姜學(xué)敏，張 虹,2，高 慧，蔡雨情，趙 雷, ，薛 鵬,2,

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生檢測(cè)檢驗(yàn)中心，山東濰坊 261053）

黃酒與葡萄酒、啤酒并稱世界三大古釀造酒[1]。黃酒是用糧食為原料加酒曲釀制而成。酒曲主要分為米曲和麥曲，其中麥曲包括生麥曲和熟麥曲。長(zhǎng)久以來，中國(guó)南方地區(qū)的黃酒多以當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的稻米為原料，加以米曲或麥曲釀制而成，尤以紹興地區(qū)的黃酒最為出名。而中國(guó)北方地區(qū)的黃酒多以黍米、高粱等谷物為原料，加以麥曲釀制而成，其中山東地區(qū)使用陳伏曲釀造的即墨老酒以其“紅褐透明、微苦焦香、后味深長(zhǎng)、盈盅不溢”的獨(dú)特風(fēng)格而聞名[2]。陳伏曲是選用優(yōu)質(zhì)小麥在三伏天自然發(fā)酵而成的生麥曲，它也常為中醫(yī)所用，被譽(yù)為“神曲”[3]。不同于葡萄酒和啤酒，我國(guó)將黃酒應(yīng)用于中藥由來已久，《長(zhǎng)沙藥解》中就提到黃酒具有“辛溫升發(fā)，溫血脈而消寒澀”之功效，尤其適于婦女和老年人飲用。

黃酒中除了含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有許多活性成分，如多肽、多糖、有機(jī)酸、多酚等[4-7]。另外，黃酒余韻悠長(zhǎng)的風(fēng)味特點(diǎn)來自于酒體中豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的風(fēng)味來源于黃酒中的醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)，例如苯乙醇、異戊醇、異丁醇、乙酸苯乙酯等[8-10]。除此之外，劉少璞等[11]采用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)到黃酒中也含有揮發(fā)性酸類物質(zhì)，其含量占總揮發(fā)性物質(zhì)總量的6.0%?？傮w來說，大多數(shù)研究集中在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)上，但是對(duì)于非揮發(fā)性的物質(zhì)檢測(cè)報(bào)道較少。在釀酒原材料的選擇上，基本以糧食的籽粒為主，包括糯米、小麥、高粱等，也有學(xué)者采用藜麥籽粒為原料進(jìn)行發(fā)酵，得到風(fēng)味口感較好的藜麥黃酒以及藜麥啤酒[12-13]；另外，黃月等[14]采用青稞麩皮作為原材料進(jìn)行釀酒，結(jié)果表明青稞麩皮的加入對(duì)黃酒風(fēng)味的形成有積極意義。但由于麩皮常被用來當(dāng)作飼料，所以對(duì)于麩皮釀酒的研究少之又少，更沒有利用藜麥麩皮釀酒的先例。而研究表明，藜麥麩皮富含多種營(yíng)養(yǎng)成分以及植物化學(xué)物質(zhì)[15-16]，包括黃酮[17]、皂苷[18-19]等，而這些物質(zhì)具有良好的生物活性[20-23]。如果可以將其引入到黃酒當(dāng)中，不僅會(huì)增加黃酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也能提高藜麥麩皮的利用率。

目前來說，利用藜麥制成的產(chǎn)品主要包括藜麥啤酒、藜麥面包、藜麥植物蛋白飲料、藜麥功能性酸奶[24-26]等，而對(duì)于利用藜麥麩皮制成的產(chǎn)品卻始終處于起步階段。因此，為了填補(bǔ)藜麥麩皮黃酒產(chǎn)業(yè)的空白，也為了提升藜麥麩皮的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性，本研究將以自制陳伏曲作為發(fā)酵曲，用高梁和豌豆作為原料，藜麥麩皮作為輔料釀造黃酒。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）對(duì)普通黃酒以及藜麥麩皮黃酒中的非揮發(fā)性化合物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析比較，測(cè)定兩種黃酒的抗氧化活性，探究加入藜麥麩皮對(duì)黃酒風(fēng)味、潛在活性的影響，也為高值化利用藜麥麩皮提供實(shí)踐及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥麩皮 內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司；高粱、豌豆 市售；陳伏曲 自制，于夏季伏天，取用普通小麥，將其碾碎，加水拌濕，制成約200 g 的圓餅狀曲塊，用特殊草葉包裹，置于麥稈中保存約1 個(gè)月，期間溫度保持在35 ℃，濕度70%，即成陳伏曲；碳酸氫鈉、氯化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、氯化亞鐵、維生素C、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫均為分析純，無水乙醇、無水甲醇、乙腈均為色譜純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸酶（ACT=25 KU/mg）上海麥克林生化科技有限公司；左旋多巴（L-Dopa）Sigma 公司；酒樣標(biāo)準(zhǔn)品 滕州中科譜分析儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)中的用水未經(jīng)特殊說明均為超純水。

