陳茜 朱鵬

膽囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是臨床上十分常見的消化道惡性腫瘤,導致了十分嚴重的社會及醫(yī)療負擔[1]。全球每年新發(fā)GBC患者約12萬,超過70%的新發(fā)GBC患者在亞太地區(qū),每年約8萬患者因GBC病死,標準化病死率為0.84/10萬人,是發(fā)病率及致死率都較高的消化道惡性腫瘤[1, 2]。由于膽囊的解剖學位置和功能特殊,GBC患者早期無顯著的臨床表現(xiàn)及體征,且缺少篩查特異性的生物學標志物,GBC在確診時通常都處于疾病中晚期,喪失了手術根治性切除的機會,患者預后通常較差,短期病死率高[3]。流行病學資料顯示,GBC的總體生存率(overall survival,OS)極低,未經(jīng)根治性手術治療的GBC患者3年總體OS低于30%[4]。類似其他實體惡性腫瘤,GBC致病及進展的相關機制十分復雜,目前尚未完善闡明[5, 6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在人體內廣泛分布的不具有編碼功能的小RNA,miRNA通常由19～24個核苷酸組成,其功能主要依靠直接結合到特定靶基因的3′-非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)來影響該基因翻譯為功能蛋白,從而對機體各類病理生理過程發(fā)揮調控作用[7]。既往研究顯示,miRNA在GBC的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著十分重要的調控作用[8]。基于此,本文對GBC中miRNA的調控功能及臨床應用方面的研究進展進行了簡要綜述,以期為臨床診療提供參考。

一、特異性miRNA參與調節(jié)GBC發(fā)生及發(fā)展

GBC作為惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,其致病機制十分復雜,多個分子信號通路在其中相互影響,導致了GBC的發(fā)生[9]。特異性miRNA表達水平的改變也在GBC的發(fā)生中發(fā)揮重要調控作用,相關的研究方面也積累了大量證據(jù)。Su等[10]研究顯示,通過生物信息學數(shù)據(jù)庫篩選出GBC中存在159個在GBC中表達存在異常的特異性miRNA,包含34個上調miRNA及125個下調的miRNA。數(shù)據(jù)分析顯示,表達增強的miRNA-125a-3p、miRNA-4647,以及表達降低的miRNA-29c-5p、miRNA-145a-5p、miRNA-192-5p、miRNA-194-5p、miRNA-339-8-3p的改變差異最為明顯,且與GBC患者的生存預后存在相關性。基于信息學分析,同時還發(fā)現(xiàn)STEAP3-AS1/hsa-miR-192-5p/MAD2L1信號傳導通路在調控GBC腫瘤細胞的細胞周期及增殖中具有重要調控作用。Cao等[11]基于生物信息學數(shù)據(jù)庫的分析顯示,來源于GBC患者的腫瘤組織中存在25個表達升高的miRNA及97個表達下降的miRNA,其中 miRNA-4430及miRNA-642a-3p升高最為明顯,miRNA-451a及miRNA-145-5p降低最為明顯,基于GO及KEGG分析顯示,上述miRNA的調節(jié)基因主要為mTOR及PI3K-Akt信號通路的相關功能蛋白,上述信號通路主要在細胞周期及凋亡作用中發(fā)揮重要調控作用。Tong等[12]納入了39名GBC患者,結果顯示,GBC患者原位腫瘤組織中的miRNA-197表達顯著升高,且其升高程度與患者不良預后存在相關性。在細胞模型中降低miRNA-197的表達可抑制GBC細胞增殖并促進細胞凋亡。雙熒光素酶實驗顯示,miRNA-197可以直接結合到IGFBP3的3-UTR,從而抑制其表達,并降低增殖相關蛋白p-ERK1/2、pAKT的表達,并增加凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2、caspase-3的表達,從而實現(xiàn)上述調控功能。Ouyang等[13]研究也發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC腫瘤組織中的miRNA-146b-5p表達顯著降低,而對應的靶向調控基因Toll樣受體4(TLR4)的表達則顯著升高。進一步研究表明,miRNA-146b-5p表達減少可導致TLR4表達增高,從而激活NF-κB信號通路,增強腫瘤細胞的增殖能力。同時,研究者還在BALB/c裸鼠異種移植瘤模型中進行了驗證,通過分子技術增強miRNA-146b-5p的表達則可達到縮小腫瘤體積、抑制腫瘤細胞生長的作用,這也提示了miRNA-146b-5p/TLR4/NF-κB信號通路在調節(jié)GBC致病中具有重要的功能作用。Wang等[14]對GBC腫瘤組織中miRNA的表達情況進行了分析,結果顯示,與健康對照相比,長期存活GBC及短期存活GBC患者分別存在104級124個特異性miRNA的表達異常。長期存活GBC患者的miRNA-1421a-5p、miRNA-146b-5p,以及短期存活患者的miRNA-30a-3p、miRNA-660-5p、miRNA-338-3p的表達差異最為明顯。富集分析顯示,在短期存活GBC患者中miRNA失調涉及46個生物學過程及44個信號通路功能的紊亂等。上述研究結果均提示了特異性miRNA在調控GBC腫瘤細胞增殖中的重要作用,但是由于目前研究技術和生物信息學分析工具的限制,對于特異性miRNA在GBC致病中作用的分析往往只能從單一的信號通路入手,而一些特異性miRNA及其下游的功能蛋白可能在多個信號通路中發(fā)揮作用,因此未來還需要更為優(yōu)良的分析方法來進一步闡述miRNA參與GBC的致病機制。

