周遠平,羅文嬌,周 平,王 瓊,郭華春

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院,昆明 650201;2. 云南農(nóng)業(yè)大學機電工程學院,昆明 650201)

【研究意義】中國南方大量種植馬鈴薯[1],收獲后馬鈴薯莖葉常被薯農(nóng)移出田地而未得到循環(huán)利用。馬鈴薯莖葉屬于農(nóng)作物秸稈的一種,其富含礦質(zhì)養(yǎng)分和較多的纖維素和木質(zhì)素[2],有效利用馬鈴薯莖葉是促進中國南方稻-薯輪作系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)利用的重要手段。因而,明確馬鈴薯莖葉還田對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤理化指標的影響,對稻田的土壤養(yǎng)分和田間微生物群落管理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對作物根系吸收土壤養(yǎng)分以及保證作物正常生長有著巨大的影響[3-4],作物秸稈還田可以增加土壤養(yǎng)分含量,提高微生物群落物種多樣性和穩(wěn)定性,從而改善土壤環(huán)境,有利于作物產(chǎn)量增加。麥稈連續(xù)還田后土壤堿解氮、有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量顯著高于還田前土壤,且還田效果隨還田年限的延長而逐漸提高[5],連續(xù)2年秸稈還田可以均衡耕作層土壤有機質(zhì)分布,改良土壤環(huán)境[6]。細菌作為土壤微生物群落中數(shù)量最多且豐富度最高的微生物種群之一,其群落結(jié)構(gòu)變化常被用作反映土壤質(zhì)量的重要指標[7],還田秸桿的覆蓋度50%可以使土壤微生物群落保持穩(wěn)定水平,覆蓋度70%可提高土壤微生物群落物種多樣性[8]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于馬鈴薯莖葉還田后,土壤理化性質(zhì)和土壤細菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究鮮見報道,此外,土壤微生物群落的物種間互作網(wǎng)絡分析成為表征微生物群落在群體水平上對不同農(nóng)業(yè)措施響應模式的熱點研究方向,可全面反映微生物群落的種間互作模式,而馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落種間互作關(guān)系的影響也鮮見報道。本研究在馬鈴薯莖葉還田后不同時間點采集并測定土壤樣品部分理化指標的動態(tài)變化,并對在45、90 d時采集的土壤樣品的細菌群落基因組16S核糖體DNA V3～V4區(qū)進行高通量測序,以分析土壤理化性質(zhì)、細菌群落物種多樣性、物種組成和物種共生網(wǎng)絡對馬鈴薯莖葉還田的響應?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為解決中國南方地區(qū)馬鈴薯莖葉的資源化利用問題,通過分析馬鈴薯莖葉還田土壤和不還田土壤不同時期的土壤理化指標和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,明確馬鈴薯莖葉還田對土壤理化性質(zhì)和土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響,為中國南方地區(qū)稻-薯輪作系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和土壤微生物群落管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2021年在云南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)教學實驗農(nóng)場進行(102°42′ E,25°22′ N),海拔1920 m,屬于亞熱帶季風性氣候,全年干濕季分明。試驗土壤類型為紅壤,0～30 cm耕層土壤理化性質(zhì):pH 6.57、有機質(zhì)24.70 g/kg、堿解氮86.49 mg/kg、有效磷22.68 mg/kg、速效鉀115.71 mg/kg。