Shimadzu GC 2030 氣相色譜儀、Shimadzu GCMS TQ8050NX 氣相色譜質(zhì)譜儀 日本島津公司；Ulti-MateTM3000 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Agilent GTA 120 原子吸收分光光度計(jì) 美國(guó)安捷倫科技公司；SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；PALLcascade 超純水制備機(jī) 濟(jì)南東岱科學(xué)器材有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥麩皮黃酒釀造工藝流程及技術(shù)要點(diǎn) 藜麥麩皮黃酒釀造工藝流程見圖1。將高粱用等體積的2 g/mL 碳酸氫鈉水溶液室溫密封浸泡48 h 去除種皮中大部分單寧以減少苦澀味，75 ℃下以2 倍體積水浸泡24 h。同時(shí)取等質(zhì)量豌豆，2 倍體積水浸泡24 h，隨后將兩者混合，加入2 倍體積水，600 W加熱至100 ℃后轉(zhuǎn)小火300 W 煮至完全糊化，呈糜狀，室溫冷卻至65 ℃?zhèn)溆?。將陳伏曲塊稍加焙炒出曲香后研成粉末，與煮糜后的原料和高溫滅菌后的藜麥麩皮混合攪拌均勻，藜麥麩皮的添加量為5%（w/w），同時(shí)以未加藜麥麩皮的作為對(duì)照，陳伏曲粉末的加入量為0.5%（w/w）。在30 ℃，濕度為70%的條件下主發(fā)酵7 d，28 ℃后發(fā)酵5 d。發(fā)酵結(jié)束后，在4 ℃條件下，8000 r/min 離心15 min，分離出酒糟，獲得的上清液即為黃酒原液。

圖1 黃酒釀造工藝流程圖Fig.1 Flow chart of Huangjiu brewing process

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 利用高粱與豌豆發(fā)酵的普通黃酒記為SP，利用高粱、豌豆與藜麥麩皮發(fā)酵的藜麥麩皮黃酒記為SPQ，每組設(shè)置三個(gè)平行樣品，分別記為SP1、SP2、SP3 和SPQ1、SPQ2、SPQ3。

1.2.3 黃酒的理化指標(biāo)及可能污染物測(cè)定

1.2.3.1 總糖 按照國(guó)標(biāo)GB/T 13662-2018《黃酒》中的方法測(cè)定。

1.2.3.2 可溶性固形物 按照國(guó)標(biāo)GB/T 13662-2018《黃酒》中的105 ℃恒重法測(cè)定?？偣绦挝锖繙p去總糖含量即為可溶性固形物的含量。

1.2.3.3 酒精度 按照國(guó)標(biāo)GB 5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.4 總皂苷 色譜條件[27]：C18色譜柱（YMC ODS-Pack，4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：202 nm；流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：乙腈；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫（流動(dòng)相B）：0.01 min 10%；5 min 10%，10 min 15%，15 min 20%，25 min 22%，35 min 28%，45 min 35%，50 min 40%，55 min 45%，60 min 60%，65 min 85%，70 min 10%。

首先，將齊墩果酸型皂苷標(biāo)準(zhǔn)品精確配制成不同濃度的溶液，分別過0.45 μm 濾膜后進(jìn)樣20 μL 于高效液相色譜中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=4992.7321X+848412.1171（R2=0.9998）。然后，吸取200 μL 酒樣，加入800 μL 乙醇充分混勻，3000 r/min 離心15 min，將上清液過0.45 μm濾膜，準(zhǔn)確進(jìn)樣20 μL，將出峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總皂苷含量[27]。

