李鈺潔，陳洪波，徐珂，何小麗，喬木，吳俊靜，彭先文，梅書棋，徐忠*

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；2. 武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院湖北省家畜種業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3. 廟嶺畜牧獸醫(yī)站，湖北 鄂州 436031)

測(cè)序技術(shù)發(fā)展源于1970年，在幾十年間，各種測(cè)序方法經(jīng)歷了快速演變，并被應(yīng)用于各種特定的研究方向，為復(fù)雜的生物系統(tǒng)提供了許多寶貴的理論依據(jù)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)主要由單細(xì)胞基因組測(cè)序(single cell DNA sequencing，scDNA-seq)，單細(xì)胞RNA測(cè)序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)和單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序這三類測(cè)序構(gòu)成，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。2017年10月16日，“人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃”首批擬資助的38個(gè)項(xiàng)目正式公布，單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)入繁榮的新時(shí)代。近年來單細(xì)胞基因組測(cè)序通過研究單細(xì)胞分辨率的基因組突變測(cè)序分析，初步探索了人類胚胎和器官發(fā)育譜系圖譜。單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序可以從單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)、三維基因組、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面研究細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是研究基因表達(dá)的主要手段，被廣泛應(yīng)用于畜禽功能基因挖掘和分子遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制研究中。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是在多細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的，實(shí)際得到的是大量細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的平均值。scRNA-seq是在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序分析，研究單個(gè)細(xì)胞的行為及其內(nèi)部基因表達(dá)情況，可以揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞發(fā)育譜系關(guān)系[1]。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)相比，scRNA-seq能檢測(cè)出混雜樣品測(cè)序所無法獲得的細(xì)胞異質(zhì)性信息[2]，進(jìn)行新細(xì)胞的鑒定，成為了不同領(lǐng)域中研究細(xì)胞異質(zhì)性的有效工具[3]。自2009年首個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)布以來[4-5]，scRNA-seq已被越來越廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究中。目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在畜禽遺傳育種上的研究迅速，為提高育種效率提供新的理論技術(shù)，促進(jìn)畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文對(duì)scRNA-seq技術(shù)的流程要點(diǎn)及其在畜禽遺傳育種中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，分析目前研究存在的挑戰(zhàn)，為畜禽相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)

scRNA-seq是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍的分析，需要分離和裂解單細(xì)胞，將其RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后擴(kuò)增cDNA以生成高通量測(cè)序文庫(kù)。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，scRNA-seq數(shù)據(jù)的快速生成克服了大量RNA序列對(duì)樣本中所有細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行平均的缺陷，避免了單個(gè)細(xì)胞特性的丟失，能夠根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜特性對(duì)個(gè)體進(jìn)行高精度的鑒別，并能夠傳達(dá)出基因間的調(diào)控關(guān)系，追蹤發(fā)育過程中不同細(xì)胞譜系的軌跡。目前使用的scRNA-seq技術(shù)幾乎都包含了單細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞分離、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序及數(shù)據(jù)分析這四個(gè)步驟。

1.1 單細(xì)胞懸液的制備

實(shí)體組織通常采用機(jī)械法，簡(jiǎn)單無污染，但人工機(jī)械裂解組織會(huì)由于動(dòng)作幅度和速度差異使活細(xì)胞的獲得率有差異，且容易造成細(xì)胞損傷。酶消化法[6-8]是使組織間和細(xì)胞間的連接水解，但其孵育條件的控制有一定難度，固體組織細(xì)胞易結(jié)成團(tuán)，細(xì)胞得率低，且組織的酶消化會(huì)影響scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的基因表達(dá)偽影，適合的樣本種類包括肝臟、腎臟、心肌等。機(jī)械-酶消化法是兩種方法的組合，可在許多情況下用來縮短整體處理時(shí)間。

