劉欽宇，佘福澤，顧依萍，楊年溥，秦順義，2*

(1. 天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2. 和田職業(yè)技術學院農(nóng)業(yè)科技系，新疆 和田 848000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是一種危害畜牧業(yè)健康發(fā)展的主要霉菌毒素，可引起雌性畜禽生殖功能失調、雄性畜禽精液質量下降、幼齡畜禽生長性能降低，此外還會抑制畜禽的免疫功能和抗病力，由此導致嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。更為嚴重的是，ZEN可能殘留于屠宰加工后的動物性食品中從而危害人類的健康。因此如何緩解ZEN對畜禽，特別是豬的毒性作用越來越受到人們的重視。研究表明，誘發(fā)氧化應激，進而導致氧化損傷和細胞凋亡是ZEN毒性作用的重要機理之一，而具有抗氧化特性的多種物質均具有拮抗ZEN毒性作用的效果[3-5]。

蝦青素作為具有極強抗氧化作用的類胡蘿卜素，除了具有抵抗黃曲霉毒素對小鼠以及赭曲霉毒素對小鼠和家禽的毒性作用外，還具有提高生產(chǎn)性能、抵抗應激反應、調節(jié)機體免疫力、抵抗腫瘤等許多重要的生物學功能[6-7]。因而蝦青素在國外已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和畜牧業(yè)等行業(yè)，而在國內蝦青素已廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[8]，但其在畜禽養(yǎng)殖中的研究報道較少，也未見將蝦青素應用于緩解ZEN對豬毒性作用的研究報道。由于腸道直接與飼料中的ZEN接觸并參與ZEN吸收和代謝[1]，因而ZEN可引起腸道損傷，并影響腸道的吸收功能和屏障功能[9-10]，而小腸上皮細胞是小腸組織中最重要的細胞之一，其健康狀態(tài)直接影響到腸道功能的正常發(fā)揮[11]。因此，本試驗研究蝦青素緩解ZEN誘導的豬小腸上皮細胞損傷的作用效果并探討其作用機理，旨在為緩解ZEN對豬的毒性作用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蝦青素(上海麥克林生化科技股份有限公司)，ZEN(上海源葉生物科技有限公司)，CCK8檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，白介素1(IL-1)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，SYBR Green qPCR Mix(美國Genecopoeia 公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，IPEC-J2細胞(由天津市畜牧獸醫(yī)研究所惠贈)。

1.2 方法

1.2.1 細胞活力測定

將IPEC-J2細胞含量調至106個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中，當細胞長至70%時，開始試驗。試驗分為5組：C、Z、ZA1、ZA2和ZA3組，每組有4孔重復。C組和Z組使用普通培養(yǎng)液，ZA1、ZA2和ZA3組分別使用含蝦青素5、10和20 μmol/L的培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，向Z、ZA1、ZA2和ZA3組加入ZEN使其濃度為25 μg/mL[12]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，參考傅春妮等[13]的方法，利用CCK8試劑盒在450 nm波長測定每孔的吸光度(OD)值測定細胞活力：細胞活力=(OD檢測-OD空白)/(OD陰性對照-OD空白)×100%。

A. C組；B. Z組；C. ZA1組；D. ZA2組；E. ZA3組。

1.2.2 LDH活性測定

試驗分組及處理同1.2.1。細胞培養(yǎng)結束后，收集上清液，利用試劑盒測定LDH活性；計算公式為：LDH活性(U/L)=(OD檢測-OD對照)/(OD標準-OD空白)×200。

1.2.3 抗氧化指標水平的測定

將細胞含量調至106個/mL，以每孔2 000 μL接種于6孔板中，當細胞長至70%時，開始試驗。試驗分組及處理同1.2.1。細胞培養(yǎng)結束后，收集細胞，利用試劑盒測定細胞中每毫克蛋白GSH-Px、SOD、T-AOC和MDA的水平。

