張珂珂 黃國寶

嚴(yán)重?zé)齻且粋€(gè)復(fù)雜的病理生理過程,可導(dǎo)致多種器官功能障礙[1-3]。美國的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查表明,在全身面積>30%的嚴(yán)重?zé)齻颊咧?急性肺損傷(ALI)是最常見的并發(fā)癥,其發(fā)病率為26.7%～45%,死亡率為40%～60%[4-5]。ALI通常發(fā)生在燒傷后24～48 h內(nèi),主要表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管屏障受損、組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激損傷[6-7]。其中,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在ALI中扮演了重要的角色[8]。研究證明,miRNA作為炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,被認(rèn)為是改善ALI的潛在治療靶點(diǎn)[9]。例如,miR-135a-5p通過靶向TBK1進(jìn)而調(diào)控ALI相關(guān)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。研究證明, miRNA-429降低與肺組織損傷密切相關(guān),抑制miRNA-429表達(dá)能夠明顯降低炎性細(xì)胞因子的分泌,對(duì)肺損傷具有一定的保護(hù)作用[11]。另外,Fan等[12]證實(shí),過表達(dá)miRNA-429能夠提高氧化應(yīng)激相關(guān)分子SOD和CAT含量。以上結(jié)果顯示,miRNA-429在炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。本研究旨在明確miR-429在燒傷模型小鼠中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步探討miR-429對(duì)燒傷小鼠ALI的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只6～8周齡C57BL/6小鼠均購買于上海南方模式生物科技有限公司,許可證號(hào)為KYXK(滬)2023-0005,體重為200～250 g,購入后于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng),飼養(yǎng)濕度約55%～60%,溫度23～25℃,12 h晝夜光照循環(huán),正常進(jìn)食和自由飲水。待C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理與福利委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 MDA檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒、 GSH檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒以及IL-8 ELISA試劑盒均購自武漢艾美捷科技有限公司;EASYspin Plus 快速RNA提取試劑盒購自杭州昊鑫生物公司;Hifair?Ⅲ One Step RT-qPCR SYBR Green試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、RIPI組織裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TUNEL試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;Nrf2抗體、HO-1抗體、GAPDH抗體以及HRP標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司;miR-429 antagomir及其陰性對(duì)照由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供。熒光定量PCR儀購自美國Roche公司;低溫高速離心機(jī)、化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀均購自美國Thermo Fisher公司;熒光顯微鏡觀察購自日本奧林普斯公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建小鼠燒傷模型：根據(jù)楊星等[13]報(bào)道,采用熱水燙傷法構(gòu)建小鼠燒傷模型。用30 mg/kg的戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)麻醉,將小鼠背部毛發(fā)剃除后,然后將其固定在自制的模板裝置上。隨后將熱水(100℃)倒在小鼠皮膚的背表面上10 s造成深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面。其中,全層皮膚燒傷平均占全身表面積的30%。

1.3.2 動(dòng)物分組與處理：24只C57BL/6小鼠隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組和miR-429 抑制劑組,每組6只。其中,模型組、陰性對(duì)照組和miR-429 抑制劑組小鼠通過熱水燙傷法構(gòu)建小鼠燒傷模型。另外,根據(jù)殷佳娜等[14]的給藥方式,在術(shù)前3 d,miR-429 抑制劑組和陰性對(duì)照組按20 μg/只的劑量分別通過尾靜脈注射miR-429 antagomir慢病毒和陰性對(duì)照miR-NC,1次/d,持續(xù)3 d;對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模成功12 h后處死,取右肺下葉組織,以備待用。

1.3.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肺組織中miR-429表達(dá) 根據(jù)Trizol裂解液說明書,提取肺組織中的總RNA。采用紫外吸收法測(cè)定RNA的純度和濃度,使用EASYspin Plus 快速RNA提取試劑盒按照說明書反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。隨后,按照Hifair?III one step RT-qPCR SYBR green 試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。其中以miR-429 (正向：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTA

TT-3’,反向： 5’-CGCGCGTAATACTGTCTGGTAA-3’)和U6 (正向： 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,反向： 5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’)為引物,擴(kuò)增miR-429。RT-qPCR反應(yīng)條件如下：逆轉(zhuǎn)錄：預(yù)變性：95℃,5 min;擴(kuò)增：95℃,10 s;60℃,30 s,共40個(gè)循環(huán)。最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-429的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT和GSH表達(dá)：收集各組小鼠100 mg肺組織,按照試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT和GSH含量。

1.3.5 HE染色觀察小鼠肺損傷情況：將肺組織切割成3 mm3大小的組織塊,用4%的多聚甲醛固定組織樣本48 h后,石蠟包埋,切片(厚度為5 μm)。隨后,將切片浸入到二甲苯和乙醇中。待切片脫水后,用蘇木精和伊紅染色液染色,樹膠封片。最后使用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)變化。其中,細(xì)胞核呈藍(lán)色,而細(xì)胞漿呈粉紅色或紅色。

1.3.6 TUNEL法檢測(cè)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況：將制備的石蠟切片經(jīng)梯度乙醇水合后,用無DNase的蛋白酶K孵育10 min。3% H2O2溶液中室溫孵育20 min,然后與TUNEL反應(yīng)液在37℃孵育1 h。最后,用PBS清洗切片并通過熒光顯微鏡觀察TUNEL陽性細(xì)胞。使用Image J軟件對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.7 Western blotting檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)：用RIPA組織裂解液(含1% PMSF)于冰上充分裂解肺組織,用4℃預(yù)冷的離心機(jī)以12 000 r/min離心20 min,取上清并使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。隨后,加入5×loading buffer,100℃煮沸10 min,使蛋白變性。將等量總蛋白用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離,隨后將凝膠轉(zhuǎn)移至經(jīng)活化的PVDF膜上進(jìn)行電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,3%的BSA溶液室溫封閉1 h。然后將蛋白膜與一抗4℃孵育過夜。其中一抗的稀釋比均為1∶1 000。TBST清洗后用HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。PBS洗滌3次后,使用ECL顯影液曝光蛋白,Image J軟件分析條帶,檢測(cè)各組小鼠肺組織中Nrf2、HO-1和GAPDH蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠肺組織中miR-429表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,miR-429在模型組小鼠肺組織中高表達(dá)(P< 0.05);與模型組比較,miR-429在陰性對(duì)照組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與陰性對(duì)照組比較,miR-429在抑制劑組中的表達(dá)明顯下降(P< 0.05)。見表1。

表1 4組小鼠肺組織中miR-429和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)比較 n=6,

2.2 4組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)均顯著升高 (均P< 0.05)。與模型組相比,陰性對(duì)照組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)均無明顯差異(均P> 0.05)。與陰性對(duì)照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)均顯著降低 (P< 0.05)。見表1。

2.3 4組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH含量比較 與對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織中MDA含量顯著升高,而SOD、CAT和GSH含量均明顯下降(P<0.05)。與模型組相比,陰性對(duì)照組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH含量均無明顯差異(P>0.05)。與陰性對(duì)照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中MDA含量顯著降低,而SOD、CAT和GSH含量均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH表達(dá)比較 n=6,nmol/mg,

2.4 4組小鼠肺組織病理學(xué)變化比較 在對(duì)照組中,小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組比較,模型組小鼠的肺泡壁變寬,出現(xiàn)水腫和明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與陰性對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織的病理結(jié)構(gòu)無明顯變化。與陰性對(duì)照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中的炎癥和水腫情況得到明顯緩解,且肺泡壁變窄。見圖1。

圖1 4組小鼠肺組織HE染色(HE×100)

2.5 4組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高 (P< 0.05)。與模型組比較,陰性對(duì)照組小鼠肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P> 0.05)。與陰性對(duì)照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P< 0.05)。見圖2,表3。

圖2 4組小鼠肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較;綠色為TUNEL陽性細(xì)胞,藍(lán)色細(xì)胞核;標(biāo)尺=40 μm

表3 4組小鼠肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)以及Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)比較n=6,

2.6 4組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著降低 (P< 0.05)。與模型組相比,陰性對(duì)照組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)無明顯差異(P> 0.05)。與陰性對(duì)照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3,表3。