1.2 供試材料

供試馬鈴薯品種為滇薯23(D23)、滇薯1418(D1418),種薯由云南農(nóng)業(yè)大學薯類作物研究所選育。

1.3 試驗設計

D23和D1418采用盆栽種植(盆高30 cm,直徑25 cm),每個品種種植100盆,于2021年3月17日播種,生長周期內(nèi)進行一致的田間管理(盆栽土壤水分含量主要受自然降雨調(diào)節(jié),盆內(nèi)雜草手動及時拔除),并于2021年7月20日收獲馬鈴薯。收獲后分開收集D23、D1418莖葉,并鍘為長度5 cm左右混勻備用。將2個品種的盆內(nèi)土倒出混勻作為整個試驗的背景土壤(處理CK)。試驗設3個處理:D23莖葉還田(處理D23)、D1418莖葉還田(處理D1418)和不還田處理(處理CK),每個處理20盆。還田處理中取背景土壤與0.525 kg馬鈴薯莖葉混勻(按30 000 kg/hm2折算)后裝盆,裝土高度達花盆2/3處(約20 cm),再覆蓋5 cm左右的背景土壤,不還田處理直接將背景土壤裝至花盆5/6處(約25 cm)。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤樣品采集 2021年7月20日收獲馬鈴薯塊莖后,先采集處理CK土樣(第0天),隨后各處理每隔15 d(第15、30、45、60、75和90 天)分別采集花盆內(nèi)15～20 cm土層的土樣,用于分析土壤理化性質(zhì)。同時,將第45天采集的土樣分別設置為處理CK-1、D23-1、D1418-1,第90天采集的土樣設置為處理CK-2、D23-2和D1418-2,用于分析馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。每個處理隨機采集3個重復土樣,裝入無菌袋并放置在冰盒內(nèi)運回實驗室,將3個重復土樣混勻后采用四分法分成2等份,一份于-80 ℃冰箱保存,用于提取土壤總DNA,另一份放置通風處自然風干,用于測定土壤理化指標。

1.4.2 土壤理化性質(zhì)測定 土樣風干后,分別研磨過2.000 mm和0.149 mm篩,參照Wen等[9]的方法分別采用pH計測定土壤pH;堿解擴散法測定土壤堿解氮含量;碳酸氫鈉浸提鉬銻鈧比色法測定土壤有效磷含量;乙酸銨浸提火焰光度計法測定土壤速效鉀含量;低溫外加熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定土壤有機質(zhì)含量。

1.4.3 土壤DNA提取及16S rDNA測序 選取馬鈴薯莖葉不還田(CK)、馬鈴薯莖葉還田后45 d(CK-1、D23-1、D1418-1)、90 d(CK-2、D23-2、D1418-2)3個時期的土壤樣品用于分析土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異。參照試劑盒提取土樣基因組總DNA后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA質(zhì)量,采用細菌通用引物對16S rDNA基因V3～V4區(qū)進行PCR擴增,上游引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′),下游引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產(chǎn)物,并用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)檢測定量。使用 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 構(gòu)建PE文庫,采用Illumina Miseq PE300完成測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司),利用軟件UPARSE以97%的相似度對有效序列進行OUT聚類,使用軟件UCHIME剔除嵌合體,比對Silva數(shù)據(jù)庫,對OTU物種進行分類注釋。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

使用軟件 Excel 2010統(tǒng)計和整理數(shù)據(jù),使用DPS軟件進行方差分析,利用美吉生信云平臺(https://cloud.majorbio.com/)軟件mothur進行物種組成分類注釋和細菌群落物種多樣性指數(shù)計算,利用R語言(version 3.3.1)工具進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖。利用R軟件包ggClusterNet(version 0.1.0)進行土壤微生物群落物種共生網(wǎng)絡構(gòu)建及分析,其中,網(wǎng)絡為物種相關(guān)性網(wǎng)絡,相關(guān)性計算方法為spearman相關(guān),相關(guān)性閾值為0.8,相關(guān)性顯著性閾值為P=0.05,數(shù)據(jù)標準化方法采用“TMM”方法[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯莖葉還田對土壤理化性質(zhì)的影響

從表1可見,土壤pH隨馬鈴薯莖葉還田時間的延長呈先降低后上升趨勢,第30天時,莖葉還田處理顯著高于處理CK。土壤有機質(zhì)含量則隨還田時間延長呈先升后降趨勢,處理D23和D1418在第30天時均顯著高于處理CK,比處理CK平均顯著增加16%;第45、60、75、90天時,處理D23和D1418仍較處理CK有所增加,但差異不顯著。土壤堿解氮含量在還田第60天時,處理D23最高,為227.27 mg/kg,比處理CK顯著增加43.03%;第75天時,處理D1418最高,為225.17 mg/kg,比處理CK顯著增加37.57%;第90天時,莖葉還田處理仍顯著高于處理CK。土壤有效磷含量在還田第60天時處理D23和D1418均顯著高于處理CK,第75、90天時,則有所降低。土壤速效鉀含量隨還田時間推移呈先升后降趨勢,處理D23和D1418在第15天時達到整個還田時期最高值,分別為609.78、578.03 mg/kg,均顯著高于處理CK,第30、45、60、75、90天時,處理D23和D1418仍顯著高于處理CK。說明馬鈴薯莖葉還田可以小幅提高土壤pH,增加土壤有機質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量。

