李瑞瑞,虎紅紅,馮 雪,楊文飛,馬 云

(1.寧夏大學(xué)動物科技學(xué)院/寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室,銀川 750021;2.寧夏新澳農(nóng)牧有限公司,寧夏 靈武 750406)

【研究意義】乳業(yè)是健康中國、強壯民族的重要產(chǎn)業(yè)[1],促進其健康穩(wěn)定發(fā)展,既是為了生產(chǎn)牛奶,提高國民的整體生活水平,又可高效利用國土資源,營造良好的生態(tài)環(huán)境,優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu),促進農(nóng)村經(jīng)濟持續(xù)發(fā)展。根據(jù)2023年發(fā)布的《中國農(nóng)業(yè)展望報告(2023—2032)》,我國奶制品生產(chǎn)量和消費量均增長較快,奶源自給率不斷提高,然而,供給缺口依然存在,進口保持增長但增速放緩。預(yù)計2032年奶制品進口量將增至2.32×107t(折合生鮮乳),年均增長1.6%。此外,我國奶類消費也存在著地區(qū)、城鄉(xiāng)之間的不平衡,這為我國的奶業(yè)發(fā)展提供了更多的潛力和方向,提髙奶品質(zhì)和奶產(chǎn)量已成為我國奶業(yè)亟待解決的問題之一。遺傳育種技術(shù)作為對奶業(yè)生產(chǎn)效率影響達到40%的因素,成為了改善產(chǎn)奶性狀的有效手段[2]?！厩叭搜芯窟M展】二肽基肽酶樣6(Dipeptidyl Peptidase-like 6,DPP6)又稱為DPPX、DPL1、BSPL、鉀通道加速因子(KAF),是一種II型(單次)跨膜蛋白,來源于一個普遍存在的絲氨酸肽酶家族,該家族對原核生物和真核生物的正常細胞功能至關(guān)重要,其家族多個成員都被證實參與了細胞死亡的炎癥形式[3]。在成年嚙齒動物大腦中已發(fā)現(xiàn)了DPP6的3種替代亞型:DPP6-K、DPP6-S和DPP6-L。DPP6-S的表達水平最高,其次是DPP6-K和DPP6-L[4]。DPP6-S和DPP6-K主要存在于CA1～CA3區(qū)域的海馬錐體神經(jīng)元中。然而,DPP6-L主要局限于嗅球和小腦[4]。有研究表明[5],DPP6基因具有關(guān)鍵的酶催化絲氨酸取代天冬氨酸,從而使其蛋白酶功能失活,并促進和維持絲狀偽足的生長和穩(wěn)定。作為A型電壓門控K通道的強大調(diào)節(jié)輔助亞基,通過增強Kv4.2通道電導(dǎo),DPP6可防止神經(jīng)元的過度興奮以及動作電位的反向傳播[4,6]。Lin等[7]利用多種實驗技術(shù)發(fā)現(xiàn),DPP6是絲狀偽足正常發(fā)育并適當(dāng)過渡到樹突棘所必需的,在行為和大腦發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8],且與神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知障礙(如肌萎縮側(cè)索硬化癥、癡呆、智力障礙等)相關(guān)[6, 9]。此外,Pedrosa等[10]表明,DPP6能夠?qū)δ膛５娜橹十a(chǎn)生影響,并且Li等[11]通過多態(tài)性檢測篩選出了DPP6的重要多態(tài)性位點,通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)其能夠顯著影響奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率以及體細胞評分等重要性狀。PRKN基因即Parkin基因,也稱PARK2(Parkinson’ s disease gene 2),是屬于RBR(RING-in-Between-RING)家族的一種E3泛素連接酶,Parkin突變可導(dǎo)致異常蛋白累積,加速神經(jīng)元細胞死亡,導(dǎo)致帕金森病和阿爾茲海默病等疾病的發(fā)生[12-13]。此外,PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可調(diào)控線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng),維持線粒體的正常形態(tài)及功能[14],據(jù)報道,這些細胞器特異性自噬能夠通過消除受損細胞器和維持體內(nèi)平衡從而對炎癥性疾病產(chǎn)生影響[15],同時促進細胞的存活和增殖[16]?！颈狙芯壳腥朦c】基于寧夏反芻動物分子細胞育種重點實驗室前期工作基礎(chǔ)與最新全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Studies,GWAS)研究報道[10,17],推測DPP6和PRKN基因能夠?qū)δ膛．a(chǎn)奶發(fā)揮作用。然而,目前關(guān)于DPP6和PRKN基因的研究大多集中于人類癌癥等方面(如癌癥細胞的增殖和分化以及靶向治療等)[8, 18],而對于牛生理功能方面的報道較少[10-11,17]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以DPP6和PRKN為目的基因,對其蛋白特性進行生物信息學(xué)分析,并利用qRT-PCR技術(shù)對2個基因在荷斯坦奶牛不同組織及乳腺上皮細胞(bMECs)的表達水平進行檢測,為進一步探究荷斯坦奶牛DPP6和PRKN基因生物學(xué)功能提供數(shù)據(jù)支持,也為荷斯坦奶牛的分子標(biāo)記輔助選擇與遺傳育種做提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

