丁 寧 韋慶波 劉成勇 鄧偉民 徐 倩 高衛(wèi)萍

干眼是一種常見的眼科疾病,由于患者淚液分泌不足或蒸發(fā)過多,導致淚液的質(zhì)和量、自然流動性出現(xiàn)異常,引起淚膜不穩(wěn)定、眼表損害,從而導致眼部不適及視功能障礙?；颊咄ǔ杏X眼睛疲勞、干澀、異物感、燒灼感、眼脹感、疼痛甚至畏光[1]。流行病學調(diào)查顯示,干眼的發(fā)病率為5%～50%,女性患者多于男性,老年患者多于青年[2]。炎癥反應是干眼發(fā)生的核心病理機制[3],抑制眼表炎癥是治療干眼的關(guān)鍵。目前,針對水液缺乏型干眼的局部抗炎治療中,最常使用皮質(zhì)類固醇(氟米龍和洛替潑諾依特博酯)和環(huán)孢素A 等藥物,但是長期使用皮質(zhì)類固醇會出現(xiàn)明顯的副作用,如繼發(fā)性青光眼、眼部感染和白內(nèi)障等[4]。研究發(fā)現(xiàn),針刺可以促進淚腺代謝,增加淚液分泌,緩解干眼癥狀[5-6]。盡管臨床研究支持使用針刺治療干眼,但針刺發(fā)揮作用的機制尚不明確。本研究通過全身施用氫溴酸東莨菪堿建立兔干眼模型[7],探討針刺對干眼兔角膜形態(tài)學及角膜組織NF-κB信號通路的影響,分析針刺對干眼的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

角膜染色濾紙條(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司),華佗牌一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療器械廠),WQ1002韓氏電針治療儀(安隆光電技術(shù)公司),酶標儀(美國Bio-TeK公司),凝膠成像儀(美國BioRad Laboratories公司),角膜共焦顯微鏡(德國Heidelberg公司);鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥有限公司),BCA試劑盒(美國Pierce公司),氫溴酸東莨菪堿標準品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司),抗體pNF-κB p65(美國Cell Signaling Technology公司),β-actin(美國Santan Cruz公司),NK-κB p65(美國ENZO公司),辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(美國FcMACS公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組

選擇24只2～3個月齡健康新西蘭兔(南京青龍山動物養(yǎng)殖場),雌雄不拘,體重約1.5 kg。實驗前所有動物眼前節(jié)檢查均無異常,淚液流量每5 min均大于10 mm。將動物安置于室溫安靜環(huán)境中,相對濕度為60%±5%,交替12 h光暗循環(huán),提供充足水和標準飼料。依據(jù)隨機數(shù)字表法將兔分為4組,每組6只,分別為空白組、模型組、假針刺組、針刺組。

本實驗方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學動物保護與使用委員會批準(批號:201809A018)。本研究動物處理遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.2.2 觀察指標

造模后第0、21、28、35天分別進行角膜熒光素染色,第35天進行角膜共焦顯微鏡檢查,之后處死動物,在光學顯微鏡、透射電子顯微鏡下觀察角膜形態(tài)學變化,采用Western blot檢測角膜組織NF-κB蛋白的表達。

1.2.3 角膜熒光素染色評分

將角膜染色濾紙條濕潤后輕點下眼瞼穹隆部,使兔眨眼數(shù)次,讓其彌散分布。用鈷藍濾光片對角膜上皮損傷進行分級。把角膜分為四個象限,分別進行評分,每個象限0～3分,0分不染色,1分為5個以下點染,2分為5個及以上點染,3分為塊狀染色,最后將各象限分數(shù)相加,滿分12分。

1.2.4 角膜共焦顯微鏡檢查

將實驗兔頭部固定于角膜激光共焦顯微鏡前,用鹽酸奧布卡因滴眼液行表面麻醉,置開瞼器,在40倍水浸式圓錐狀物鏡表面上涂唯地息透明凝膠,將鏡頭緩慢前移,當角膜細胞可見,圖像清晰地位于顯示器視屏中央時按下攝錄按鈕,拍攝角膜中央基質(zhì)層照片。

