梁紅妍 申笙 孫劍

作者單位：510515 廣州 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科

HBV感染可引起慢性乙型肝炎(CHB)、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等終末期肝病,嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)WHO報道,全球約有2.96億慢性HBV感染者[1],而我國約有7500萬例,每年因肝硬化、肝衰竭、肝癌等乙型肝炎相關(guān)疾病的死亡人數(shù)約為30萬[2]?，F(xiàn)有的一線抗HBV藥物主要是核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素(IFN)類藥物,可有效抑制HBV復(fù)制,但無法徹底清除感染肝細(xì)胞核內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA),患者難以實(shí)現(xiàn)完全治愈[3]。

一、cccDNA的由來

感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA是HBV感染肝細(xì)胞后,由松弛環(huán)狀雙鏈DNA(rcDNA)通過一系列環(huán)節(jié)修復(fù)而成,目前認(rèn)為大致有以下步驟：(1)去除rcDNA負(fù)鏈5′端共價結(jié)合的病毒聚合酶Pol以及5’-flap;(2)去除rcDNA正鏈 5′端的RNA引物;(3)完成rcDNA正鏈的修復(fù);(4)連接正負(fù)鏈,并進(jìn)一步折疊、扭曲形成超螺旋結(jié)構(gòu)的cccDNA;(5)cccDNA 與組蛋白、非組蛋白等結(jié)合,形成微染色體樣結(jié)構(gòu)[4]。cccDNA作為HBV復(fù)制的原始模板,長期穩(wěn)定存在于被感染細(xì)胞的核內(nèi),是HBV感染慢性化的主要因素之一。

二、cccDNA的檢測方法

目前能夠直接檢測cccDNA的方法中,qPCR缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的cccDNA定量方法,Southern blot方法復(fù)雜且相對不敏感。更重要的是,在感染細(xì)胞中,cccDNA的豐度較低,拷貝數(shù)量少[5],準(zhǔn)確測量cccDNA水平并區(qū)分對其豐度的直接和間接影響在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)。因此,缺乏可靠、可重復(fù)和足夠敏感的檢測方法,導(dǎo)致無法直接篩選影響核內(nèi)cccDNA形成的相關(guān)因素[6]。

三、cccDNA的體外研究

Qi等[7]通過Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組從而誘導(dǎo)HBV重組cccDNA(rcccDNA)產(chǎn)生的策略,首次建立了HBV rcccDNA體外培養(yǎng)細(xì)胞模型。rcccDNA能夠在肝細(xì)胞核中被大量誘導(dǎo)產(chǎn)生,因此能夠作為一種有用的替代分子進(jìn)行HBV cccDNA相關(guān)研究[8]。而Li 等[9]則將Gaussia 熒光素酶報告基因插入到 HBcAg 編碼框中,通過應(yīng)用體外微環(huán) DNA 重組和純化技術(shù)獲得 rcccDNAattR,并證實(shí)其能夠在轉(zhuǎn)染 Huh7 細(xì)胞中產(chǎn)生子代病毒。此外,Yan等[10]利用微環(huán)DNA技術(shù),體外制備了重組HBV共價閉合環(huán)狀DNA,稱為HBVcircle系統(tǒng),可以在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)持續(xù)存在,并表達(dá)HBV相關(guān)抗原和基因組DNA。同時,對該系統(tǒng)進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn),臨床上常見的抗HBV藥物可以有效抑制病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制,為研發(fā)新的抗HBV藥物提供了平臺。

為實(shí)現(xiàn)乙型肝炎的臨床治愈甚至完全治愈,cccDNA的清除是科學(xué)家們致力攻克的難題。其中,直接靶向cccDNA顯然是一個非常具有吸引力的治療策略。近年來,在上述研究平臺的助力下,直接靶向HBV cccDNA形成的宿主因子和小分子化合物等研究取得了一定的進(jìn)展,為抗HBV藥物的研發(fā)提供了新的方向。

四、靶向cccDNA形成的宿主相關(guān)因子

Wei等[11]利用酵母細(xì)胞系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的五種修復(fù)因子：增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、復(fù)制因子C(RFC)復(fù)合物、DNA聚合酶δ(POLδ)、瓣狀結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1(FEN-1)和DNA連接酶1(LIG1),可在體外將HBV rcDNA修復(fù)為cccDNA,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rcDNA正、負(fù)鏈的修復(fù)是相互獨(dú)立的,其中正鏈的修復(fù)需要這五種修復(fù)因子的參與,而負(fù)鏈的修復(fù)只需要FEN-1和LIG1[12]。而Marchetti等[13]通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),鑒定與rcDNA結(jié)合的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)DNA損傷結(jié)合蛋白2 (DDB2)可與rcDNA結(jié)合,進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),DDB2沉默可以降低HBV RNA、HBcAg和HBeAg水平,并影響cccDNA形成。因此,靶向參與cccDNA形成過程的宿主修復(fù)因子,有望成為減少cccDNA的可行策略。