另一方面,侵襲及轉移是惡性腫瘤最重要的特點,也是導致患者臨床預后不佳的重要原因之一。GBC惡性程度較高,其侵襲及遠處轉移在臨床上也十分常見。特異性miRNA作為調控GBC腫瘤細胞功能的重要因子,大量研究證據(jù)也顯示其參與了對GBC侵襲及遠處轉移的調控。Zhang等[15]最新研究發(fā)現(xiàn),在來源GBC患者的腫瘤組織及模型細胞系(GBC-sd、SGC-996)中均可觀察到miRNA-182的表達升高。在模型細胞中降低miRNA-182的表達則可以顯著減弱GBC細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用,降低波形蛋白表達,增高E-cadherin表達,從而減弱腫瘤細胞侵襲及遷移的能力。機制分析顯示,FOXN3是miRNA-182的靶向調控基因,miRNA-182可以直接結合到FOXN3的3-UTR,從而抑制FOXN3表達,并激活Wnt/β-catenin信號通路,促進EMT的發(fā)生。Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn),來源于GBC患者的腫瘤組織中存在miRNA-4733-5p表達顯著升高,而KLF7(krppel-like facotr-7)表達則顯著降低。機制分析顯示,KLF7是miRNA-4733-5p的靶向調控基因。同時研究者還在移植瘤動物模型上進行了驗證,結果顯示miRNA-4733-5p可以促進GBC腫瘤細胞的增殖并增強其侵襲能力,其也主要通過抑制KLF7的表達來實現(xiàn)上述功能調控作用。Jiang等[17]研究也發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC腫瘤組織中miRNA-365的表達顯著降低,增強miRNA-365的表達則可顯著抑制GBC模型細胞的增殖及轉移能力。熒光素酶分析顯示Ras相關C3肉毒毒素底物1 (RAC1)是miRNA-365的直接調控靶點。特異性miRNA-365表達降低的同時RAC1表達增強,并促進GBC的侵襲能力顯著升高。

二、特異性 miRNA用于GBC診斷及預后的臨床價值

GBC起病隱匿,早期通常無顯著臨床癥狀和體征,大量患者在臨床確診時已處于疾病中晚期,失去了根治性手術的機會,導致GBC的總體預后不佳[18]。臨床上對GBC的早期診斷及準確評估有助于及時指導臨床干預措施,從而最大限度地改善GBC患者的預后。目前針對GBC的早期診斷方法包括血清學指標及影像學檢查,均存在診斷特異度較低的不足,臨床上也一直在尋找改進GBC早期診斷的方法[19]。Yang等[20]基于多中心患者的研究發(fā)現(xiàn),GBC患者存在血清miRNA-552-3p、miRNA-581、miRNA-4433a-3p、miRNA-496和miRNA-203b-3p表達的升高。同時,研究者建立了聯(lián)合上述5項miRNA的早期診斷模型,并在患者隊列中進行了驗證(包含102名GBC患者及112名慢性膽囊炎患者多作為對照),結果顯示,聯(lián)合模型診斷GBC的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.905,靈敏度和特異度分別為81.37%和86.61%,且診斷準確度甚至優(yōu)于血清糖類抗原-199(carbohydrate antigen-199,CA-199)及癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)。莊琰等[21]基于中國GBC患者的研究也顯示,使用血清miRNA-29c-3p水平作為無創(chuàng)指標診斷GBC的AUC可達71.7%,診斷靈敏度和特異度分別為82.4%和64.5%。此外,使用血清miRNA-29c-3p聯(lián)合多層螺旋CT及血清lnc RNA TUG1用于診斷GBC的AUC可達85.5%,診斷靈敏度及特異度分別為78.4%及90.8%,提示miRNA-29c-3p聯(lián)合影像學等指標用于GBC的早期臨床診斷具有較高的價值。上述研究結果提示血清特異性miRNA作為無創(chuàng)生物學指標診斷GBC具有一定的臨床價值,但是目前的研究證據(jù)仍不夠充分,還需要更多深入的前瞻性研究對miRNA的臨床診斷價值進行驗證,包括嘗試建立包含miRNA的聯(lián)合診斷模型等來改進對GBC的診斷。