1.2.3.5 總酚酸 參照Xiao 等[28]的研究方法稍作改動(dòng)后測(cè)定。準(zhǔn)確稱取10 mg 沒食子酸對(duì)照品配制成不同濃度的對(duì)照液。各取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻后再加入2 mL10%的碳酸鈉溶液，定容至10 mL，75 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后750 nm 下測(cè)定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2 mL 酒樣按照上述方法進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚酸的含量。

1.2.3.6 重金屬離子 按照國(guó)標(biāo)GB 2762-2017《食品中污染物限量》中石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.7 黃曲霉毒素B1 根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.22-2016《食品中黃曲霉毒素B 族和G 族的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 黃酒中的非揮發(fā)性有機(jī)化合物測(cè)定 樣品處理：取300 μL 黃酒與700 μL 乙腈混勻，然后4 ℃，12000 r/min 離心15 min，取上清液用超純水稀釋10 倍，過0.45 μm 濾膜，于液相小瓶中備用。

色譜柱條件[29]：Waters Acquity UPLC BEH Amide 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相A：0.1%乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫（流動(dòng)相B）：0～5 min 1%，5～15 min 1%～40%，15～25 min 40%～1%，25～30 min 1%。

質(zhì)譜條件[30]：電噴霧離子源（ESI）；離子源電壓：3.2 kV；載氣體積流量：40 L/min；離子源溫度：320℃；裂解電壓：300 V；數(shù)據(jù)采集范圍：100～1500 m/z；采用Full MS-ddMS 模式在正負(fù)離子模式下掃描。

1.2.5 黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定 直接進(jìn)樣樣品處理：取1 mL 酒樣，加入2 mL 乙醇，然后4 ℃，12000 r/min 離心15 min，上清液過0.45 μm 濾膜，放置于20 mL 氣相小瓶中備用，進(jìn)樣量為4 μL。頂空進(jìn)樣樣品處理：取1 mL 酒樣，加入0.5 g 氯化鈉，放置于20 mL 氣相小瓶中備用，進(jìn)樣量為1000 μL。

根據(jù)王洪燕等[31]的方法確定色譜柱條件為CPWax 57 CB 毛細(xì)管柱（50 mm×0.25 mm，0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度：190 ℃；分流比：19:1；柱溫：38 ℃；載氣：99.999%氦氣；色譜柱流量：2 mL/min；程序升溫：38 ℃保持3 min，4 ℃/min 升至46 ℃，8 ℃/min 升至70 ℃，10 ℃/min 升 至150 ℃，15 ℃/min 升 至190 ℃保持10 min，10 ℃/min 升至200 ℃保持2 min。質(zhì)譜條件為電子電離源；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：195 ℃；溶劑延遲：3 min；采用Q3 Scan掃描方式。

定量方法：采用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量。采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，將白酒標(biāo)準(zhǔn)樣品（30 種白酒混標(biāo)）用20%的乙醇溶液稀釋100 倍，取2 mL 于氣相小瓶中，按照上述直接進(jìn)樣方法進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)樣品中測(cè)得物質(zhì)的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算酒樣當(dāng)中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的含量。

1.2.6 黃酒的抗氧化活性分析 將制得的兩種黃酒用超純水稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/mL 后，依次按照以下5 種方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.1 鐵氰化鉀還原力實(shí)驗(yàn) 參照汪江波等[32]的方法進(jìn)行測(cè)定并稍作改動(dòng)。取上述濃度的樣品溶液各0.1 mL，加入0.5 mL PBS 緩沖液和0.5 mL 1%的鐵氰化鉀水溶液，搖勻，50 ℃下水浴20 min，加0.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r/min 條件離心10 min，取0.5 mL 上清液于比色管中，加入0.5 mL 超純水和0.1 mL 0.1%的三氯化鐵水溶液，混勻后靜置10 min，700 nm 下測(cè)定吸光度值。

1.2.6.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn) 按照林冰潔等[33]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.3 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn) 按照蘇龍等[34]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.4 Fe2+螯合實(shí)驗(yàn) 按照Decker 等[35]與趙文婷[36]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.5 酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn) 按照表1 配制反應(yīng)體系，參照相關(guān)文獻(xiàn)[27]進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。A～D 代表不同實(shí)驗(yàn)組下的吸光度值，酪氨酸酶抑制率的計(jì)算公式如下：