1.2 單細(xì)胞分離

制備的單細(xì)胞懸液可以依據(jù)其樣本的特點(diǎn)，選擇有限稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割、熒光激活流式分選以及微流控裝置[9-10]等方法分離為單個(gè)細(xì)胞。其中有限稀釋法是一種常用的分離單細(xì)胞的方法，它通過人工或機(jī)器操作移液來稀釋細(xì)胞懸液，雖然操作簡(jiǎn)單，但效率不高，成功率也較低。顯微操作法可以分離出特定的細(xì)胞，但是對(duì)操作要求很高，通量小。激光捕獲顯微切割[11]是利用激光切割并捕獲細(xì)胞，容易破壞細(xì)胞所含的遺傳物質(zhì)。熒光激活流式分選是一種利用不同熒光探針對(duì)來標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞的技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器分離，通量高，但是操作需要大量的細(xì)胞[12]。微流控裝置分離，是在封閉的微流控設(shè)備中執(zhí)行細(xì)胞捕獲、分選和裂解，最大限度減少了操作過程中受到外源RNA和核糖核酸酶污染的機(jī)會(huì)[13]，且通量大，效率高。目前使用最廣泛的是基于液滴的微流體，包括inDrop、Drop-seq[14]和10× Genomics三個(gè)技術(shù)。inDrop細(xì)胞捕獲效率極低，適用于分析非常小的組織樣本，10× Genomics獲得的數(shù)據(jù)比Drop-seq質(zhì)量更高[15]。10× Genomics目前是最主流的選擇，但當(dāng)樣本比較豐富時(shí)，Drop-seq成本相對(duì)低一些，相反，當(dāng)進(jìn)行低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)或需要自定試驗(yàn)方案時(shí)，選擇inDrop比較合適[16]。

1.3 單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

由于不能直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，所以需要先逆轉(zhuǎn)錄單個(gè)細(xì)胞中的RNA并獲取cDNA鏈，并進(jìn)一步通過擴(kuò)增獲得大量單個(gè)細(xì)胞中的RNA的cDNA，制備基因測(cè)序文庫(kù)，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

目前，10× Genomics公司應(yīng)用液滴微流控技術(shù)的測(cè)序平臺(tái)以其極高的細(xì)胞通量與較低的價(jià)格被廣泛應(yīng)用，它能大規(guī)模且準(zhǔn)確反轉(zhuǎn)錄出單個(gè)細(xì)胞的基因并完成測(cè)量，一次測(cè)序可以捕捉到約80 000個(gè)細(xì)胞，并且單細(xì)胞覆蓋度高。通過分別捕獲單個(gè)細(xì)胞并裂解，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以選擇mRNA并獲得cDNA。隨后，將擴(kuò)增出的cDNA用于測(cè)序文庫(kù)的制備，即通過生成液滴，使用帶有條形碼的珠上引物來區(qū)分單個(gè)細(xì)胞，并應(yīng)用獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(UMI)進(jìn)行偏差校正。10× Genomics公司的Chromium系統(tǒng)[17]將含寡核苷酸barcode[18]序列的凝膠珠(Gel Beads)首先與細(xì)胞和試劑混合，隨后在微流控交界處與油-表面活性劑溶液混合，形成GEMs(油包水的微體系)。之后細(xì)胞裂解，凝膠珠自動(dòng)溶解釋放大量barcode序列，每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA分子包含一個(gè)UMI信息[19]和每個(gè)GEM共享的條形碼，對(duì)含barcode的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序文庫(kù)，識(shí)別細(xì)胞的為10× barcode，識(shí)別mRNA分子的為UMI。

1.4 單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析

越來越多的生物信息分析方法被開發(fā)出來專門用于scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析與理解。由于scRNA-seq原始數(shù)據(jù)存在一些缺點(diǎn)，包括高水平的噪聲、過度分散、表達(dá)序列的檢測(cè)率低、稀疏性和較低的轉(zhuǎn)錄材料捕獲等，所以需要一些統(tǒng)計(jì)方法和生物信息學(xué)技術(shù)工具來提取相關(guān)信息[20]。其中涉及的主要步驟是質(zhì)量控制(QC)、歸一化、降維、聚類、可視化(t-SNE)結(jié)果和差異表達(dá)分析(DEA)[21](圖1)。目前單細(xì)胞分析用到的軟件主要是FastQC、Cell ranger和Seurat、Monocle。QC是單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理步驟，從數(shù)據(jù)中刪除低質(zhì)量的細(xì)胞，去除低質(zhì)量的堿基[1]。Cell ranger是10× Genomics的數(shù)據(jù)分析軟件，可直接輸入Illumina原始數(shù)據(jù)(raw base call，BCL)輸出表達(dá)定量矩陣、降維、聚類以及可視化結(jié)果。t-SNE[22]是一種降維技術(shù)，將多維數(shù)據(jù)非線性的轉(zhuǎn)換為低維數(shù)據(jù)，和主成分分析(PCA)差異在于PCA在實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了噪聲去除，而t-SNE主要用于數(shù)據(jù)展示，將不能可視化的多維數(shù)據(jù)降維到低維，進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化展示。聚類工具(如Seurat)[23]用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞類型，進(jìn)行細(xì)胞集群分析。軌跡分析工具(如Monocle)[24]被用于研究基因如何在發(fā)育過程中變化，分析單細(xì)胞基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，來推斷細(xì)胞發(fā)展軌跡[25]。