荷斯坦奶牛來自寧夏回族自治區(qū)靈武市某規(guī)模養(yǎng)殖奶牛場。選擇3頭具有相同父本且飼養(yǎng)管理條件相同的荷斯坦奶牛,取屠宰后奶牛組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、乳腺、卵巢、子宮、黃體和瘤胃),將表面血跡擦拭后,分裝成黃豆粒大小置于2.0 mL凍存管,投入液氮保存送回實驗室,-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ橄偕掀ぜ毎?bMECs)為寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室前期經(jīng)過鑒定并保存于液氮罐中的細胞[19]。

1.2 主要試劑與儀器

試驗所用的主要試劑[19]:0.25%的胰酶消化液(Hyclone,美國)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國)、PBS緩沖液(Hyclone,美國)、胎牛血清(HyClone,美國)、脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS, Sigma美國)、RT-qPCR試劑盒(Universal SYBR RT-RT-qPCR Master Mix)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,北京)、TriZol試劑(TaKaRa,北京)、RNase-free H2O(天根,北京)。

試驗所用的主要儀器[19]:高壓滅菌鍋(普和希,日本)、普通 PCR 儀(Bio-Rad,美國)、電熱恒溫水浴鍋(一恒,上海)、37 ℃ CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國)、CFX96實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad,美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)相關(guān)工具對DPP6和PRKN蛋白的生物學(xué)功能進行預(yù)測,預(yù)測工具見表1。

表1 生物信息學(xué)分析在線工具及軟件[20-24]

1.3.2 總RNA的提取及cDNA的合成 采用TRIzol 法提取組織總RNA,后通過多功能全波長酶標(biāo)儀檢測所提取的總RNA樣品濃度(ng/μL),計算OD260/OD280值同時通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量[20]。

采用Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)進行反轉(zhuǎn)錄:①去除基因組DNA反應(yīng):向無RNA酶離心管中加入5xg DNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,Total RNA為1000 ng,最后加RNase Free ddH2O至10 μL,混勻,瞬時離心,反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):向步驟①中10 μL的反應(yīng)液加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,5x PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4 μL和RNase Free ddH2O 4 μL,混勾,瞬時離心,反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后,得到cDNA,-80 ℃保存。

1.3.3 組織表達譜的構(gòu)建 對DPP6和PRKN基因進行引物設(shè)計。根據(jù)NCBI中査找己知牛(Bostaurus)的2個基因[DPP6(NM_174040.2)、PRKN(NM_001199065.1)]以及GAPDH(NM_001034034.2)的序列。通過Primer 5.0設(shè)計特異性熒光定量引物(表2),由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司對引物進行合成[19]。

表2 熒光定量PCR實驗所需引物序列

表3 荷斯坦奶牛與其他8個物種DPP6蛋白序列相似性比對

表4 荷斯坦奶牛與其他5個物種PRKN蛋白序列相似性比對

1.3.4 bMECs的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 于液氮罐中取出前期保存的bMECs,放入37 ℃水浴鍋融化,后均勻接種在DMEM培養(yǎng)基(血清含量為10%),放入37 ℃、濕度100%的培養(yǎng)箱(5% CO2)中進行培養(yǎng),待細胞生長密度為90%時進行細胞傳代(用PBS漂洗bMECs細胞1～2遍,隨后加入1 mL胰酶消化液吹打消化2～3 min,加入與胰酶等體積培養(yǎng)基終止消化;轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,1000 r/min離心5 min后;棄上清,加入1 mL培養(yǎng)基吹打混勻后,接種到新培養(yǎng)皿中培養(yǎng)[19,25]。