表1 酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of tyrosinase inhibition experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒的理化指標(biāo)及可能污染物測(cè)定

藜麥麩皮黃酒（SPQ）和普通黃酒（SP）的理化指標(biāo)如表2 所示，SPQ 中皂苷和總酚酸含量明顯優(yōu)于SP（P＜0.05），這是因?yàn)檗见滬熎け旧砭秃幸欢康脑碥蘸头铀醄15]，除此之外其余理化指標(biāo)均無差異。按照理化指標(biāo)進(jìn)行劃分，兩種黃酒均屬于傳統(tǒng)半干型黃酒。重金屬離子檢測(cè)方面選取了食品中較為常見的鉛、鉻、砷、汞，在兩種黃酒中僅檢測(cè)到鉛（普通黃酒的鉛離子含量為1.9×10-2mg/kg，藜麥麩皮黃酒中鉛離子含量為1.3×10-2mg/kg）且兩種酒樣中鉛離子含量也均小于國(guó)標(biāo)限量（0.5 mg/kg），這可能是高粱、豌豆和藜麥在生長(zhǎng)過程中吸收了來自土壤、大氣中的鉛所致，兩種黃酒中也均未檢測(cè)到黃曲霉毒素B1。

表2 黃酒理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indexes of Huangjiu

2.2 黃酒中的非揮發(fā)性有機(jī)化合物差異分析

根據(jù)HPLC-MS 分析獲得的兩種黃酒中的非揮發(fā)性有機(jī)化合物制作的主成分分析散點(diǎn)圖如圖2a所示，該圖反應(yīng)樣本之間的差異程度，樣本之間聚合度越高說明樣本相似性越高，反之，表明樣本之間差異性越高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）的貢獻(xiàn)率分別為73.92%和10.34%，代表性較高。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化、歸一化處理后發(fā)現(xiàn)兩種黃酒對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)在組內(nèi)呈現(xiàn)相互聚集的情況，說明組內(nèi)重復(fù)性較好，而組間則有較好的區(qū)分度，說明兩種黃酒中的化合物差異性較大，這可能是由釀酒輔料藜麥麩皮的加入引起的?；鹕綀D的橫坐標(biāo)（log2（FC））反應(yīng)化合物在兩個(gè)分組之間差異倍數(shù)，其絕對(duì)值越大，差異越大，紅色代表差異上調(diào)，綠色代表差異下調(diào)。由圖2b 所示，差異化合物共計(jì)48 種，其中上調(diào)增加23 種，下調(diào)減少25 種。其中l(wèi)og2（FC）＞2 的化合物共計(jì)12 種，1＜log2（FC）＜2 的化合物有11 種；log2（FC）＜-2 的化合物共計(jì)19 種，-2＜log2（FC）＜-1 的化合物共6 種?？v坐標(biāo)-lg（P-value）反應(yīng)化合物在兩種黃酒之間差異的顯著性，P值越小，代表差異越顯著，對(duì)應(yīng)的-lg 值就越大，圖中縱坐標(biāo)數(shù)值在1.3 以上的所有紅色點(diǎn)和綠色點(diǎn)代表的化合物在兩種黃酒中都具有明顯差異。綜上所述，在火山圖的左上角和右上角的點(diǎn)分別代表差異非常顯著的下調(diào)差異化合物和上調(diào)差異化合物。

圖2 兩種黃酒化合物的主成分分析散點(diǎn)圖和差異化合物火山圖Fig.2 Principal component analysis scatter plot and volcano plot of different compounds in two kinds of Huangjiu

在利用HPLC-MS 對(duì)黃酒中的非揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，使用了親水的氨基柱，分離得到48 種非揮發(fā)性有機(jī)化合物，根據(jù)非揮發(fā)性有機(jī)化合物含量繪制了熱點(diǎn)分析圖并進(jìn)行聚類樹狀分析如圖3，該圖可以直觀反映非揮發(fā)性有機(jī)化合物在兩種黃酒之間的相對(duì)含量差異，顏色越紅代表對(duì)應(yīng)的非揮發(fā)性有機(jī)化合物在此樣本中的含量越高。上軸樹狀圖是對(duì)兩種黃酒的聚類分析，左側(cè)SP1、SP2、SP3 被聚類為一組（普通黃酒），右側(cè)SPQ1、SPQ2、SPQ3被聚類為一組（藜麥麩皮黃酒），這說明兩種黃酒三個(gè)平行樣品的相似程度很高。左軸樹狀圖是對(duì)差異化合物的聚類分析，兩種黃酒的差異有機(jī)化合物主要被聚類為5 個(gè)組，由數(shù)據(jù)可視化顏色可知，第1 組和第4 組在兩種黃酒中具有較好的區(qū)分度，第1 組化合物在SPQ 中的含量較低，其中N，N-二甲基-6-嘌呤胺的含量最低，第4 組化合物在SPQ 中的含量較高，其中L-蘇氨酸二氫鞘氨醇的含量最高。