表1 馬鈴薯莖葉還田對土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 土壤細菌α多樣性分析 利用Illumina高通量測序技術(shù),分析土壤細菌群落結(jié)構(gòu)α多樣性。從表2可見,Coverage指數(shù)均高于0.97,表明此次分析的測序深度能代表土壤樣品細菌群落的真實水平。在馬鈴薯莖葉還田第45、90天時,處理D23、D1418的Sobs值和Chao指數(shù)均高于處理CK-1、CK-2和CK(第0天);隨著還田時間的延長,土壤細菌群落Shannon指數(shù)提高,Simpson指數(shù)降低,說明馬鈴薯莖葉還田處理提高了土壤細菌群落的物種豐富度和物種多樣性。

表2 馬鈴薯莖葉還田后土壤細菌α多樣性指數(shù)

2.2.2 土壤細菌群落物種組成差異分析 土壤細菌群落門水平的分類結(jié)果如圖1所示,各處理相對豐度≥1%的有9個門,其他(others)為相對豐度<1%的菌群豐度之和。其中馬鈴薯莖葉還田(處理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)與不還田(處理CK、CK-1、CK-2)在門水平的細菌群落物種組成相似,各處理的優(yōu)勢菌門依次為放線菌門(Actinobacteriota,31.3%～36.8%)、變形菌門(Proteobacteria,18.4%～22.2%)、綠彎菌門(Chloroflexi,15.4%～17.6%)、酸桿菌門(Acidobacteriota,9.5%～14.5%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota,4.5%～5.4%)、粘球菌門(Myxococcota,2.7%～3.7%)、擬桿菌門(Bacteroidota,2.1%～3.5%)、厚壁菌門(Firmicutes,1.7%～3.0%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota,1.0%～1.2%)。還田第45、90天時,與不還田(處理CK)相比,還田處理的土壤細菌群落放線菌門、綠彎菌門相對豐度差異不顯著,酸桿菌門相對豐度有所下降,變形菌門相對豐度則顯著提高,其中處理D23-1、D1418-1比處理CK-1分別提高12.7%和4.1%,處理D23-2、D1418-2比處理CK-2分別提高12.5%和10.3%。

圖1 馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落在門水平相對豐度的影響Fig.1 Effects of potato stem and leaf returning on relative abundance of soil bacterial community at phylum level

2.2.3 馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落β多樣性的影響 利用Bray-curtis距離算法的主坐標分析(Principal coordinates analysis,PCoA)進一步分析屬水平各處理中土壤細菌群落的物種組成差異。如圖2所示,PC1和PC2分別解釋了37.90%和19.11%的差異,馬鈴薯莖葉還田(處理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)與不還田(處理CK-1、CK-2)的Bray-curtis距離較遠,表明莖葉還田處理的土壤細菌群落在屬水平的物種組成與不還田處理差異較大;還田第0天(處理CK)、還田第45天(處理CK-1、D23-1、D1418-1)和還田第90天(處理CK-2、D23-2、D1418-2)土壤細菌群落物種組成的Bray-curtis距離較遠,表明莖葉還田時間顯著影響土壤細菌群落物種組成;而處理D23-1與D1418-1間的距離、處理D23-2與D1418-2間的距離較近,顯示不同品種的馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌屬水平物種組成的影響較小。表明馬鈴薯莖葉還田處理顯著改變土壤細菌群落的物種組成。

圖2 馬鈴薯莖葉還田土壤細菌屬水平物種組成PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of soil bacteria composition at genus level after potato stem and leaf returned to the field

2.2.4 土壤細菌群落物種組成差異分析 基于馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落β多樣性的影響,馬鈴薯莖葉還田(處理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)和不還田(處理CK0、CK-1、CK-2)的土壤細菌群落在屬水平的物種組成差異較大,進一步對還田處理(R treatment)和不還田處理(NR treatment)土壤細菌門到屬水平的差異物種進行線性判別(LDA)分析,LDA閾值為3。如圖3所示,不還田處理顯著提高的差異菌群依次是Vicinamibacterales、微球菌科(Micrococcaceae)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的物種;而還田處理顯著提高的差異菌群依次是變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、粘球菌門(Myxococcota)、根瘤菌目(Rhizobiales)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)、 Gemmatimonadaceae菌科、 粘球菌綱(Myxococcia)、粘球菌目(Myxococcales)、粘球菌科(Myxococcaceae)、黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)、Polyangia菌綱、原囊菌屬(Archangium)的物種。表明在馬鈴薯莖葉還田處理土壤中顯著富集并達到組間顯著性差異的微生物菌群遠多于不還田處理。

