs 的靶向和診斷。最近開發(fā)的熱敏 NanoVelcro CTCs 純化平臺(tái)可用于純化非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)受試者的CTCs[45]。隨后通過調(diào)節(jié)流速,表面化學(xué)成分和加熱-冷卻循環(huán)來優(yōu)化此技術(shù)的實(shí)際使用。使用生理學(xué)上可受的刺激溫度可確保操作參數(shù)對CTCs的破壞很小,從而確保了CTCs的高活力,且其細(xì)胞形態(tài)和分子完整性不受干擾。此外,他們成功地證明了通過該技術(shù)純化的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增和突變分析。還值得注意的是,他們同時(shí)采用 NanoVelcro 系統(tǒng)的溫度敏感性和下游突變分析來觀察NSCLC患者的病情發(fā)展,強(qiáng)調(diào)其在NSCLC治療中的轉(zhuǎn)化價(jià)值。Retegui 等[46]設(shè)計(jì)了另一種新穎的對溫度敏感的納米診斷策略,他們生產(chǎn)了一種基于雙模式明膠的材料, 該材料對溫度敏感,并利用熱響應(yīng)性釋放納米材料以用于診斷。他們采用了機(jī)械策略來實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞回收,但是其策略的最重要方面是使用溫度敏感性來進(jìn)行 CTCs 的總體回收。通過逐層沉積來制造材料涂層,其中生物素和鏈霉親和素的特征性結(jié)合為該釋放技術(shù)提供了框架。用明膠和生物素分子修飾血漿活化的PDMS表面,其中使用鏈霉親和素修飾使納米涂層結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。明膠形成獨(dú)特的分子間α-螺旋結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)在明膠分子與水分子之間具有可逆的氫鍵。該技術(shù)在納米涂層內(nèi)引發(fā)了一定程度的響應(yīng)性。溫度>37℃可使納米涂層從表面迅速塌陷,并已成功用于鑒定 EGFR 和 PIK3CA 癌基因突變的 CTCs。為確保有效性,微流控芯片通過納米涂層功能化,并暴露于摻有CTCs的外周血中,此過程的捕獲效率約為 96%[46]。熱響應(yīng)平臺(tái)已被證明是有效的技術(shù)之一,但仍需要大量研究來微調(diào)此策略,以幫助CTCs 檢測平臺(tái)的優(yōu)化構(gòu)建。由于這些響應(yīng)平臺(tái)已在人類受試者中證明了高度的安全性,因此如果對使用熱響應(yīng)納米材料的 CTCs 診斷進(jìn)行更多的研究,將是安全且明智的做法。

3 結(jié)論

鑒于血液中CTCs的精確計(jì)數(shù)可以為轉(zhuǎn)移性癌癥的進(jìn)展提供有價(jià)值的臨床見解,迫切需要實(shí)現(xiàn)高度靈敏和可靠的CTC檢測的技術(shù)。如本綜述所總結(jié)的,納米技術(shù)在液體活檢中占有重要地位,近幾十年來取得了很大進(jìn)展。參與生物檢測的納米技術(shù)已經(jīng)從單個(gè)納米材料或納米結(jié)構(gòu)演變?yōu)榧傻募{米平臺(tái)和設(shè)備,能夠以高靈敏度和特異性實(shí)現(xiàn)CTCs的多功能和高通量分析。

盡管新興的CTCs檢測方法正在以指數(shù)的速度在發(fā)展,但仍然需要廣泛的臨床驗(yàn)證,由于CTCs的捕獲與檢測對癌癥診斷和預(yù)后具有深遠(yuǎn)的潛在影響,科學(xué)界正期待著一個(gè)用于CTCs的納米無創(chuàng)平臺(tái),該平臺(tái)將在未來幾年內(nèi)被接受用于臨床,最終實(shí)現(xiàn)對患者的早期診斷,預(yù)后評估以及個(gè)體化治療。