圖3 兩種黃酒差異化合物聚類分析熱點(diǎn)圖Fig.3 Cluster analysis hotspot map of different compounds in two kinds of Huangjiu

在48 種非揮發(fā)性差異化合物當(dāng)中，數(shù)量最多的為醇類和酰胺類物質(zhì)，均為10 種，其次為酸類物質(zhì)4 種以及糖類物質(zhì)2 種，以log2（FC）值和化合物生理功能等條件為依據(jù)，從48 種差異化合物中選取了21 種作為代表，如表3 所示，在藜麥麩皮黃酒中的含量高于普通黃酒的物質(zhì)有14 種，包括L-亮氨酸、L-蘇氨酸二氫鞘氨醇、香草醛、甜菜堿、5-氨基水楊酸等。其中，L-亮氨酸作為一種人體必需氨基酸，可以為機(jī)體提供能量，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，修復(fù)肌肉以及降低血糖等方面也有一定作用[37]。L-蘇氨酸二氫鞘氨醇是一種PKC-α選擇性抑制劑，具有抗腫瘤活性[38]。甜菜堿是一種具有維持細(xì)胞滲透壓、轉(zhuǎn)甲基、調(diào)節(jié)脂肪代謝等生理功能的活性物質(zhì)[39]。5-氨基水楊酸可以治療輕度、中度潰瘍性結(jié)腸炎[40]。香草醛是一種特殊風(fēng)味物質(zhì)[41]，具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香，能起到增香和定香的作用。普通黃酒中含量高于藜麥麩皮黃酒的物質(zhì)共計(jì)6 種，以糖類物質(zhì)為主，相比于普通黃酒，藜麥麩皮黃酒中D-（+）-葡萄糖和棉子糖含量顯著降低，其原因可能是加入藜麥麩皮促進(jìn)了發(fā)酵過程中微生物對(duì)糖類物質(zhì)的利用[42]，而糖類物質(zhì)含量的降低也是造成藜麥麩皮黃酒酒精度低于普通黃酒的重要原因，同時(shí)，糖類物質(zhì)含量的降低也會(huì)影響高級(jí)醇的代謝途徑，使高級(jí)醇含量降低。研究表明，適量的高級(jí)醇可以提高酒的品質(zhì)，使酒體更加醇厚豐富，而過量的高級(jí)醇會(huì)有較強(qiáng)的致醉性和有害性[43]。由此可見，加入藜麥麩皮可使發(fā)酵后的黃酒擁有更好風(fēng)味的同時(shí)也兼具一定的生物活性，同時(shí)飲用藜麥麩皮黃酒相比于普通黃酒更有利于人體健康。

表3 藜麥麩皮黃酒與正常黃酒差異化合物（局部）Table 3 Different compounds of quinoa husks Huangjiu and ordinary Huangjiu (portion)

2.3 黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)

采用GC-MS 技術(shù)分別運(yùn)用頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣兩種方式檢測(cè)兩種黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果如表4～表5 以及圖4 所示，利用直接進(jìn)樣共測(cè)得12種物質(zhì)，藜麥麩皮黃酒中有12 種，普通黃酒中有11 種，其中正丁醇只存在于藜麥麩皮黃酒中，其相對(duì)含量占比為10.05%，利用外標(biāo)法測(cè)得正丁醇的含量為7.40 μg/mL。除此之外，標(biāo)定出的物質(zhì)還包括甲酸丁酯（SP 和SPQ 中含量分別為5.10、9.00 μg/mL）、乙酸（含量分別為4.40、4.50 μg/mL）、丁酸（含量分別為10.80、9.50 μg/mL）。通過各物質(zhì)在氣相色譜當(dāng)中的峰面積來進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在兩者共同擁有11 種物質(zhì)中，甲酸丁酯在藜麥麩皮黃酒中的含量顯著高于普通黃酒（P＜0.05），另外10 種物質(zhì)在兩種黃酒中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。直接進(jìn)樣法測(cè)得的12 種物質(zhì)中具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)有3 種，分別是甲酸丁酯（4 號(hào)峰，占比分別為6.45%與11.31%），呈梅子香氣和甜味。丁酸（14 號(hào)峰，占比分別為17.96%與15.14%），呈強(qiáng)烈的奶油和干酪香氣。麥芽酚（17 號(hào)峰，占比分別為2.40%與1.95%），有似焦香奶油糖的特殊香氣，稀溶液呈草莓香味。