1.3.5 bMECs炎癥模型的建立 將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,待細胞密度達到70%～80%時,向每孔細胞中滴加LPS溶液(終濃度為50 ng/μL),誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。待LPS誘導(dǎo)6 h,收集細胞,用于RNA提取。通過檢測促炎細胞因子[白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-8 (interleukin-8,IL-8) 、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)]mRNA的表達量,判斷炎性細胞模型是否構(gòu)建成功[19,25]。

RT-qPCR反應(yīng)總體系20 μL:ChamQ Universal SYBR RT-qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 6.4 μL;反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,39個循環(huán),每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參,利用2-△△Ct計算分析熒光定量結(jié)果,用SPSS 25進行單因素方差(One-way ANOVA)分析,通過Graph Pad Prism 9.5繪圖,其中P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著[20, 26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPP6和PRKN的理化性質(zhì)分析

2.1.1 DPP6的理化性質(zhì)分析 在線工具 Prot Param預(yù)測發(fā)現(xiàn)DPP6蛋白編碼863個氨基酸,其中Ser所占比例最大(8.1%),Met與Trp占比相同且最少(1.3%)(圖1)。DPP6具有107個負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu),93個正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys);不穩(wěn)定系數(shù)為44.53,屬于不穩(wěn)定蛋白;DPP6蛋白質(zhì)的分子式為C4317H6676N1168O1303S24,相對分子質(zhì)量為96 556.98;理論等電點(PI)為6.01,預(yù)估DPP6蛋白半衰期為30 h,脂溶系數(shù)為78.98,平均親水系數(shù)為-0.408;在DPP6蛋白第100個氨基酸處疏水性最強(3.9),在第421個氨基酸處親水性最強(-2.944),在負(fù)值區(qū)域有較多的氨基酸,故親水氨基酸占比較大,整體屬于親水性蛋白(圖2-a);DPP6編碼的氨基酸包含絲氨酸磷酸化位點48個、酪氨酸磷酸化位點14個、蘇氨酸磷酸化位點27個(圖2-b);DPP6有9個N-糖基化位點,分別為Asn13、171、317、349、402、469、533、564、811(圖2-c)。

圖1 荷斯坦奶牛DPP6蛋白的氨基酸組成與比例Fig.1 Amino acid composition and ratio of DPP6 protein in Holstein dairy cows

a.蛋白親疏水性預(yù)測;b.磷酸化位點分析;c.糖基化位點分析。下同。a.Protein hydrophilicity prediction; b.Phosphorylation site analysis; c.Glycosylation site analysis. The same as below.

2.1.2 PRKN的理化性質(zhì)分析 使用在線工具 Prot Param 預(yù)測發(fā)現(xiàn)PRKN蛋白編碼488個氨基酸,其中Gly占比最大(10.0%),Met占比最少(0.6%)(圖3)。PRKN蛋白質(zhì)的分子式為C2303H3650N680O708S32,相對分子質(zhì)量為53 218.37,具有53個負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu),54個正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys),屬不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為49.01);預(yù)估PRKN的半衰期為30 h,脂溶系數(shù)為73.87,平均親水系數(shù)為-0.362,理論等電點(PI)為7.42。在PRKN蛋白的第322與323個氨基酸處疏水性最強(2.000),第308個氨基酸處親水性最強(-3.122),在負(fù)值區(qū)域有較多的氨基酸,故親水氨基酸占比較大,整體屬于親水性蛋白(圖4-a);此外,PRKN蛋白編碼的氨基酸包含絲氨酸磷酸化位點28個、酪氨酸磷酸化位點3個,而蘇氨酸磷酸化位點15個(圖4-b);PRKN有1個N-糖基化位點,為Asn469(圖4-c)。

圖3 荷斯坦奶牛PRKN蛋白的氨基酸組成與比例Fig.3 Amino acid composition and proportion of PRKN protein in Holstein dairy cows

圖4 荷斯坦奶牛PRKN蛋白理化性質(zhì)分析Fig.4 Physicochemical properties analysis of PRKN protein in Holstein dairy cows