特異性miRNA不僅在用于GBC的診斷上具有潛在的臨床價值,對于GBC的預后評估也體現(xiàn)了一定價值,在這方面也積累了大量的研究證據(jù)。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-139-5p表達顯著降低,且低miRNA-139-5p表達與不良預后存在顯著的相關性。同時機制研究也顯示,丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)是miRNA-139-5p調控的直接作用靶點,miRNA-139-5p能夠抑制PKM2表達,從而影響GBC細胞的能量代謝能力。在動物實驗中也發(fā)現(xiàn),增強miRNA-139-5p表達可顯著抑制GBC細胞的增殖、遷移及侵襲。Lv等[23]開展的臨床研究納入了159名GBC患者,收集了患者的腫瘤組織及匹配的癌旁組織,并檢測了組織中的miRNA-146-5p表達程度。結果顯示,GBC腫瘤組織中的miRNA-146-5p表達程度顯著降低,且miRNA-146-5p表達與TNM分期(P=0.009)、肝臟轉移(P=0.001)及腫瘤低分化(P=0.001)存在相關性。Kaplan-Meier生存分析顯示,高表達miRNA-146-5p的GBC患者總體生存期高于miRNA-146b-5p低表達患者(P=0.0005),且低miRNA-146b-5p表達是GBC患者不良預后的獨立預測因子。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-204表達較健康對照組顯著降低,且低miRNA-204表達程度與高臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、遠處轉移及低分化存在正相關。機制分析顯示,miRNA-204主要通過直接靶向抑制Notch2的表達,從而參與對GBC腫瘤細胞的細胞周期及凋亡功能的調控。同時基于患者隨訪(3年)的結果發(fā)現(xiàn),低miRNA-204是患者臨床預后的獨立危險因素(OR=2.35,P<0.01)。徐順林等[25]研究也發(fā)現(xiàn),GBC患者存在血清miRNA-187表達升高及miRNA-143表達的顯著降低,miRNA-187及miRNA-143表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期存在相關性。單因素分析顯示,高miRNA-187表達或低miRNA-143表達的GBC患者3年OS更低。多因素Logistic回歸分析顯示,TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)(OR=3.529,P=0.029)、淋巴結轉移(OR=4.208,P=0.001),高miRNA-187表達(OR=3.626,P=0.013)、低miRNA-143表達(OR=3.758,P=0.004)是影響GBC患者3年OS的獨立影響因素。上述研究結果均顯示了使用特異性miRNA來作為GBC患者的臨床預后指標具有重要的臨床價值。

三、靶向miRNA的治療GBC的臨床價值

由于GBC患者在確診時通常分期較晚,喪失了根治性手術治療的機會,臨床預后通常較差。目前對于早期GBC的治療主要推薦外科根治性手術,而對于中晚期GBC患者,包括放化療在內的治療方法均不能獲得滿意的療效,中晚期GBC患者通常在較短時間病死[26]。臨床上也一直在探索針對GBC患者的更為安全有效的特異性藥物?；谔禺愋詍iRNA在GBC的發(fā)生與致病中的重要作用,也有大量研究嘗試靶向特異miRNA的方式來治療GBC,也取得了一些重要的研究進展。然而,這些方法目前仍只是停留在細胞及動物模型層面,距離臨床實際應用尚有問題需要克服。