表4 藜麥麩皮黃酒和普通黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量百分比Table 4 Relative contents of volatile substances in quinoa husks Huangjiu and ordinary Huangjiu

表5 藜麥麩皮黃酒和普通黃酒中部分揮發(fā)性物質(zhì)直接進(jìn)樣定量結(jié)果Table 5 Quantitative results of some volatile substances in quinoa husks Huangjiu and ordinary Huangjiu

圖4 黃酒揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatograms of volatile substances of Huangjiu

頂空進(jìn)樣共測(cè)得12 種物質(zhì)，藜麥麩皮黃酒中有12 種，普通黃酒中有11 種，其中只存在于藜麥麩皮黃酒中的為異戊醇，其相對(duì)含量占比為0.07%，異戊醇屬于高級(jí)醇，它少量存在于藜麥麩皮黃酒中可以使酒體更加醇厚綿密，但過量的異戊醇可以使黃酒產(chǎn)生不良風(fēng)味如汗臭味以及腐敗味。通過各物質(zhì)在氣相色譜當(dāng)中的峰面積來進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在兩者共同擁有11 種物質(zhì)中，異丙醇、乙酸丁酯、甲酸丁酯、丁酸丁酯在藜麥麩皮黃酒中的含量顯著高于普通黃酒（P＜0.05），另外7 種物質(zhì)在兩種黃酒中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。頂空進(jìn)樣法測(cè)得的12 種物質(zhì)中具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)有8 種，分別是丙酮（1 號(hào)峰，占比分別為4.37%與11.59%），呈薄荷似香味。異丙醇（2 號(hào)峰，占比分別為4.51%與19.99%），屬于高級(jí)醇的一種，具有類似乙醇?xì)馕叮稍鰪?qiáng)酒的風(fēng)味口感。乙酸丁酯（3 號(hào)峰，占比分別為0.53%與1.13%），呈強(qiáng)烈香蕉香味。甲酸丁酯（4 號(hào)峰，占比分別為53.91%與53.14%），呈梅子香氣和甜味。乳酸丁酯（11 號(hào)峰，占比分別為0.35%與0.36%），呈甜奶油香氣和牛奶香味。苯甲醇（16 號(hào)峰，占比分別為1.27%與0.50%），呈微弱茉莉花香氣。另外還有乙酸（10 號(hào)峰，占比分別為2.50%與2.49%）和丁酸（14 號(hào)峰，占比分別為24.46%與12.57%）。氣相結(jié)果表明，藜麥麩皮的加入對(duì)黃酒中某些揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量影響較大，尤其是一些高級(jí)醇和脂類物質(zhì)，其存在可能會(huì)改變黃酒的風(fēng)味。

由于定量分析是以酒樣當(dāng)中的物質(zhì)為基礎(chǔ)，在利用直接進(jìn)樣和頂空進(jìn)樣的外標(biāo)法進(jìn)行定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用直接進(jìn)樣的方法可以更直接的得到各物質(zhì)的含量，方便快捷，適用于小批量樣品的分析，而利用頂空進(jìn)樣的方法還需要測(cè)定出揮發(fā)性物質(zhì)在氣體和液體中平衡時(shí)的比值，換算成在酒樣當(dāng)中的具體含量，容易產(chǎn)生誤差，所以本研究采用直接進(jìn)樣方法對(duì)黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)定。衛(wèi)春會(huì)等[44]的研究中使用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析酒中的香氣成分，效果較好。后續(xù)研究中會(huì)采用此方法進(jìn)一部研究藜麥麩皮黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.4 黃酒的抗氧化活性