2.2 DPP6和PRKN蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2.1 DPP6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測 TMHMM預(yù)測DPP6蛋白在第94～116氨基酸殘基之間具有一個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(TMHs),跨膜螺旋中氨基酸的預(yù)期數(shù)量大于18(22.584 72),因此預(yù)測DPP6蛋白可能為跨膜蛋白(圖5-a);通過SignalP 5.0預(yù)測DPP6蛋白不屬于分泌蛋白(不具有信號肽)(圖5-b);利用NCBI在線工具預(yù)測DPP6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)該蛋白具有2個匹配的超家族保守結(jié)構(gòu)域(第193～559位氨基酸處的DPPIV_N super family和第639～845位氨基酸處的Abhydrolase super family),特定匹配在DPPIV_N,屬于DPPIV_N超級家族(圖5-c)。蛋白亞細胞定位預(yù)測表明,該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比例占55.6%,細胞核、液泡、細胞質(zhì)和線粒體均占11.1%,推測該基因主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

a. 蛋白跨膜結(jié)構(gòu);b. 信號肽;c. 結(jié)構(gòu)域預(yù)測。下同。a. Protein transmembrane structure; b. Signal peptide; c.Domain prediction. The same as below.圖5 荷斯坦奶牛DPP6蛋白理化性質(zhì)分析Fig.5 Physicochemical properties analysis of DPP6 protein in Holstein dairy cows

2.2.2 PRKN蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測 TMHMM預(yù)測PRKN蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(TMHs)(圖6-a)。通過SignalP 5.0預(yù)測PRKN蛋白也不屬于分泌蛋白(圖6-b);NCBI在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有5個保守結(jié)構(gòu)域(第223～313位氨基酸處的zf-RING_14、第141～224位氨基酸處的RING0_parkin、第296～374位氨基酸處的BRcat_RBR_parkin、第3～76位氨基酸處的Ubl_parkin和第404～424位氨基酸處的BRcat_Rcat_RBR super family)(圖6-c)。此外,PRKN蛋白亞細胞定位預(yù)測表明,該蛋白定位于細胞核比例占52.2%,細胞質(zhì)占26.1%,線粒體占8.7%,細胞膜、過氧化物酶體和細胞骨架均占4.3%,推測PRKN主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

圖6 荷斯坦奶牛PRKN蛋白理化性質(zhì)分析Fig.6 Physicochemical properties analysis of PRKN protein in Holstein

2.3 DPP6和PRKN蛋白結(jié)構(gòu)、互作蛋白預(yù)測及蛋白進化樹分析

2.3.1 DPP6蛋白結(jié)構(gòu)、互作蛋白預(yù)測及蛋白進化樹分析 Prabi預(yù)測(圖7-a、7-b)發(fā)現(xiàn),DPP6蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲(Random coil,紫色短豎線區(qū))占比52.61%,延伸鏈(Extended strand,紅色中豎線區(qū))占比23.41%,而α-螺旋(Alpha helix,藍色長豎線區(qū))占比23.99%,由此推測,無規(guī)卷曲為荷斯坦奶牛DPP6最大量二級結(jié)構(gòu)元件,α-螺旋和延伸鏈散布其中,無β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)原件;通過SWISS-MODEL預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖8-a),DPP6蛋白以無規(guī)卷曲為主,與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測DPP6可能與PRNP、KCNIP3、KCNC4、IGLON5、GALNTL5等蛋白存在互作關(guān)系,并通過與上述蛋白的相互作用參與奶牛產(chǎn)奶等生物學(xué)功能(圖8-b);將牛的DPP6蛋白序列與山羊、斑馬、虎鯨、驢等的蛋白序列進行相似性比對,發(fā)現(xiàn)牛與上述物種DPP6蛋白的同源性較高,通過MEGA 11.0構(gòu)建蛋白進化樹可知,牛與山羊的序列相似性最高,這與同源性比對結(jié)果吻合,推測兩個物種的DPP6蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能(圖8-c)。

a橫向表示二級結(jié)構(gòu)分布; b按順序完整表示每個蛋白的二級結(jié)構(gòu)。下同。a shows the secondary structure distribution horizontally; b shows the complete secondary structure of each protein in sequence. The same as below.

a.蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;b.互作蛋白預(yù)測;c.DPP6蛋白進化樹。下同。a. Protein tertiary structure prediction; b. Interacting protein prediction; c. DPP6 protein evolutionary tree. The same as below.