其一,研究數(shù)據(jù)也顯示,直接通過調控特異性miRNA的表達水平來發(fā)揮對腫瘤的抑制作用存在可能。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn),GBC患者的腫瘤組織及模型動物中均存在miRNA-195-5p表達的顯著降低。熒光素酶分析顯示,miRNA-195-5p能夠靶向抑制GBC細胞中的FOSL1表達,而FOSL1是參與腫瘤細胞周期調控的重要功能蛋白,其能夠通過激活下游的Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖的調控。研究者還發(fā)現(xiàn),通過基因轉染來增強miRNA-195-5p的表達能夠顯著抑制GBC細胞的增殖及侵襲能力,從而發(fā)揮對腫瘤的抑制作用,這也提示miRNA-195-5p可能作為治療GBC的重要靶點。Yan等[28]研究也發(fā)現(xiàn),與健康對照相比,GBC腫瘤干細胞中miRNA-4461表達顯著降低,增強細胞模型中的miRNA-4461的表達可限制抑制GBC細胞的增殖,同時降低腫瘤細胞的侵襲能力。功能分析顯示,miRNA-4461主要靶向抑制EGFR的表達,從而影響下游的AKT活性,來發(fā)揮對腫瘤細胞的抑制作用。Li等[29]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-188-5p表達顯著降低,且miRNA-188-5p下降程度與更大的腫瘤體積、更多的淋巴結及廣泛遠處轉移相關。同時miRNA-188-5p高表達患者的OS比miRNA-188-5p低表達患者更長。增強miRNA-188-5p的表達可抑制GBC腫瘤細胞的增殖能力,并減弱腫瘤侵襲能力。機制分析顯示,miRNA-188-5p能夠調控GBC中的Wnt/β-catenin信號通路及p-38/JNK信號通路功能,從而實現(xiàn)上述作用。

其二,特異性miRNA也可能作為輔助治療方法來改善常規(guī)化療的療效。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn),GBC細胞模型(GGC-SD和SGC-996細胞株)中存在miRNA-335表達的顯著降低,且miRNA-335降低程度與腫瘤體積及臨床分期密切相關。通過轉染miRNA-335微粒來增強GBC模型細胞對5-氟氟嘧啶的敏感度,并抑制腫瘤細胞的增殖。機制分析也顯示miRNA-335主要通過抑制MEF2D基因的表達,從而影響腫瘤細胞周期中G1/G0期。Gong等[31]研究發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC患者原位腫瘤組織中的miRNA-1231表達顯著降低,且miRNA-1231表達越低、腫瘤體積越大、分期越晚,總體預后更差。熒光素酶分析顯示FOXC2是miRNA-1231的靶向調控基因?；诩毎Ｐ偷难芯匡@示,通過增強miRNA-1231表達,可抑制FOXC2的轉錄,從而減弱GBC的增殖,并增強腫瘤細胞的凋亡作用。此外,研究還發(fā)現(xiàn),升高miRNA-1231的表達還可增強GBC腫瘤細胞對化療藥物多西他賽的敏感度,增強藥物療效。Yang等[32]研究發(fā)現(xiàn),GBC模型細胞中miRNA-193a-3p表達顯著降低,通過增強miRNA-193a-3p表達可減弱GBC腫瘤細胞的增殖能力,誘導腫瘤細胞凋亡。研究者在移植瘤小鼠模型中還發(fā)現(xiàn),增加miRNA-193a-3p表達可以增強GBC腫瘤對曲美替尼治療敏感度,增強藥物療效。機制分析顯示,miRNA-193a-3p主要通過靶向調控基因KRAS的表達來實現(xiàn)上述功能。上述研究結果也初步顯示,特異性miRNA在用于改善GBC患者對化療藥物敏感性方面具有潛在的臨床價值。

四、問題及展望

綜上所述,特異性miRNA在GBC的致病及進展中發(fā)揮著十分重要的調控功能。同時作為檢測較為便捷的無創(chuàng)生物學指標,特異性miRNA在用于GBC的早期診斷及預后評估方面也積累了一定的證據(jù),顯示出了較高的價值。靶向特異性miRNA用于GBC治療的研究目前仍停留在細胞及動物模型階段,距離臨床實際應用仍有巨大的差距。下一步仍需深入探討miRNA參與調控GBC發(fā)生及發(fā)展的具體生物學機制,從而為篩選臨床診斷評估指標及探索更為安全有效的分子靶向治療方法提供參考,使更多的GBC患者從中獲益。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。