1.2.5 光學顯微鏡檢查

處死兔后取出角膜在多聚甲醛中固定24 h。角膜大小均為2 mm×2 mm。進一步解剖后進行石蠟包埋并用RM2135切片機切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 透射電子顯微鏡檢查

將樣品固定在體積分數(shù)為2.5%戊二醛溶液中,用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)沖洗后,在10 g·L-1鋨酸中固定。酒精脫水,樣品被嵌入到環(huán)氧樹脂中。從角膜中部切出一小段(1 mm×1 mm×1 mm)。切片用醋酸鉛和醋酸鈾雙染色,用透射電子顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blot檢測

用RIPA裂解液提取每組兔角膜蛋白質(zhì),離心取上清液,BCA法測定總蛋白濃度,計算上樣量。按計算的上樣量加至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。電泳完畢后切膠轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜完成后,用50 g·L-1奶粉封閉1 h,將膜與pNF-κB p65、NK-κB p65、β-actin的一抗于4 ℃孵育過夜。用含0.5 g·L-1Tween-20的Tris緩沖液洗滌3次,每次10 min,隨后將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG孵育1 h。TBST 緩沖液洗3次,每次10 min,ECL發(fā)光液涂抹,凝膠成像儀顯影、曝光、成像。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行處理,計量資料采用均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組兔造模后不同時間角膜熒光素染色評分

角膜熒光素染色評分結(jié)果顯示,與造模后第0天相比,造模后第21、28、35天模型組、針刺組和假針刺組兔角膜熒光素染色評分均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與模型組相比,造模后第28、35天,針刺組、空白組兔角膜熒光素染色評分均減小,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組兔造模后不同時間角膜熒光素染色評分

2.2 針刺對角膜形態(tài)學的影響

2.2.1 角膜共焦顯微鏡檢查結(jié)果

造模后第35天共焦顯微鏡檢查結(jié)果顯示,空白組兔角膜前彈力層細胞呈安靜狀態(tài),未見形態(tài)異常的神經(jīng)纖維。模型組和假針刺組與其他組相比,基質(zhì)層出現(xiàn)大量球狀免疫細胞和邊界不清、大小不規(guī)律的活化基質(zhì)層細胞,可見具有不規(guī)則細胞間間隙的區(qū)域,提示存在炎癥;針刺組基質(zhì)層細胞形態(tài)得到改善,細胞呈輕微激活狀態(tài),神經(jīng)形態(tài)未見明顯異常(圖1)。

模型組箭頭處可見球狀免疫細胞。

2.2.2 角膜組織光學顯微鏡檢查結(jié)果

造模后第35天光學顯微鏡檢查結(jié)果顯示,空白組兔角膜組織存在4～6層上皮細胞,基質(zhì)均勻,未見血管。模型組和假針刺組兔角膜組織表面可見角化過度的扁平上皮細胞,淋巴細胞浸潤,局灶上皮細胞層數(shù)增多,表面上皮細胞脫落。針刺組兔角膜上皮有接近4～6層上皮細胞,上皮脫落減少,與模型組相比,淋巴細胞浸潤減少(圖2)。

圖2 各組兔造模后第35天角膜組織光學顯微鏡檢查結(jié)果

2.2.3 角膜組織透射電子顯微鏡檢查結(jié)果

造模后第35天透射電子顯微鏡檢查結(jié)果顯示,空白組兔角膜上皮細胞未出現(xiàn)異常。而模型組和假針刺組兔角膜上皮細胞出現(xiàn)異常的微絨毛結(jié)構(gòu)和上皮細胞缺失,細胞間隙增寬,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重擴張,橋粒解體伴隨線粒體腫脹,這意味著發(fā)生炎癥反應甚至細胞死亡。針刺組兔角膜上皮細胞微絨毛結(jié)構(gòu)稀疏且短,仍見局部缺失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,線粒體未見明顯腫脹(圖3)。