1.2.4 細胞因子水平的測定

試驗分組及處理同1.2.1。細胞培養(yǎng)結束后，收集上清液，利用試劑盒測定IL-4、IL-1、IL-6和 TNF-α水平。

1.2.5 內質網(wǎng)應激相關基因mRNA表達水平的測定

細胞分組及處理同1.2.1，細胞培養(yǎng)結束后，常規(guī)提取總RNA并逆轉錄合成cDNA；然后用熒光定量PCR儀檢測蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、激活轉錄因子6(ATF6)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-XL(Bcl-XL)和Bcl-2關聯(lián)X蛋白(BAX)基因 mRNA表達水平，通過2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。引物信息見表1。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，如方差分析存在差異顯著性再采用多重比較(LSD法)對各組間差異進行分析；結果以“平均數(shù)±標準差”表示。以P<0.05為差異顯著，以P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞生長和細胞活力的影響

結果見圖1和圖2A，Z組IPEC-J2細胞活力顯著低于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組細胞活力顯著高于Z組(P<0.01)，ZA2和ZA3組細胞活力顯著高于ZA1組(P<0.01或P<0.05)。

各組間標注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

A. 抗氧化指標；B. MDA。

2.2 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞LDH活性的影響

結果見圖2B，Z組IPEC-J2細胞LDH活性顯著高于C組(P<0.01)，ZA1組、ZA2組和ZA3組IPEC-J2細胞LDH活性顯著低于Z組(P<0.01)；ZA2組和ZA3組IPEC-J2細胞LDH活性與ZA1組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞抗氧化水平的影響

結果見圖3A和3B，Z組細胞SOD、GSH-Px和T-AOC水平極顯著低于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組顯著高于Z組(P<0.05)；Z組細胞MDA水平極顯著高于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組顯著低于Z組(P<0.05)。

2.4 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞細胞因子水平的影響

結果見圖4，Z組細胞IL-1、IL-6和 TNF-α水平極顯著高于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組極顯著低于Z組(P<0.01)；Z組細胞IL-4水平極顯著低于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組極顯著高于Z組(P<0.01)。

圖4 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞IL-1、IL-4、IL-6和 TNF-α水平的影響

2.5 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞內質網(wǎng)應激通路相關基因mRNA表達的影響

結果見圖5，Z組細胞ATF6、CHOP、BAX基因mRNA表達水平和BAX/Bcl-2比值均極顯著高于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組極顯著低于Z組(P<0.01)，ZA2組顯著低于ZA1組(P<0.05)，ZA3組細胞ATF6和BAX基因mRNA表達水平和BAX/Bcl-2比值也顯著低于ZA1組(P<0.05)。

圖5 蝦青素對ZEN誘導的IPEC-J2細胞ATF6、CHOP、BAX、Bcl-2和Bcl-XL基因 mRNA表達的影響

Z組IPEC-J2細胞Bcl-2和Bcl-XL基因mRNA表達水平極顯著低于C組(P<0.01)，ZA1、ZA2和ZA3組顯著高于Z組(P<0.05)，ZA2組細胞Bcl-XL基因mRNA表達水平顯著高于ZA1組(P<0.05)，ZA3組細胞Bcl-2和Bcl-XL基因mRNA表達水平也顯著高于ZA1組(P<0.01)。

3 討論

ZEN抑制細胞增殖和降低細胞活性是其細胞毒性的主要表現(xiàn)[14-15]。ZEN抑制細胞增殖、降低細胞活性與氧化損傷有關[16]。大量研究表明，抗氧化物質具有對抗ZEN對細胞增殖的抑制和對細胞活性的降低的作用效果[4，17]。本試驗表明，ZEN能顯著抑制IPEC-J2細胞的生長和細胞活力，這與許晴雨等[18]研究結果類似，ZEN能夠顯著降低小鼠睪丸間質細胞的細胞活力，且呈劑量依賴性。同時，本試驗結果也證明作為抗氧化物質的蝦青素能夠改善ZEN所致的IPEC-J2細胞生長抑制和細胞活力降低。

