蘇 杰 楊馥宇 李 猛 蔣利生

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是一種與長期糖尿病相關(guān)的微血管疾病,大約1/3的糖尿病患者會受到DR影響[1-2]。DR發(fā)病機制復(fù)雜,包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、新生血管等多種因素[3]。在DR最后階段,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)異常產(chǎn)生并釋放,導(dǎo)致新生血管形成,而視網(wǎng)膜新生血管是導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離、玻璃體積血和視力下降的主要原因[4-5]。目前,抗VEGF藥物成為了DR治療的一線選擇,如貝伐珠單抗(BEV)[4]。然而,在哺乳動物體內(nèi)存在一種內(nèi)源性VEGF抑制劑,即可溶性VEGF受體-1(sFlt-1),其能夠與VEGF結(jié)合,抑制VEGF分子功能,但正常生理條件下,VEGF與sFlt-1處于動態(tài)平衡狀態(tài),起到相互制約的作用。有研究表明[6],過表達sFlt-1可顯著抑制視網(wǎng)膜血管生成。因此,內(nèi)源性VEGF/sFlt-1分子軸可能成為治療DR的關(guān)鍵靶點。

京尼平苷(Gen)是一類環(huán)烯醚苷類化合物,具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗心肌功能障礙等多種藥理活性[7]。Gen在DR體外和體內(nèi)模型中均發(fā)揮著抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用,可減輕視網(wǎng)膜細胞和視網(wǎng)膜屏障的損傷[8]。Gen具有抑制VEGF表達作用,從而阻止血管生成[9]。因此,本研究推測Gen可能通過調(diào)控內(nèi)源性VEGF/sFlt-1分子軸對DR患者血管新生產(chǎn)生抑制作用。本研究擬通過高糖條件培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(hRVECs)模擬體外高糖模型,研究Gen對hRVECs增殖和血管形成能力的影響,并探討其作用機制,旨在為DR治療研究提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

hRVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司。Gen(≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;BEV購自美國MedChemExpress公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司;兔抗人VEGF-A多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體均購自英國Abcam公司;兔抗人sFlt-1多克隆抗體購自美國Invitorgen公司。

1.2 CCK-8檢測hRVECs增殖活性

(1)取對數(shù)生長期hRVECs,以每孔1.5×103個細胞的密度接種于96孔板中,待細胞生長至約70%融合度時,采用不同濃度(0、1、5、10、20、40、80 mg·L-1)Gen處理24 h。(2)取對數(shù)生長期hRVECs,以每孔1.5×103個細胞的密度接種于96孔板中,待細胞生長至約70%融合度時,加入含25 mmol·L-1葡萄糖的DMEM誘導(dǎo)hRVECs[10],同時分別加入不同濃度(5、10、20 mg·L-1)Gen或250 mg·L-1BEV,培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育4 h。酶標儀檢測450 nm處吸光度,計算細胞增殖活性。

1.3 細胞分組處理

將對數(shù)生長期的hRVECs分為:對照組,高糖組,Gen低、中、高濃度組,BEV組和Gen高濃度+BEV組。除對照組采用含2.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM進行培養(yǎng)外,其他組均采用含25 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)。Gen低、中、高濃度分別為5、10、20 mg·L-1,BEV組、Gen高濃度+BEV組中BEV 濃度均為250 μg·L-1[11],Gen高濃度+BEV組中的Gen 濃度為20 mg·L-1。

1.4 劃痕實驗檢測hRVECs遷移能力

實驗前于6孔板背后,每隔1 cm劃一道橫線,橫穿過孔。取對數(shù)生長期hRVECs接種于該6孔板,每孔加5×105個細胞,培養(yǎng)過夜。用無菌槍頭垂直于孔板背后橫線進行劃痕,PBS洗去劃落的細胞,按照1.3中分組加藥干預(yù)后培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察劃痕處細胞遷移情況。計算劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.5 體外成管實驗檢測hRVECs成管能力

取對數(shù)生長期hRVECs,按照1.3中分組加藥處理24 h。提前取 Matrigel基質(zhì)膠鋪設(shè)于24孔板中,每孔250 μL,靜置1 h備用。收集加藥處理后的各組細胞,制備單細胞懸液,向24孔板中加入細胞懸液,每孔500 μL,培養(yǎng)4 h。顯微鏡下觀察隨機視野中細胞成管情況。