2.3.2 PRKN蛋白結(jié)構(gòu)、互作蛋白預(yù)測及蛋白進化樹分析 Prabi預(yù)測(圖9-a、9-b)發(fā)現(xiàn),PRKN蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α-螺旋分別占比61.27%、 22.95%、15.78%,由此推測,無規(guī)卷曲為荷斯坦奶牛PRKN最大量二級結(jié)構(gòu)元件,α-螺旋和延伸鏈散布其中,無β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)原件。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致,均以無規(guī)卷曲為主(圖10-a)。此外,預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與PINK1、UBE2N、BECN1、SNCA、MFN1等蛋白存在互作關(guān)系,并通過與上述蛋白的相互作用調(diào)控線粒體自噬從而參與奶牛產(chǎn)奶等生物學(xué)功能(圖10-b)。將牛的PRKN蛋白序列與馬鹿、綿羊、虎鯨、山羊和寬吻海豚的蛋白序列進行相似性比對,發(fā)現(xiàn)牛與上述物種PRKN蛋白的同源性較高,通過MEGA 11.0構(gòu)建蛋白進化樹,可知牛與馬鹿的PRKN蛋白序列相似性最高,這與同源性比對結(jié)果吻合,推測兩個物種的PRKN蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能(圖10-c)。

圖9 荷斯坦奶牛PRKN蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Prediction of PRKN protein secondary structure in Holstein dairy cows

圖10 荷斯坦奶牛PRKN蛋白三級結(jié)構(gòu)、互作蛋白預(yù)測與進化樹Fig.10 Tertiary structure,prediction of interacting protein and evolutionary tree of PRKN protein in Holstein dairy cows

2.4 荷斯坦奶牛DPP6和PRKN基因組織表達分析

對DPP6和PRKN基因的組織表達譜進行探究,發(fā)現(xiàn)DPP6和PRKN基因在組織中普遍表達。其中,DPP6基因在腎臟和乳腺組織中表達量最高,其次是脾臟和肺臟,以心臟中DPP6基因表達量作為對照,荷斯坦奶牛DPP6基因在腎臟、乳腺、脾臟、肺臟的表達量均達到極顯著水平(圖11-a),而PRKN基因在乳腺中表達量最高,其次是瘤胃和腎臟,以肺臟中PRKN基因表達量為對照,荷斯坦奶牛PRKN基因在腎臟、瘤胃和乳腺的表達量均達到極顯著水平(圖11-b)。

*表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義;**表示在P<0.01水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。* indicates that the difference has the statistical significance at the P<0.05 level; ** indicates a statistically significant difference at P<0.01.

2.5 DPP6和PRKN基因在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞中的表達分析

采用RT-qPCR技術(shù)檢測促炎細胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞后的表達情況,從而鑒定炎癥誘導(dǎo)bMECs是否成功。結(jié)果表明,與空白對照組相比,IL-8、IL-6和IL-1β在LPS誘導(dǎo)后的細胞中均顯著上調(diào)表達(圖12),其中IL-8(P<0. 0001)與IL-6(P<0. 01)的表達量達到極顯著,表明LPS成功誘導(dǎo)了奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[25]。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);****表示差異極顯著(P<0.0001)。每組進行3個重復(fù)。下同。* indicates significant difference (P<0.05); ** indicates extremely significant difference (P<0.01); **** indicates extremely significant difference (P<0.0001). Each group performed three repetitions. The same as below.

進一步探究炎性狀態(tài)下的bMECs中DPP6和PRKN基因的表達模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比空白對照組,DPP6基因在LPS誘導(dǎo)的細胞中極顯著下調(diào),PRKN基因則在LPS誘導(dǎo)組極顯著上調(diào)(P<0.01),表明DPP6與PRKN基因均可能在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)中具有潛在作用(圖13)[25]。

圖13 DPP6和PRKN基因在LPS誘導(dǎo)的bMECs中的表達Fig.13 Expression of DPP6 and PRKN genes in LPS-induced bMECs

3 討 論

荷斯坦奶牛體型大、產(chǎn)奶量高,且適應(yīng)性強,在中國北方大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖,飼養(yǎng)分布較廣,是我國存欄量最多的奶牛品種。在過去幾十年,研究者們?yōu)樘岣吣膛５漠a(chǎn)奶性能已采用多種方法來鑒定對產(chǎn)奶性狀有重要意義的遺傳標(biāo)記,而通過分子生物學(xué)進行輔助育種的興起,使得以某些與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的基因作為分子標(biāo)記來判定奶牛的產(chǎn)奶性能成為可能,從而極大地提升了選種選育的效率。目前,已有部分基因被證實對產(chǎn)奶性狀有顯著的遺傳效應(yīng)[27]。