LDH存在于細胞質中，當細胞結構破壞時LDH就被釋放到細胞外，其釋放量與細胞損傷的程度呈正相關，因而監(jiān)測血液或細胞培養(yǎng)液中LDH水平，就能反映細胞的損傷程度。研究表明，ZEN作用于腸道上皮細胞會導致細胞損傷和細胞凋亡，使LDH大量釋放到細胞外[13]。本研究結果也表明，ZEN能顯著增加IPEC-J2細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，5、10和20 μmol/L的蝦青素均能顯著降低ZEN所致的IPEC-J2細胞培養(yǎng)液中LDH水平，進一步說明蝦青素在一定程度上能夠緩解ZEN對IPEC-J2細胞的毒性作用。類似的研究報道，具有抗氧化特性的原青花素和有機硒也都能有效降低ZEN所致的動物腸上皮細胞外LDH水平[4，13]。

氧化損傷是ZEN發(fā)揮毒性作用的主要途徑之一[19-20]，ZEN能引發(fā)生物膜中多不飽和脂肪酸的脂質過氧化作用，而脂質過氧化作用最終能導致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，并引起細胞代謝及功能障礙[19-21]。ZEN能促進活性氧的產(chǎn)生并降低抗氧化酶的活性，導致豬腸上皮細胞的氧化應激進而誘發(fā)炎癥反應，并增加IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等促炎因子的表達，抑制IL-4和IL-10等抑炎因子的表達[22]。大量研究表明，具有抗氧化特性的物質均能夠有效緩解ZEN對機體和細胞的氧化損傷作用，進而緩解其毒性作用。例如，原花青素可減輕ZEN誘導的TM4和MODEK細胞的氧化損傷與細胞凋亡[17，23]；有機硒、槲皮素或番紅花也可通過降低活性氧水平，抑制內質網(wǎng)應激通路來減輕ZEN誘導的細胞損傷和炎癥反應，進而下調促炎因子表達，上調抑炎因子表達[4，13，24]。本試驗結果也表明，不同濃度的蝦青素均能對抗ZEN誘導的IPEC-J2細胞SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA水平的改變，這說明蝦青素能夠提高ZEN誘導的IPEC-J2細胞抗氧化功能的降低。本試驗還表明，不同濃度的蝦青素均能夠對抗ZEN誘導的IL-1、IL-6和TNF-α等促炎因子mRNA表達升高以及IL-4等抑炎因子mRNA表達降低，說明蝦青素通過減輕ZEN誘導的IPEC-J2的氧化應激，抑制其炎癥反應，并下調了促炎因子的表達，上調了抑炎因子的表達。

ATF6信號通路是內質網(wǎng)應激時未折疊蛋白反應信號通路中重要的組成部分，ATF6和CHOP是該通路的關鍵蛋白，BAX、Bcl-2和Bcl-XL則是該通路下游的效應蛋白[25]。ATF6通過誘導CHOP基因表達，能夠誘導BAX基因表達，并抑制Bcl-2和Bcl-XL基因表達[26]。本研究結果表明，ZEN通過上調IPEC-J2細胞ATF6、CHOP和BAX基因表達，下調Bcl-2和Bcl-XL基因表達，說明ZEN通過內質網(wǎng)應激通路誘發(fā)細胞凋亡發(fā)揮其對IPEC-J2細胞的毒性作用。研究表明，有機硒、原花青素、槲皮素等抗氧物質能夠緩解ZEN誘導的細胞凋亡，改變caspase-3、caspase-9、BAX、Bcl-2和Bcl-XL等凋亡相關基因的表達水平[3-4，24]。本研究結果也表明，不同濃度的蝦青素均能夠降低ZEN誘導的IPEC-J2細胞ATF6、CHOP和BAX基因 mRNA表達水平以及BAX/Bcl-2比值的升高，能夠降低ZEN誘導的IPEC-J2細胞Bcl-2和Bcl-XL基因 mRNA表達水平的降低，說明蝦青素能夠緩解ZEN通過內質網(wǎng)應激誘導的IPEC-J2細胞凋亡的發(fā)生。蝦青素可能是通過抑制內質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡途徑，減少氧化應激和ZEN誘導的細胞凋亡[3-4]，從而對抗ZEN誘導的IPEC-J2細胞的損傷作用。

綜上，本研究結果顯示，蝦青素能夠緩解ZEN誘導的IPEC-J2細胞損傷，具有潛在的應用前景。