圖3 土壤細菌豐度在馬鈴薯莖葉還田處理和馬鈴薯莖葉未還田處理中的線性判別效應分析Fig.3 LEfSe analysis of soil bacterial abundance between treatment with potato stem and leaf returning (R) and treatment without potato stem and leaf returning (NR)

2.2.5 馬鈴薯莖葉還田對土壤細菌群落物種共生網(wǎng)絡的影響 分別對馬鈴薯莖葉不還田處理組和還田處理組土壤的微生物群落中物種豐度最高的前400個物種構(gòu)建物種共生網(wǎng)絡。如圖4所示,還田處理土壤細菌群落物種共生網(wǎng)絡的復雜度和穩(wěn)定性顯著高于不還田處理。同時,在還田處理組和不還田處理組土壤中,細菌群落物種間的互作均主要發(fā)生在酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria);然而,在馬鈴薯莖葉還田處理中,酸桿菌門、放線菌門和變形菌門參與互作物種數(shù)量顯著高于不還田處理,且這3個菌門的物種同其他細菌門物種的互作強度在還田處理中也相應高于不還田處理;此外,馬鈴薯莖葉還田處理土壤細菌群落物種間的正負相關(guān)菌的互作強度也全面提高,特別是放線菌門和酸桿菌門物種間的互作強度顯著提高(圖4-a,4-b),馬鈴薯莖葉還田后,土壤細菌群落物種的共生網(wǎng)絡的拓撲特征全面高于不還田處理(圖4-c)。

a.馬鈴薯莖葉還田處理(R);b.馬鈴薯莖葉未還田處理(NR);c.還田處理較未還田處理土壤細菌群落共生網(wǎng)絡拓撲特征的變化。a. Treatment with potato stem and leaf returning (R); b. Treatment without potato stem and leaf returning (NR); c. The variations of topological properties of networks of soil bacterial communities in the R treatment over which of the NR treatment.

2.3 馬鈴薯莖葉還田后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

對排名前20的土壤優(yōu)勢細菌門與環(huán)境因子進行Spearman相關(guān)性分析,再進行Average聚類。如圖5所示,Latescibacterota、脫硫菌門(Desulfobacterota)與有效磷(Available P,AP)呈極顯著負相關(guān),與堿解氮(Available N,AN)、有機質(zhì)(Organic matter,OM)含量呈顯著正相關(guān);放線菌門與AP含量呈極顯著正相關(guān);Bacteria菌門與AN含量呈極顯著正相關(guān);粘球菌門、Bdellovibrionota菌門與速效鉀(Available K,AK)含量呈極顯著正相關(guān),髕骨菌門(Patescibacteria)、腸桿菌門(Entotheonellaeota)、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、變形菌門與AK含量呈顯著正相關(guān)。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);***表示差異極顯著(P<0.001)。* means significant difference (P<0.05); ** means very significant difference (P<0.01); ***means very significant difference (P<0.001).

3 討 論

3.1 馬鈴薯莖葉還田對土壤理化性質(zhì)與細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

馬鈴薯莖葉還田可提高土壤微生物活性,促進土壤養(yǎng)分分解[11],加速有機物質(zhì)礦化,提高土壤有機質(zhì)含量。本研究中,與處理CK相比,馬鈴薯莖葉還田提高了土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量。這與呂凱飛等[12]在玉米秸稈還田后的結(jié)果一致。程曼等[13]研究表明,長期還田和秸稈直接還田可顯著提高土壤有效氮和有效鉀含量。王學敏等[14]和Hoffland等[15]研究表明,長期秸稈還田和秸稈還田結(jié)合氮肥減量施用可以增加土壤有機質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量,這與本研究結(jié)果相似。土壤有效磷含量在還田第75、90天時較前期有所下降,一部分原因可能是試驗區(qū)域9—10月降雨較多,在連續(xù)降雨的情況下,土壤有效磷淋溶到下層土壤所致[16]。土壤速效鉀含量相比處理CK顯著升高,馬鈴薯為喜鉀作物[17],吸收鉀元素后主要用于莖桿和塊莖的生長發(fā)育,鉀元素在馬鈴薯各器官中一般表現(xiàn)為在莖中含量最高[18],所以馬鈴薯莖葉還田后,莖葉腐解釋放出鉀元素,因而土壤速效鉀含量顯著提高。