圖3 4組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)表達(dá)

3 討論

ALI是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病,其癥狀包括肺微血管通透性增加,以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起的彌漫性肺間質(zhì)和肺泡腔水腫。ALI是大面積深度燒傷患者最常見的并發(fā)癥,特別是在合并吸入性損傷、休克和延遲復(fù)蘇時(shí)[15]。因此,如何防治ALI對(duì)燒傷患者的治療具有重要的臨床意義。

文獻(xiàn)顯示,miR-429在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠ALI模型和LPS刺激的細(xì)胞損傷模型中表達(dá)上調(diào),而抑制miR-429表達(dá)可改善LPS小鼠的肺損傷[16-17]。與上述研究一致,我們?cè)跓齻T導(dǎo)的ALI小鼠的肺組織中觀察到高表達(dá)的miR-429。提示miR-429或許對(duì)燒傷誘導(dǎo)的ALI發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能,抑制miR-429表達(dá)能夠減輕燒傷小鼠肺組織損傷。因此,為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們利用慢病毒載體miR-429 antagomir通過尾靜脈注射的方式降低小鼠體內(nèi)miR-429表達(dá)。本結(jié)果顯示,燒傷小鼠給予miR-429 antagomir干預(yù)后,其肺組織中miR-429 表達(dá)顯著下調(diào)。燒傷后,微血管通透性的升高會(huì)導(dǎo)致液體滲漏和微循環(huán)灌注異常,進(jìn)而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。炎性介質(zhì)升高會(huì)引誘內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS,從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。受損的內(nèi)皮細(xì)胞反過來增加血管通透性,促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),從而惡化并引發(fā)額外的肺損傷[18]。因此,炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激在燒傷誘導(dǎo)的ALI中起著核心作用。本研究中,燒傷小鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1 β和IL-6水平明顯升高,TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增加。同時(shí),氧化應(yīng)激相關(guān)分子發(fā)生明顯改變,即MDA含量明顯升高,而SOD、CAT和GSH酶活力顯著降低。然而,當(dāng)燒傷小鼠下調(diào)miR-429表達(dá)后能夠逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果。提示miR-429對(duì)燒傷小鼠的肺損傷具有一定的保護(hù)作用。miR-429對(duì)燒傷小鼠肺組織的保護(hù)作用也在肺相關(guān)的病理學(xué)觀察中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。HE染色顯示,燒傷小鼠肺泡壁變寬,出現(xiàn)水腫和明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而抑制miR-429表達(dá)后肺組織病變明顯減輕?？傊?抑制miR-429表達(dá)能夠減少燒傷誘導(dǎo)的ALI中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)。

NRF2/HO-1信號(hào)參與抗氧化和抗炎過程,能夠減少線粒體損傷,調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞死亡,在多種疾病的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用,如肺部疾病、心血管疾病和神經(jīng)疾病等[19]。先前的研究表明,Nrf2/HO-1軸通過下調(diào)炎性因子,降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px水平,參與了白藜蘆醇誘導(dǎo)的心肌缺血再灌注損傷小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激[20]。上述研究表明,Nrf2/HO-1軸具有抗炎和抗氧化活性。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在燒傷小鼠肺組織中Nrf2/HO-1信號(hào)通路被明顯激活,而降低miR-429表達(dá)能夠明顯抑制Nrf2/HO-1信號(hào)通路的活性。提示miR-429對(duì)燒傷小鼠肺組織的保護(hù)作用可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路密切相關(guān)。因此,在接下來的實(shí)驗(yàn)中我們將通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制劑Nrf2/HO-1-IN-1,來進(jìn)一步驗(yàn)證miR-429對(duì)Nrf2/HO-1通路的調(diào)控作用。

綜上所述,miR-429低表達(dá)能夠明顯提高燒傷小鼠肺組織SOD、CAT和GSH活性并降低 MDA 含量,降低 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平,同時(shí)提高 Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量,提示抑制miR-429表達(dá)具有抑制燒傷小鼠肺組織炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用,其機(jī)制可能與激活 Nrf2/HO-1 通路有關(guān)。