DPP6來源于一個普遍存在的絲氨酸肽酶家族,該家族對原核生物和真核生物的正常細胞功能至關(guān)重要。Lin等[7]發(fā)現(xiàn)絲狀偽足需要DPP6才能正常發(fā)育并適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)變?yōu)闃渫患PP6在絲狀偽足調(diào)節(jié)中的作用最終導(dǎo)致在行為和大腦發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8],即DPP6與神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知障礙有關(guān),例如肌萎縮側(cè)索硬化癥、癡呆、智力障礙、圖雷特綜合征、小頭畸形和自閉癥譜系障礙等[9]。DPP6還被報道可作為A型電壓門控K+通道的強大調(diào)節(jié)輔助亞基,在神經(jīng)元興奮性中起重要作用,并且能夠獨立調(diào)節(jié)突觸發(fā)育[9]。通過增加Kv4.2通道電導(dǎo),DPP6防止神經(jīng)元過度興奮以及動作電位的反向傳播,其家族成員DPP8和DPP9被報道都參與了細胞死亡的炎癥形式[28],而DPP4因其在糖尿病和癌癥治療中的作用而被關(guān)注[29]。此外,Rout等[30]通過探究不同生態(tài)和放牧條件下飼養(yǎng)的10個品種的山羊奶低豐度和高豐度蛋白質(zhì),表明DPP-IV能夠調(diào)節(jié)酪蛋白和非酪蛋白山羊奶蛋白的翻譯后修飾;Pedrosa等[10]對加拿大荷斯坦奶牛表型性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析,表明DPP6可作為奶牛產(chǎn)奶性狀候選基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶量產(chǎn)生影響。此外,Kaniyamattam等[31]通過試驗發(fā)現(xiàn),在奶牛中,鉀能夠通過滲透調(diào)節(jié)作用與乳糖密切相關(guān),從而對產(chǎn)奶量產(chǎn)生影響。本研究對DPP6蛋白進行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白,PRNP、KCNIP3、KCNC4、IGLON5、GALNTL5等蛋白與DPP6蛋白存在互作關(guān)系,多種蛋白相互作用從而參與奶牛產(chǎn)奶等生物學(xué)功能,并且作為鉀通道加速因子,誘導(dǎo)產(chǎn)奶量發(fā)生變化從而對乳糖率性狀造成影響[10],通過構(gòu)建不同物種DPP6蛋白進化樹,本研究發(fā)現(xiàn)牛與山羊的序列相似性最高,保守型較強,推測兩個物種的DPP6蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。之后通過構(gòu)建荷斯坦奶牛組織表達譜,進一步檢測DPP6基因在荷斯坦奶牛乳腺組織中的表達,結(jié)果顯示相比其他組織,DPP6基因在乳腺中具有較高相對表達量。這與之前的研究以及GWAS的篩選結(jié)果一致[10, 31]。此外,根據(jù)前人研究結(jié)果[9, 29-32],推測DPP6基因可能與奶牛乳房炎癥的發(fā)生密切相關(guān),因此本研究通過LPS誘導(dǎo)構(gòu)建了荷斯坦奶牛的乳腺上皮細胞炎癥模型,檢測DPP6基因在炎癥誘導(dǎo)的bMECs中的表達,結(jié)果顯示,DPP6基因在LPS誘導(dǎo)的bMECs中極顯著下調(diào),因此推測DPP6基因可能在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)中具有潛在的調(diào)節(jié)作用[25]。