2.4.1 鐵氰化鉀還原能力 由圖5A 可知，兩種黃酒的還原力表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，均隨著濃度的升高而增大，但SP 和SPQ 原液的還原力明顯低于400 μg/mL VC。經(jīng)計(jì)算，SP 與SPQ 對(duì)于鐵氰化鉀還原能力的IC50值分別為0.36 和0.41 mL/mL，SP 的鐵氰化鉀還原能力要強(qiáng)于SPQ，說明釀酒時(shí)加入藜麥麩皮并不能提高酒樣的鐵氰化鉀還原能力。VC在100～400 μg/mL 之間呈良好的線性關(guān)系（Y=0.0054X+0.4095，R2=0.9937），經(jīng)計(jì)算SP 和SPQ 原液的還原力分別相當(dāng)于142.13 μg/mL VC和119.54 μg/mL VC。與顧逸菲等[45]的研究相比，藜麥麩皮黃酒的還原力優(yōu)于2000 μg/mL 的發(fā)酵型枳椇子黃酒（VC當(dāng)量為48.39 μg/mL）。

圖5 黃酒的抗氧化活性測(cè)定Fig.5 Determination of antioxidant activity of Huangjiu

2.4.2 羥自由基清除能力 由圖5B 可知，SP 在濃度為0.6、0.8 和1.0 mL/mL 時(shí)對(duì)羥自由基的清除率較高，SPQ 在濃度為0.8 和1.0 mL/mL 時(shí)對(duì)羥自由基的清除率較高。經(jīng)計(jì)算，SP 與SPQ 對(duì)于羥自由基清除的IC50值分別為0.67 和0.79 mL/mL，SP 對(duì)于羥自由基的清除率要強(qiáng)于SPQ，說明釀酒時(shí)加入藜麥麩皮并不能提高酒樣對(duì)于羥自由基的清除能力。與其他類型黃酒相比，喬曉月等[46]釀造的白藜蘆醇丹陽黃酒對(duì)于羥自由基清除的IC50值為0.80 mL/mL，說明藜麥麩皮黃酒對(duì)于羥自由基的清除能力和白藜蘆醇丹陽黃酒幾乎相同。謝佳藝[47]釀造的香菇小米黃酒在濃度為1.0 mL/mL 時(shí)對(duì)于羥自由基的清除率為78.83%，明顯要高于SP、SPQ 對(duì)于羥自由基的清除率（P＜0.05），推測(cè)其原因可能是在釀造香菇小米黃酒時(shí)添加了香菇漿，與小米黃酒中的多酚等抗氧化成分發(fā)生協(xié)同作用，在一定程度上增強(qiáng)了小米黃酒的抗氧化能力[47]。

2.4.3 DPPH 自由基清除能力 由圖5C 可知，兩種黃酒均具有一定的DPPH 自由基清除能力，隨著濃度的增加呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算，SP 與SPQ 對(duì)于DPPH 自由基的清除的IC50值分別為0.11和0.05 mL/mL，SP 對(duì)于DPPH 自由基的清除能力稍弱于SPQ，說明釀酒時(shí)加入藜麥麩皮可以略微提高酒樣對(duì)于DPPH 自由基的清除能力。與其他類型黃酒相比，李杰等[48]釀造的紅小米黃酒的對(duì)于DPPH自由基清除的IC50值為0.45 mL/mL，說明藜麥麩皮黃酒對(duì)于DPPH 自由基的清除能力要強(qiáng)于紅小米黃酒，這可能與藜麥麩皮黃酒中皂苷、黃酮類的物質(zhì)含量較高有關(guān)[15]。韓惠敏[49]釀造的黑米黃酒在0.5 mL/mL 時(shí)對(duì)DPPH 自由基的清除率為82.11%±0.76%，與SP 和SPQ 原液的DPPH 自由基清除率相比不存在顯著性差異（P＞0.05），所以藜麥麩皮黃酒對(duì)于DPPH 自由基的清除能力弱于黑米黃酒，推測(cè)其原因可能是黑米黃酒中含有大量的花青苷[49]。