1.6 Western blot檢測hRVECs中VEGF-A、sFlt-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

取對數(shù)生長期hRVECs,按照1.3中分組加藥處理24 h。取所有組細胞沉淀,裂解提取總蛋白,BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳后,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗(VEGF-A稀釋比11 000,sFlt-1稀釋比150,MMP-2稀釋比1500,MMP-9稀釋比11 000,GAPDH稀釋比11 000),4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(稀釋比110 000),室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑,于暗室中顯影曝光,分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Gen對高糖誘導(dǎo)下hRVECs增殖活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示,與0 mg·L-1Gen比較,1、5、10、20、40、80 mg·L-1Gen對 hRVECs增殖活性的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(圖1A)。與對照組比較,高糖組hRVECs增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs增殖活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖1B)。提示Gen可以抑制高糖條件下hRVECs增殖活性。

A:CCK-8檢測不同濃度Gen干預(yù)后的hRVECs增殖活性。B:CCK-8檢測不同濃度Gen干預(yù)后高糖條件下hRVECs增殖活性;1:對照組;2:高糖組;3:Gen低濃度組;4:Gen中濃度組;5:Gen高濃度組。與對照組比較,**P<0.01;與高糖組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

2.2 Gen對高糖誘導(dǎo)下hRVECs遷移及血管形成能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示,對照組、高糖組、Gen低濃度組、Gen中濃度組和Gen高濃度組細胞劃痕愈合率分別為(74.15±5.75)%、(90.39±6.93)%、(65.46±6.46)%、(56.97±8.40)%、(36.51±9.53)%。與對照組比較,高糖組hRVECs遷移能力增強,劃痕愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs細胞遷移能力減弱,劃痕愈合率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),呈Gen濃度依賴性(圖2)。細胞成管實驗結(jié)果顯示,與對照組比較,高糖組hRVECs環(huán)行管狀結(jié)構(gòu)增多。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs環(huán)行管狀結(jié)構(gòu)逐漸減少(圖3)。

圖2 Gen對高糖條件下hRVECs遷移能力的影響

圖3 Gen對高糖條件下hRVECs血管形成能力的影響

2.3 Gen對高糖誘導(dǎo)下hRVECs中VEGF/sFlt-1軸相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,高糖組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),而sFlt-1蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平逐漸降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),而sFlt-1蛋白表達水平逐漸升高(均為P<0.05),呈濃度依賴性(圖4)。

1:對照組;2:高糖組;3:Gen低濃度組;4:Gen中濃度組;5:Gen高濃度組。與對照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與高糖組比較,#P<0.05,###P<0.001。

2.4 Gen通過調(diào)控VEGF/sFlt-1軸抑制高糖誘導(dǎo)的hRVECs增殖和血管生成

CCK-8檢測結(jié)果顯示,高糖組、Gen高濃度組、BEV組和Gen高濃度+BEV組hRVECs增殖活性分別為(100.00±6.93)%、(65.84±6.38)%、(55.23±10.36)%、(39.16±6.72)%。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs增殖活性均降低(均為P<0.05);與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs增殖活性降低(P<0.05)。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs 中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著降低,sFlt-1蛋白表達水平均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05);與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平進一步降低,sFlt-1蛋白表達水平進一步升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05,圖5)。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs環(huán)形管狀結(jié)構(gòu)均減少;與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs中幾乎沒有環(huán)形管狀結(jié)構(gòu)的細胞簇(圖6)。