圖3 各組兔造模后第35天角膜組織透射電子顯微鏡檢查結(jié)果

2.3 各組兔角膜組織NF-κB蛋白表達情況

造模后第35天Western blot檢測結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組、假針刺組兔角膜組織中p-NF-κB p65表達均上調(diào)(均為P<0.05);針刺組p-NF-κB p65的表達水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組、假針刺組相比,針刺組兔角膜組織中p-NF-κB p65表達均下調(diào)(均為P<0.05)(圖4)。

與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與假針刺組相比,△P<0.05。

3 討論

干眼是全球普遍發(fā)生的眼科疾病。目前,對干眼多采用人工淚液、抗炎等藥物治療,以及霧化物理治療等。這些治療方法均存在治標不治本、遠期療效差等問題。針灸屬于中醫(yī)藥治療疾病的手段之一,具有2000多年的歷史,其治療效果已被很多國家認可和使用[8]。當前,針刺已經(jīng)廣泛用于治療許多眼科疾病,如青光眼、眼肌麻痹、眼球震顫、干眼等[9-12]。臨床研究發(fā)現(xiàn),針刺治療干眼時,選取眼周穴位可以明顯改善患者癥狀,這可能與針刺改善患者眼周組織微循環(huán)有關(guān)[13]。而實驗研究發(fā)現(xiàn),針刺可有效修復淚腺細胞,促進淚液分泌,抑制淚腺組織細胞凋亡,抑制炎癥因子促炎活性反應,調(diào)節(jié)性激素水平,且具有促進乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)興奮的作用[14]。因此,我們推斷針刺治療可以作為干眼常規(guī)臨床治療的有效手段。本研究中我們用氫溴酸東莨菪堿誘導兔干眼模型作為觀察對象,研究發(fā)現(xiàn),模型組兔角膜損傷嚴重,角膜熒光素染色評分明顯增加,共焦顯微鏡檢查可見角膜基質(zhì)層出現(xiàn)大量球狀免疫細胞和邊界不清大小不規(guī)律的活化基質(zhì)層細胞,透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)角膜組織存在異常的超微結(jié)構(gòu),此干眼模型具有與人類干眼炎癥和損傷很強的相似性[15]。在本研究中,我們?yōu)獒槾讨委煾裳厶峁┝诵碌淖C據(jù),發(fā)現(xiàn)針刺可以減小角膜熒光素染色評分,抑制角膜上皮層異常增多和淋巴細胞浸潤,改善角膜上皮微絨毛結(jié)構(gòu),減輕角膜上皮粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的擴張,抑制角膜基質(zhì)層細胞活化,改善角膜神經(jīng)病變,這些結(jié)果證明針刺可以改善兔干眼模型角膜炎癥和損傷,抑制干眼。

NF-κB是在炎癥反應中無法代替的轉(zhuǎn)錄因子。在炎癥反應中它能夠與多種調(diào)控基因的啟動子相結(jié)合,從而調(diào)控炎癥反應。它幾乎存在于所有的組織和細胞中,在哺乳動物細胞中包括五種NF-κB/Rel家族成員:NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和c-Rel。NF-κB信號通路的激活主要分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典途徑中,NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合呈非活性狀態(tài),腫瘤壞死因子-α等細胞因子的刺激可導致IKK活化,進而引起IκB降解和IκB磷酸化,從而觸發(fā)細胞向核內(nèi)釋放p65/p50二聚體,轉(zhuǎn)錄多種炎癥因子,產(chǎn)生大量的促炎因子釋放到外周血中。近年來研究發(fā)現(xiàn),NF-κB在眼部疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,如白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜病變等。通過抑制NF-κB的活性可以抑制相關(guān)眼病的發(fā)展[16]。炎癥是干眼發(fā)病的核心病理機制,研究發(fā)現(xiàn),各種干眼模型與NF-κB的活化密切相關(guān)[17-19]。在本研究中,使用氫溴酸東莨菪堿誘導兔干眼模型后p-NF-κB p65明顯被激活,而使用針刺后可降低p-NF-κB p65的活化,這表明針刺可以通過抑制NF-κB信號途徑發(fā)揮作用,進而對干眼具有抗炎作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,針刺可以抑制NF-κB信號通路從而發(fā)揮抗炎作用,改善兔干眼模型角膜炎癥和損傷。