圖1 scRNA-seq數(shù)據(jù)分析

2 單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)在畜禽遺傳育種中的應(yīng)用

單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、腫瘤、生殖、免疫、組織器官等醫(yī)療領(lǐng)域，在動(dòng)物遺傳育種方面的研究和應(yīng)用也愈加廣泛。本文以物種分類(表1)對(duì)單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)在畜禽領(lǐng)域的研究進(jìn)行綜述。

2.1 單細(xì)胞RNA測(cè)序在豬遺傳育種上的應(yīng)用

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以用于豬生殖發(fā)育領(lǐng)域，擴(kuò)大豬優(yōu)秀品種遺傳資源，改良豬的重要性狀。在豬的生殖細(xì)胞領(lǐng)域，Liu等[26]對(duì)豬生精囊段的卵母細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)155個(gè)基因在亮甲酚藍(lán)陰性和陽(yáng)性的卵母細(xì)胞之間有明顯的差異表達(dá)，證明CDC5L在豬卵母細(xì)胞的成熟與早期胚胎發(fā)育時(shí)期很重要，研究結(jié)果為家畜良種快速擴(kuò)繁和改善胚胎體外生產(chǎn)效率提供重要依據(jù)。Zhang等[27]為描述豬精子發(fā)生圖譜，通過單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)s16 966個(gè)豬睪丸細(xì)胞進(jìn)行分析，確定了豬睪丸中不同細(xì)胞類型在豬精子生成中有明顯差異表達(dá)基因，鑒別出未分化和分化精原細(xì)胞新的細(xì)胞表面標(biāo)記分別是CD99和PODXL2，對(duì)研究豬的精原細(xì)胞分化可能有幫助。雷佩佩[28]研究揭示了豬精原細(xì)胞的異質(zhì)性，篩選出了CDH1和CD99為未分化精原細(xì)胞的潛在分子標(biāo)記，而分化的精原細(xì)胞其潛在分子標(biāo)記是PODXL2，這為更深入的研究豬精原細(xì)胞分化和精子發(fā)生提供了理論依據(jù)。

隨著人們生活水平的提高，豬肉質(zhì)風(fēng)味成為重點(diǎn)研究的經(jīng)濟(jì)性狀，尤其是豬的骨骼肌與豬脂肪細(xì)胞的發(fā)育。Qiu等[29]利用單細(xì)胞RNA測(cè)序，證實(shí)瘦肉型豬在骨骼肌中保留的肌系細(xì)胞比例高于肥胖型豬，且瘦肉型豬肌系細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度都較低，闡述了瘦肉型豬脂肪沉積少的重要原因。張愨[30]鑒定了豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的亞群及潛在的細(xì)胞特異性標(biāo)記基因，對(duì)兩種組織關(guān)鍵細(xì)胞類型進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了其共有的特異表達(dá)PI15的多能干細(xì)胞和豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中特異表達(dá)TNNI2和ACTN2的成肌細(xì)胞，豐富了對(duì)豬皮下和肌內(nèi)脂肪生成過程的認(rèn)識(shí)，為豬肉品質(zhì)改良提供了理論依據(jù)。