2.4.4 Fe2+螯合能力 由圖5D 可知，兩種黃酒與Fe2+的螯合率會(huì)隨著黃酒濃度的增大而提高，SPQ 原液（1.0 mL/mL）的Fe2+螯合率達(dá)到了45.79%，明顯高于SP 原液（6.51%）和10 μg/mL 檸檬酸（10.83%），經(jīng)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)計(jì)算，SP 與SPQ 對(duì)于Fe2+螯合能力的IC50值分別9.27 與1.28 mL/mL，SP的Fe2+螯合能力要弱于SPQ，說明釀酒時(shí)加入藜麥麩皮可提高酒樣對(duì)于Fe2+的螯合能力，該發(fā)現(xiàn)還可為后續(xù)Fe2+螯合補(bǔ)鐵劑的開發(fā)提供新的思路。

2.4.5 酪氨酸酶抑制能力 由圖5E 可知，兩種黃酒對(duì)于酪氨酸酶的抑制率呈現(xiàn)先急速上升后逐漸平緩的趨勢(shì)，SPQ 和SP 對(duì)酪氨酸酶的IC50值分別為0.27 和0.69 mL/mL，SPQ 對(duì)酪氨酸酶的抑制能力要強(qiáng)于SP，說明釀酒時(shí)加入藜麥麩皮可以提高酒樣對(duì)于酪氨酸酶的抑制能力，其原因可能是藜麥麩皮中含有大量可以抑制酪氨酸酶活性的皂苷[27]，此外，黃酒本身含有的抗氧化活性物質(zhì)可能與皂苷產(chǎn)生協(xié)同效果，使得藜麥麩皮黃酒對(duì)酪氨酸酶的抑制效果更佳。

3 結(jié)論

藜麥麩皮黃酒中的總皂苷及總酚酸含量分別為2.47±0.36、1.19±0.07 mg/mL，相對(duì)于普通黃酒，總皂苷、總酚酸含量有所提升（P＜0.05）。利用HPLCMS 技術(shù)檢測(cè)到黃酒中有48 種差異性非揮發(fā)性物質(zhì)，其中在藜麥麩皮黃酒中含量更高的物質(zhì)主要有醇類、氨基類、酰胺類等，其含量的升高可以提高藜麥麩皮黃酒的營(yíng)養(yǎng)功能和活性功能，在藜麥麩皮黃酒中含量降低的物質(zhì)主要是糖類，其含量的降低可以在一定程度上控制高級(jí)醇的產(chǎn)生，增強(qiáng)酒體風(fēng)味口感的同時(shí)也保護(hù)人的健康。利用GC-MS 技術(shù)檢測(cè)到12 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中異丙醇、甲酸丁酯、乙酸丁酯在藜麥麩皮黃酒中的含量顯著高于普通黃酒，此外正丁醇和異戊醇僅存在于藜麥麩皮黃酒中，這些高級(jí)醇類和脂類物質(zhì)可以使藜麥麩皮黃酒變得更加醇厚，提高藜麥麩皮黃酒的特殊風(fēng)味。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，與普通黃酒相比，加入藜麥麩皮發(fā)酵的黃酒具有更好的Fe2+螯合能力（c=1 mL/mL 時(shí)，螯合率為45.79%）和酪氨酸酶抑制能力（c=1 mL/mL 時(shí)，抑制率為94.84%），藜麥麩皮黃酒的Fe2+螯合率和酪氨酸酶抑制率是普通黃酒的7.03 倍、1.33 倍。但在鐵氰化鉀還原能力、羥自由基清除能力方面，藜麥麩皮黃酒并不優(yōu)于普通黃酒，造成差異的主要原因是藜麥麩皮中的多酚及黃酮類成分在釀造過程中釋放到黃酒中。綜合以上結(jié)果說明釀造藜麥麩皮黃酒存在可行性，在開發(fā)更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的黃酒以及提高藜麥麩皮的高值化利用方面具有較廣闊的應(yīng)用前景，但藜麥麩皮的加入是否會(huì)影響整個(gè)原料發(fā)酵體系的精白度仍需進(jìn)一步探討。后續(xù)將針對(duì)藜麥麩皮的添加量與發(fā)酵體系精白度之間的量效關(guān)系以及藜麥麩皮黃酒在發(fā)酵過程中微生物的優(yōu)勢(shì)菌群及多樣性變化方面進(jìn)行更加深入的研究，為釀造藜麥麩皮黃酒提供更加完善的理論依據(jù)。