有研究表明[33-34],Parkin能夠泛素化大量的底物蛋白,在不同亞基上催化形成不同的泛素鏈,從而改變其蛋白質(zhì)之間的相互作用以及亞細胞定位,并且促進泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)降解。Parkin的結(jié)構(gòu)從N端至C端,由泛素樣結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-like domain,Ubl)、鋅指結(jié)構(gòu)域RING0、RING1、RING間區(qū)(In-between RING,IBR)、Parkin抑制元件(The repressor element of parkin,REP)和RING2組成[34],揭示了許多關(guān)于其調(diào)節(jié)和功能的信息。目前已鑒定出超過120個致病性PD相關(guān)突變散布在Parkin的整個結(jié)構(gòu)域中[30],因此,Parkin所有的結(jié)構(gòu)域在功能上都十分重要。研究表明,PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可調(diào)控線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng),維持線粒體的正常形態(tài)及功能,以應(yīng)對損傷和感染[35]。在靈長目的一些物種中,PRKN主要在腦中集中表達,并廣泛存于各類正常組織中,例如在人的心血管和骨骼肌,同時在脊椎動物與無脊椎動物例如秀麗線蟲和黑腹果蠅中也高度保守,因此,PRKN可能具有潛在且重要的生物學(xué)功能。此外,Elswood等[36]通過研究發(fā)現(xiàn),線粒體相關(guān)基因PRKN能夠通過調(diào)節(jié)程序化的線粒體自噬進而影響乳腺上皮細胞的分化,而PINK1、UBE2N、BECN1、SNCA、MFN1等蛋白與PRKN存在互作關(guān)系,多種線粒體相關(guān)基因相互作用從而參與奶牛產(chǎn)奶等生物學(xué)功能。然而,有關(guān)PRKN基因的遺傳變異對荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶性狀的影響,目前國內(nèi)外的研究甚少。Liu等[37]通過金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎性反應(yīng),發(fā)現(xiàn)PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬促進了金黃色葡萄球菌的存活,并有助于金黃色葡萄球菌的持續(xù)感染。在本研究中,通過對PRKN蛋白進行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白,具有5個保守結(jié)構(gòu)域,無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽,亞細胞定位于細胞核比例占65.2%,推測PRKN主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。通過預(yù)測PRKN蛋白理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)甘氨酸含量最多,而甘氨酸被報道能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的增殖和凋亡,促進乳腺上皮細胞向DNA合成期轉(zhuǎn)化,促進細胞分裂[38]。構(gòu)建不同物種PRKN蛋白進化樹,發(fā)現(xiàn)牛PRKN序列與馬鹿的序列相似性最高,保守型較強,推測兩個物種的PRKN蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。后采用RT-qPCR探究了PRKN在荷斯坦奶牛不同組織中的表達模式,結(jié)果顯示PRKN基因在乳腺中亦具有較高相對表達量,提示同樣可作為與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的候選基因。PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可調(diào)控線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng),維持線粒體的正常形態(tài)及功能,Harper等[15]發(fā)現(xiàn)這些細胞器特異性自噬能夠通過消除受損細胞器和維持體內(nèi)平衡從而對炎癥性疾病產(chǎn)生影響,在此基礎(chǔ)上,本研究檢測了PRKN基因在空白對照組與LPS誘導(dǎo)組的bMECs中的表達,發(fā)現(xiàn)PRKN基因在LPS誘導(dǎo)的bMECs中極顯著上調(diào),這與Liu等[37]和Lin等[39]的研究相似。因此,推測PRKN基因也可能在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)中具有潛在的調(diào)節(jié)作用[25]。

基于前期GWAS、生物信息學(xué)、不同組織與bMECs差異分析,本研究發(fā)現(xiàn)DPP6與PRKN基因均在乳腺組織中具有較高的相對表達量,且DPP6在LPS誘導(dǎo)的bMECs中極顯著下調(diào),PRKN基因極顯著上調(diào),2個基因均對乳腺上皮細胞的炎癥反應(yīng)具有潛在的調(diào)控作用。因此,結(jié)合其他學(xué)者研究[10-11,17],可推斷荷斯坦奶牛DPP6與PRKN基因可能具有調(diào)控乳腺細胞生長作用,后期可對其在細胞水平開展功能驗證,深入研究2個基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶及乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)的具體影響。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)DPP6蛋白編碼863個氨基酸殘基,編碼產(chǎn)物主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);PRKN蛋白編碼488個氨基酸殘基,編碼產(chǎn)物主要分布在細胞核,2個蛋白均為不穩(wěn)定親水性蛋白。DPP6與PRKN2個基因在荷斯坦奶牛組織中普遍表達,且在乳腺組織中均具有較高相對表達量,此外,相對于空白對照組,DPP6基因在LPS誘導(dǎo)的bMECs中極顯著下調(diào),PRKN基因極顯著上調(diào),2個基因均對炎性乳腺上皮細胞具有潛在的調(diào)節(jié)作用,可能會影響奶牛的乳房炎癥。本研究結(jié)果為荷斯坦奶牛DPP6與PRKN2個基因后續(xù)在奶牛乳房炎癥相關(guān)調(diào)控機制研究提供理論依據(jù)。