Kinoshita等[14]通過siRNA篩選確定了前mRNA加工因子31 ( PRPF31)與cccDNA的形成相關(guān)。在Hep-AD38細(xì)胞中,siRNA敲低PRPF31可減少cccDNA的形成,但不影響HBcAg和HBV core DNA水平。而Wang等[15]通過篩選具有抗病毒活性的宿主蛋白,發(fā)現(xiàn)干擾素刺激基因MX2的抑制活性最高。其中,MX2可以通過抑制HBV RNA轉(zhuǎn)錄以及病毒復(fù)制發(fā)揮抗HBV效應(yīng),同時也可以通過抑制rcDNA轉(zhuǎn)化成cccDNA來降低肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA水平。

此外,Verrier等[16]建立了一種基于細(xì)胞的HBV cccDNA報告基因檢測方法,通過ELISA檢測分泌的HA標(biāo)記DHBeAg作為cccDNA形成的有效替代標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)對cccDNA的非侵入性監(jiān)測,并鑒定了27個候選cccDNA宿主因子。其中,YBX1在cccDNA形成中的作用在HBV感染模型中被驗(yàn)證,表現(xiàn)為YBX1沉默后,cccDNA水平顯著下降,證實(shí)了它在HBV生命周期的早期階段(病毒進(jìn)入后但在被感染肝細(xì)胞中初始cccDNA庫建立之前)的作用。有趣的是,若病毒已感染HepG2-NTCP細(xì)胞導(dǎo)致初始cccDNA池已經(jīng)建立,此時敲低YBX1,并不會減少HBV感染水平。

以上研究提示,靶向cccDNA形成的宿主因子可能有效減少肝內(nèi)cccDNA。目前發(fā)表的研究表明,已有多種小分子抑制劑能夠靶向部分參與cccDNA形成過程的宿主修復(fù)因子,包括：aphidicolin(DNA聚合酶α和δ抑制劑)、FEN-1核酸內(nèi)切酶抑制劑PTPD、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、DNA連接酶抑制劑以及DNA檢查點(diǎn)激酶ATR和CHK1抑制劑[17]。這些抑制劑在體外細(xì)胞模型中表現(xiàn)出較好的抑制cccDNA合成的能力,但這些抑制劑的成藥性仍有待進(jìn)一步研究。

五、靶向 cccDNA 的小分子化合物

2012 年, Cai等通過將HBeAg作為cccDNA的替代性標(biāo)志物,高通量篩選了一個含85 000種化合物的in-house化合物庫, 最終發(fā)現(xiàn)兩種磺酰胺類化合物(CCC-0975和CCC-0346)可顯著降低細(xì)胞中cccDNA的水平。機(jī)制研究表明, 這兩種化合物通過抑制rcDNA去蛋白化, 進(jìn)而抑制rcDNA形成cccDNA, 最終降低細(xì)胞中cccDNA的水平[18]。這是首次發(fā)現(xiàn)小分子能靶向cccDNA生成,但這種磺酰胺類似物的確切機(jī)制尚未被闡明。

2016年, Liu等[19]通過篩選中草藥化合物庫, 發(fā)現(xiàn)3種化合物(punicalagin、punicalin以及geraniin)以劑量依賴的方式顯著減少HBeAg和cccDNA的產(chǎn)生。機(jī)制研究表明,這些化合物通過抑制cccDNA的形成,并促進(jìn)cccDNA的衰變,從而下調(diào)HBV cccDNA水平。

2022 年,Chen等通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)氧雜蒽酮類是一種新型HBV cccDNA抑制劑, 隨后通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化鑒定出具有高抗病毒活性和藥代動力學(xué)特征的先導(dǎo)化合物。其中,代表性化合物59在HBVcircle小鼠模型中,可顯著下調(diào)血清中HBsAg、HBeAg以及肝內(nèi)cccDNA的水平[20]。此外,Wang等[21]通過在HBV感染的人原代肝細(xì)胞和HepDES19細(xì)胞中高通量篩選發(fā)現(xiàn)一種可降低cccDNA水平的小分子化合物ccc_R08,并在HBVcircle小鼠模型及人肝嵌合小鼠模型中得到驗(yàn)證。該研究顯示ccc_R08可降低小鼠血清中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、pgRNA及肝細(xì)胞中的cccDNA水平,這是首次發(fā)現(xiàn)有小分子可作用于已建立的cccDNA庫,為徹底清除cccDNA提供了一種新的途徑。

與靶向cccDNA形成的宿主因子相比,直接靶向cccDNA可能更具有特異性,但這兩類小分子化合物目前仍處于臨床前研究階段,尚未有研究橫向比較它們的有效性。同時,直接靶向cccDNA相較于靶向cccDNA形成的宿主因子是否更具安全性,仍需要更多的研究論證。

綜上,cccDNA是HBV復(fù)制的原始模板,長期穩(wěn)定存在于被感染細(xì)胞的核內(nèi),是導(dǎo)致HBV感染慢性化的主要因素之一。科學(xué)家們一直在致力于研發(fā)清除cccDNA的策略,并在直接靶向HBV cccDNA形成的宿主因子和小分子化合物等方面取得了一定的研究進(jìn)展,為抗HBV藥物的研發(fā)提供了新的方向,為實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈指明了道路,為cccDNA的清除和乙型肝炎的完全治愈帶來希望。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。