另外在胚胎方面的研究，Du等[31]通過對(duì)體外受精(IVF)或孤雌生殖激活(PA)的豬早期胚胎中獲得的單個(gè)子代和囊胚的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)IVF組內(nèi)的差異表達(dá)基因與PA組內(nèi)的差異表達(dá)基因不同，DNA甲基化因子(UHRF1/2和DNMT1/3A/3B)在體外和體內(nèi)胚胎的表達(dá)水平和變化趨勢(shì)存在很大差異，對(duì)研究胚胎發(fā)育至關(guān)重要的基因和通路提供重要支持。Li等[32]研究了豬胸腰椎、肋骨原基的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，分析了發(fā)育中的豬胸腰椎和肋骨原基細(xì)胞組成及HOXA10表達(dá)的差異，這為研究胚胎成骨和發(fā)育提供了理論依據(jù)。Tian等[33]針對(duì)豬胚胎在著床期流失的問題，利用scRNA-seq研究了與胚胎植入相關(guān)細(xì)胞類型的基因表達(dá)軌跡，HBE1和HBZ在紅系細(xì)胞中唯一表達(dá)，PEG10在滋養(yǎng)層細(xì)胞中唯一表達(dá)，將為破解豬胚胎著床的分子機(jī)制提供幫助。這些研究成果可以為優(yōu)秀豬種繁育和豬肉品質(zhì)改良等相關(guān)研究提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

2.2 單細(xì)胞RNA測(cè)序在牛遺傳育種上的應(yīng)用

對(duì)牛的生殖細(xì)胞、胚胎和脂肪細(xì)胞的研究有利于提高優(yōu)秀種牛的繁育水平。在牛上實(shí)施單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，為研究單個(gè)細(xì)胞在復(fù)雜性狀中的作用提供理論支持。Lavagi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，牛在第2天與第3天其胚胎單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜存在異質(zhì)性，同源異行框基因CDX2調(diào)控牛胚泡中的多個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞基因，NANOG和GATA6分別是外胚層和原始內(nèi)胚層第2次世系分離的兩個(gè)關(guān)鍵基因，SALL1(參與多能性)和FOSL1(參與滋養(yǎng)外胚層發(fā)育)的胚胎轉(zhuǎn)錄在16細(xì)胞階段開始，證實(shí)了胚泡發(fā)育在胚胎的基因組激活時(shí)期是不同步的。Gao等[35]分別從斷奶前后的兩個(gè)荷斯坦小牛瘤胃上皮組織中獲得了5 064個(gè)和1 372個(gè)單個(gè)細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，確認(rèn)了不同細(xì)胞簇的細(xì)胞類型及其標(biāo)記基因。將它們與人類和小鼠胃上皮細(xì)胞進(jìn)行比較確認(rèn)細(xì)胞身份。這項(xiàng)研究為在牛中實(shí)施單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析做出了初步努力，并對(duì)牛瘤胃組織上皮細(xì)胞類型及其在斷奶期間的發(fā)育情況做出了闡述，唯一高表達(dá)SLC16A1和SLC4A9的細(xì)胞類型可能在揮發(fā)性脂肪酸吸收中發(fā)揮重要作用，揭示了單細(xì)胞水平的細(xì)胞類型在復(fù)雜性狀中的作用。

在牛的脂肪、毛囊上的研究有利于了解牛肌肉和毛絨性狀的發(fā)生，幫助提升牛分子育種水平。Lyu等[36]利用scRNA-seq技術(shù)分析了牛的衛(wèi)星細(xì)胞的組成，支持牛衛(wèi)星細(xì)胞是由轉(zhuǎn)錄和成肌狀態(tài)不同的亞群組成的假說以及牛的肌肉內(nèi)脂肪來源于纖維脂肪生成細(xì)胞的假說。證明了牛的衛(wèi)星細(xì)胞在成肌潛力方面是異質(zhì)的，分析了衛(wèi)星細(xì)胞(PAX7、PAX3)、成肌細(xì)胞(MYOD1、MYF5)、纖維脂肪生成(FAP)細(xì)胞(PDGFRA)和分化的成肌細(xì)胞或肌細(xì)胞(MYOG)的標(biāo)志物的富集表達(dá)，利于了解支配牛骨骼肌組成、發(fā)育和生長(zhǎng)的遺傳與生理機(jī)制，改善牛骨骼肌質(zhì)量。葉娜[37]利用scRNA-seq揭示天祝白牦牛在生長(zhǎng)期其表皮細(xì)胞譜系和真皮細(xì)胞譜系在毛囊發(fā)育中的分化軌跡，研究了牦牛生長(zhǎng)期其毛囊發(fā)育過程所涉及到的表皮細(xì)胞(KRT14、KRT15)、毛干細(xì)胞(LHX2)、上皮分化細(xì)胞(SBSN、KRTDAP、KRT1、KRT10)等，為牦牛的毛絨性狀的分子育種方面提供理論研究基礎(chǔ)。上述研究可以更好的理解牛的生殖發(fā)育機(jī)制，改善牛的肌肉品質(zhì)。