土壤微生物可促進有機質(zhì)礦化和影響土壤養(yǎng)分循環(huán)[19],是評價土壤生物學特性、衡量土壤肥力的關(guān)鍵指標。本研究中馬鈴薯莖葉還田第45、90天時土壤細菌物種豐富度和多樣性顯著提高,這與張玉潔等[20]的研究結(jié)果相似。進一步對馬鈴薯莖葉還田和不還田處理進行物種差異分析,發(fā)現(xiàn)莖葉還田處理在第45、90天時顯著富集并達到組間顯著性差異的細菌菌群共有12類,不還田處理中只有4類,可能是馬鈴薯莖葉還田后C/N適宜土壤細菌生長,莖葉腐解釋放的養(yǎng)分利于土壤培肥,為土壤細菌的繁殖提供了充足的養(yǎng)分與能量[21-22]。本研究中,馬鈴薯莖葉還田在第45、90天時土壤變形菌門的相對豐度顯著高于對照處理,酸桿菌門相對豐度較對照處理有所下降。土壤變形菌門廣泛參與土壤氮素循環(huán),是富營養(yǎng)型菌,能在有機質(zhì)等營養(yǎng)元素較高的環(huán)境下較快生長[23],馬鈴薯莖葉腐解后,土壤堿解氮、有機質(zhì)等養(yǎng)分含量增加,提高了土壤變形菌門的豐度;土壤酸桿菌門是一種嗜酸菌,屬于貧營養(yǎng)型菌,富集在養(yǎng)分含量低的環(huán)境中,可以降解土壤有機物[24]。

微生物群落的物種間共生網(wǎng)絡的物種組成和網(wǎng)絡形態(tài)的變化,可直觀展示不同處理對微生物群落的影響,本研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯莖葉還田可提高土壤細菌群落物種的共生網(wǎng)絡的復雜度和穩(wěn)定性,表明馬鈴薯莖葉還田后土壤細菌群體的互作強度提高,其中正負相關(guān)菌群之間的互作強度均顯著提高,不同細菌菌門間的互作強度也呈上升趨勢,微生物群落處于可控狀態(tài),這表明馬鈴薯還田后的土壤微生物活性更強,對添加的莖葉具有更強的礦化能力[25-27],同時也對添加到土壤中的莖葉攜帶的微生物群體具有更強的調(diào)控作用,但是菌群的互作模式依然主要發(fā)生在酸桿菌門、放線菌門和變性菌門的細菌菌群之間。

3.2 土壤理化指標和細菌群落組成的相關(guān)性

土壤理化性質(zhì)與土壤優(yōu)勢細菌群體存在相互作用,較多研究也表明土壤理化指標與土壤細菌群落間具有相互作用[28]。本研究中Latescibacterota菌門、脫硫菌門的菌群與AP呈極顯著負相關(guān),與AN、OM呈顯著正相關(guān)。Latescibacterota是易感染青枯病的桑樹品種植株耕層土壤中特有的優(yōu)勢菌門,脫硫菌門對鹽度、pH和溫度有廣泛的適應性,屬于厭氧細菌,在全球C、S循環(huán)中具有重要作用[29],賴政等[30]研究發(fā)現(xiàn),稻蝦種養(yǎng)模式中因小龍蝦的覓食、挖掘等活動增加土壤透氣性,增加根際土壤氧氣供應,從而降低了土壤脫硫菌門相對豐度。本研究后期,降雨較多造成土壤結(jié)塊,導致細菌脫硫菌門相對豐度提高,可能也是有效磷后期降低的原因。AK與粘球菌門、Bdellovibrionota菌門、髕骨菌門、腸桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和細菌變形菌門7個優(yōu)勢菌門呈顯著正相關(guān),表明馬鈴薯莖葉腐解后為土壤輸送大量鉀元素,補充了前期種植馬鈴薯所消耗的養(yǎng)分,利于細菌群落的生長和繁殖,與前人研究結(jié)果相似[4]。

4 結(jié) 論

馬鈴薯莖葉還田可以顯著影響土壤pH,顯著提高土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量。在馬鈴薯莖葉還田第45、90天時,土壤細菌群落的物種豐富度、物種多樣性顯著提高,土壤群落物種間共生網(wǎng)絡的復雜度及穩(wěn)定性顯著增強。