1:高糖組;2:Gen高濃度組;3:BEV組;4:Gen高濃度+BEV組。與高糖組比較,***P<0.001;與Gen高濃度組比較,###P<0.001。

圖6 體外成管實驗檢測各組細胞成管能力

3 討論

視網(wǎng)膜是一種由視桿和視錐感光感受器細胞組成的多層網(wǎng)絡(luò),與雙極細胞和神經(jīng)節(jié)細胞結(jié)合,通過將從光中獲得的信息編碼為神經(jīng)脈沖來實現(xiàn)視覺[12]。視網(wǎng)膜由廣泛的血管系統(tǒng)提供氧氣和營養(yǎng),當機體出現(xiàn)高血糖水平時,會增加血-視網(wǎng)膜屏障的通透性,導(dǎo)致血液滲漏至視網(wǎng)膜中,且高血糖也會阻塞視網(wǎng)膜毛細血管,阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的輸送,造成視網(wǎng)膜的進一步損傷[13-14]。DR發(fā)病過程中,主要表現(xiàn)有視網(wǎng)膜血管通透性增加,毛細血管閉塞,視網(wǎng)膜缺血、缺氧,血管生成因子釋放和新生血管形成等[15]。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞被認為是糖尿病誘導(dǎo)血管損傷的主要細胞靶點,高血糖通過不同的機制致使視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞遷移、增殖等生物學(xué)行為加強,引起微血管功能障礙或最終導(dǎo)致新生血管生成[16-17]。與上述研究結(jié)果相似,在本研究中,高糖誘導(dǎo)下的hRVECs增殖活性、遷移能力和血管形成能力增強。大量研究[18-20]顯示,多種天然產(chǎn)物可抑制hRVECs增殖、遷移和血管生成,在治療DR方面具有很大的潛在價值。Gen具有抗炎、抗血管生成等藥理作用,研究發(fā)現(xiàn),Gen可抑制血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)功能、基底膜形成、血管通透性,減輕VEGF誘導(dǎo)的血管生成[9]。本研究采用Gen干預(yù)高糖誘導(dǎo)后的細胞,發(fā)現(xiàn)細胞增殖活性、遷移能力和血管形成能力減弱,且高濃度Gen的抑制作用更明顯,提示Gen對高糖誘導(dǎo)的hRVECs增殖、遷移和血管形成具有抑制作用,與上述研究結(jié)果一致。

糖尿病環(huán)境刺激多種MMPs的分泌,MMP-2和MMP-9在DR早期可能通過破壞線粒體促進視網(wǎng)膜毛細血管細胞凋亡,在DR晚期,誘導(dǎo)新生血管形成,因此,MMP具有成為DR治療靶標的潛在價值[21-23]。VEGF與MMPs之間存在作用關(guān)系,VEGF能誘導(dǎo)MMPs表達以促進視網(wǎng)膜新生血管形成[24]。VEGF有很多亞型,VEGF-A是DR最重要的致病因子之一[4]。VEGF-A在DR中表達上調(diào),被確定為DR發(fā)病機制的關(guān)鍵驅(qū)動因素。sFlt-1是一種可溶性的VEGF拮抗劑,與VEGF之間的動態(tài)平衡狀態(tài)對維持血管生長平衡具有重要作用[25]。sFlt-1可抑制細胞增殖、侵襲、遷移和血管形成,抑制VEGF/MMP-2/MMP-9軸的表達[26]。BEV是一種完全人源化的免疫球蛋白G1分子,是VEGF特異性抗體,可與VEGF-A亞型結(jié)合并抑制其表達,阻斷VEGF-A對新生血管形成和血管通透性增加的誘導(dǎo)作用,可用于治療DR[4,27-28]。本研究采用BEV作為VEGF-A抑制劑與Gen聯(lián)合使用,探討Gen是否通過調(diào)控VEGF-A表達而發(fā)揮作用,結(jié)果顯示,BEV與Gen均對高糖誘導(dǎo)的hRVECs增殖和血管形成產(chǎn)生抑制作用,下調(diào)VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達,上調(diào)sFlt-1表達水平,且Gen與BEV聯(lián)合作用效果更顯著,提示Gen可能與BEV的作用機制相似,對VEGF/sFlt-1軸平衡具有調(diào)控作用。

4 結(jié)論

Gen可通過調(diào)控VEGF/sFlt-1軸平衡,對高糖誘導(dǎo)的hRVECs增殖、遷移與血管形成發(fā)揮抑制作用,本研究結(jié)果提示,Gen對DR治療具有一定的藥用價值,值得深入研究與應(yīng)用,且VEGF/sFlt-1軸可能是Gen在DR治療中的一個有前途的靶點。