2.3 單細(xì)胞RNA測(cè)序在羊遺傳育種上的應(yīng)用

目前scRNA-seq技術(shù)在羊上的研究主要在生殖細(xì)胞發(fā)育、毛囊發(fā)育等方面。對(duì)綿羊睪丸、羊毛的毛囊異質(zhì)性和羊毛卷曲分子機(jī)制的研究，Yang等[38]從成年綿羊睪丸的11 772個(gè)細(xì)胞中收集scRNA-seq數(shù)據(jù)，經(jīng)過鑒定，發(fā)現(xiàn)綿羊生殖細(xì)胞有幾種不同的類型，確定了一些特異性標(biāo)記基因，如EZH2、SOX18、SCP2、PCNA和PRKCD，這為綿羊精子發(fā)生的全面單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了新的見解。Wang等[39]利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)揭示了毛囊細(xì)胞的分化和空間特征，同時(shí)通過鑒定和分析直毛與卷毛在特定細(xì)胞中的異質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGFBP3與VCAN有相同的表達(dá)模式，認(rèn)為它們與毛乳頭細(xì)胞的聚集性生長(zhǎng)特征密切相關(guān)，闡明了羊毛彎曲的分子機(jī)制，為研究綿羊毛囊發(fā)育生物學(xué)和綿羊的育種提供幫助。

在山羊中，Li等[40]采用scRNA-seq分析了吉寧灰山羊群體不同階段卵泡顆粒細(xì)胞(GC)的基因表達(dá)及其標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)不同群體之間的基因表達(dá)差異在不同發(fā)育階段非常明顯，許多標(biāo)記基因在不同發(fā)育階段也差異表達(dá)，ASIP和ASPN在GCs早期高表達(dá)，INHA、INHBA、MFGE8和HSD17B1在GCs生長(zhǎng)期高表達(dá)，IGFBP2、IGFBP5和CYP11A1在晚期高表達(dá)。這些標(biāo)記基因可以作為山羊卵泡GC發(fā)育的參考基因，這可能有助于揭示卵母細(xì)胞發(fā)育潛力。在山羊睪丸細(xì)胞中的研究中，Yu等[41]將奶山羊睪丸組織分離成單細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq測(cè)序，分析其精子發(fā)生和體細(xì)胞發(fā)育過程，通過檢測(cè)和篩選，確定了精原細(xì)胞中的特定候選標(biāo)記基因(TKTL1和AES)，發(fā)現(xiàn)的新特征基因可為雄山羊生殖提供重要分子標(biāo)記，為奶山羊育種研究提供理論與技術(shù)支持。以上研究可以為綿、山羊生殖和綿羊毛囊發(fā)育提供新的理解。

2.4 單細(xì)胞RNA測(cè)序在雞遺傳育種上的應(yīng)用

scRNA-seq技術(shù)在家禽上研究較少，Li等[42]首次用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)分析雞骨骼肌在肌肉發(fā)生和脂肪形成的增生與肥大階段的異質(zhì)性，篩選和鑒定肌內(nèi)脂肪特異性表達(dá)基因，提供了骨骼肌中肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的細(xì)胞特異性表達(dá)基因，APOA1和COL1A1基因被鑒定為雞肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的Marker基因，為肌內(nèi)脂肪的生成提供新的見解，有助于研究雞肉品質(zhì)性狀分子標(biāo)記的開發(fā)。Rengaraj等[43]將一種新的生殖細(xì)胞示蹤方法運(yùn)用到轉(zhuǎn)基因雞模型中，通過CRISPR/Cas9基因編輯將綠色熒光蛋白(GFP)插入到雞生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記基因DAZL(雞生殖細(xì)胞發(fā)育與維持的關(guān)鍵因子)中，構(gòu)建了DAZL：：GFP轉(zhuǎn)基因雞，再分離純化雄性和雌性生殖細(xì)胞，利用scRNA-seq進(jìn)行分析，可以研究禽類生殖細(xì)胞發(fā)育過程中特有的機(jī)制、轉(zhuǎn)錄圖譜和細(xì)胞異質(zhì)性，與上述在骨骼肌中的研究共同為改善雞肉品質(zhì)和了解禽類生殖發(fā)育提供新的思路。

2.5 單細(xì)胞RNA測(cè)序在其他畜禽遺傳育種上的應(yīng)用

馬產(chǎn)業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)的重要組成部分。目前scRNA-seq除了在豬、牛、羊和雞等常見畜禽上有應(yīng)用，對(duì)馬也有研究進(jìn)展。Sage等[44]將scRNA-seq技術(shù)用來探索冷凍的馬支氣管肺泡灌洗液(BALF)的細(xì)胞組成，對(duì)從患哮喘馬中分離出的4 631個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，確定了16個(gè)主要細(xì)胞類型群：?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞(CD163、CD68)、T細(xì)胞(CD2、CD3D、CD3E、CD3G)、B/漿細(xì)胞(MS4A1、CD79A、CD79B)、樹突狀細(xì)胞(CD83、CCR7)、中性粒細(xì)胞(TG、RGS2、LILRA5、CSF3R)和肥大細(xì)胞(LTC4S、HPGDS、GCSAML、MS4A2)，核糖體蛋白基因在T細(xì)胞和B漿細(xì)胞中高度表達(dá)。研究結(jié)果表明，scRNA-seq技術(shù)適用于冷凍保存的馬BALF細(xì)胞，可以識(shí)別其主要細(xì)胞群體以及未探索研究過的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群，這可能對(duì)馬呼吸系統(tǒng)疾病(如馬哮喘)的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

能夠準(zhǔn)確進(jìn)行細(xì)胞亞群分類以及識(shí)別是現(xiàn)在亟需解決的技術(shù)挑戰(zhàn)。scRNA-seq涉及到與群體RNA測(cè)序相關(guān)的更高水平的技術(shù)噪聲和數(shù)據(jù)復(fù)雜性，干擾了細(xì)胞聚類和標(biāo)記識(shí)別的準(zhǔn)確性，Song等[45]描述了有更好聚類性能的基于entropy subspace分離的降噪聚類(ENCORE)的細(xì)胞聚類算法，減少scRNA-seq分析中的噪聲并提高細(xì)胞聚類的準(zhǔn)確性，但發(fā)現(xiàn)ENCORE在運(yùn)行過程中消耗內(nèi)存較大，這也提示了細(xì)胞聚類算法的一個(gè)研究機(jī)遇。

如何整合其他的技術(shù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組一起分析也是目前的一個(gè)挑戰(zhàn)。目前，scRNA-seq方法很少能夠傳達(dá)有關(guān)轉(zhuǎn)錄過程的實(shí)時(shí)信息，并且每個(gè)細(xì)胞的RNA圖譜只能被分析一次[46]，Erhard等[47]提出一種單細(xì)胞巰基連接的RNA烷基化代謝標(biāo)記測(cè)序技術(shù)scSLAM-seq，能更好理解單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄活性的差異。scRNA-seq沒有轉(zhuǎn)錄物在組織中的空間信息，因此scRNA-seq與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)[48]的整合可以產(chǎn)生組織中細(xì)胞亞群的高分辨率圖譜。如Biancalani等[49]提出一種Tangram方法，將sc/snRNA-seq數(shù)據(jù)與包括MERFISH、STARmap、smFISH、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織學(xué)圖像等數(shù)據(jù)相結(jié)合[50-52]，可映射任何類型的sc/snRNA-seq數(shù)據(jù)。目前在人和小鼠上已經(jīng)有scRNA-seq與scATAC-seq的組合研究[53-55]，期待之后在畜禽上能有研究進(jìn)展，促進(jìn)未來遺傳育種技術(shù)發(fā)展。相信隨著科技的不斷發(fā)展，scRNA-seq的研究會(huì)更加廣泛，而不限于應(yīng)用于腫瘤、免疫和神經(jīng)發(fā)育等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[56]。