劉洋，孔祥峰，余祖功

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過(guò)程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

近年來(lái)，隨著集約化生豬養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，人們對(duì)高產(chǎn)母豬的需求日漸增加。然而，隨著母豬產(chǎn)仔數(shù)的增加，新生仔豬宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)的發(fā)生率高達(dá)15%～20%[1]。新生IUGR仔豬營(yíng)養(yǎng)獲取不足，體重輕、免疫力弱，造成生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、腹瀉率高和死亡率高等問(wèn)題[2]。經(jīng)常在斷奶前死亡或者被淘汰，造成了極大的浪費(fèi)[3]。腸道是抵抗病原入侵的重要屏障，對(duì)維持動(dòng)物機(jī)體健康具有重要意義[4]。腸道菌群的早期定植與動(dòng)物腸道免疫和屏障功能的成熟以及生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[5]。IUGR新生仔豬的腸道發(fā)育和屏障功能受損嚴(yán)重，是導(dǎo)致IUGR仔豬腸道疾病發(fā)生和生長(zhǎng)性能降低的重要原因[6]。有研究表明，新生IUGR仔豬腸道微生物的早期定植、結(jié)構(gòu)組成、代謝特征與正常體重(NBW)仔豬明顯不同[7]。然而，斷奶IUGR仔豬腸道微生物的定植特征尚不清楚，因此，本文旨在研究斷奶后NBW仔豬與IUGR仔豬的腸道微生物定植特征及其與器官生長(zhǎng)發(fā)育的潛在聯(lián)系，為改善IUGR仔豬的生長(zhǎng)性能和腸道健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、分組與飼養(yǎng)管理

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所試驗(yàn)場(chǎng)開(kāi)展。試驗(yàn)選用胎次和體況相近的健康長(zhǎng)白×大白妊娠母豬24頭(湖南益陽(yáng)新五豐豬場(chǎng))，分娩后根據(jù)每窩的產(chǎn)仔數(shù)(10～14頭)選出12窩新生仔豬。本試驗(yàn)中，將新生仔豬體重低于窩平均體重10%的仔豬稱為IUGR仔豬，將大于平均體重的仔豬稱為NBW仔豬[8]，根據(jù)每窩平均體重，從每窩中挑出NBW仔豬和IUGR仔豬各1頭，總計(jì)24頭，分為NBW組和IUGR組，每組12頭。所選仔豬由母豬自然哺乳喂養(yǎng)，21日齡斷奶后單欄飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，(7.50±0.29)kgNBW仔豬和(5.68±0.43)kgIUGR仔豬開(kāi)始飼喂28 d的保育料[9]，日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。母豬和仔豬飼養(yǎng)管理、消毒和免疫等按正常養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作。

表1 日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 器官系數(shù)測(cè)定

斷奶仔豬飼喂28 d時(shí)，禁食12 h后空腹稱重，采用麻醉后放血處死，屠宰后分離肝臟、脾臟和胰腺稱重并記錄，計(jì)算器官系數(shù)。計(jì)算公式為：器官系數(shù)=器官重(g)/末體重(kg)。

1.2.2 腸道微生物測(cè)序

取中段部位的空腸、回腸和結(jié)腸內(nèi)容物，裝入離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存。取0.2 g左右腸道內(nèi)容物，采用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA)試劑盒提取微生物總DNA。采用16S rRNA V3-V4區(qū)特異性引物擴(kuò)增，上游引物為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，下游引物為5′-TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 2 min預(yù)變性；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，采用DNA回收試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)回收DNA產(chǎn)物，并用QuantiFluorTM-ST微型熒光儀(Promega，Madison，WI，USA)進(jìn)行核酸質(zhì)量檢驗(yàn)，之后在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

使用QIIME2對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用DADA2軟件對(duì)序列進(jìn)行過(guò)濾、去噪、合并和去除嵌合體。用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)擴(kuò)增子序列變體進(jìn)行分類和物種注釋。序列數(shù)據(jù)分析主要采用QIIME2平臺(tái)進(jìn)行，利用其多樣性分析插件進(jìn)行微生物α多樣性分析，檢測(cè)指標(biāo)包括Shannon、Simpson、Observed_species和Chao1。微生物β多樣性分析，采用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)和非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)對(duì)腸道微生物組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，并進(jìn)行可視化以觀察菌群的結(jié)構(gòu)差異。采用Mann-WhitneyUtest分析門(mén)和屬分類水平上不同組仔豬腸道微生物群的豐度差異。

1.3 相關(guān)性分析

采用基于R包的Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)方法，檢測(cè)仔豬腸道差異菌群與器官發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)分析顯著性，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示組間數(shù)據(jù)有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NBW與IUGR仔豬器官生長(zhǎng)發(fā)育的比較

如表2所示，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬的末重、肝臟重、胰腺重、空腸重和空腸長(zhǎng)度均顯著降低(P<0.05)，而IUGR仔豬的肝臟系數(shù)，回腸重、長(zhǎng)度和系數(shù)以及結(jié)腸重、長(zhǎng)度與系數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

表2 NBW仔豬與IUGR仔豬器官發(fā)育指標(biāo)的比較

2.2 NBW與IUGR仔豬腸道菌群多樣性的比較

如圖1和2所示，NBW和IUGR仔豬的空腸、回腸和結(jié)腸菌群α多樣性沒(méi)有明顯差異，并且β多樣性結(jié)果也顯示兩組仔豬的腸道菌群沒(méi)有明顯的聚類特征。

JN和JI分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬空腸；IN和II分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬回腸；CN和CI分別表示NBW仔豬和IUGR仔豬結(jié)腸，下同。

A～C.仔豬空腸、回腸和結(jié)腸菌群的主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果；D～F.仔豬空腸、回腸和結(jié)腸菌群非度量多維尺度分析(NMDS)結(jié)果。

2.3 NBW與IUGR仔豬腸道菌群在門(mén)水平上比較

如圖3所示，在空腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，77.87%)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，4.27%)，變形菌門(mén)(Proteobacteria，6.66%)和放線菌門(mén)(Actinobacteria，6.74%)，IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes(74.47%)，Bacteroidetes(3.51%)，Proteobacteria(12.46)和Actinobacteria(4.69%)；在回腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes(92.06%)，Bacteroidetes(1.44%)，Proteobacteria(3.13%)和Actinobacteria(2.41%)，IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes(85.37%)，Bacteroidetes(1.5%)，Proteobacteria(6.13%)和Actinobacteria(6.04%)；在結(jié)腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes(59.62%)，Bacteroidetes(37.44%)，Proteobacteria(0.35%)和螺旋體門(mén)(Spirochaetes，1.31%)，而IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes(58.19%)，Bacteroidetes(39.28%)，Spirochaetes(0.79%)和Actinobacteria(0.49%)。與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸Proteobacteria豐度呈升高趨勢(shì)(P=0.08)，回腸Proteobacteria和Actinobacteria豐度顯著升高、Firmicutes豐度顯著降低(P<0.05)。

A. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結(jié)腸菌群在門(mén)水平上的組成；B. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結(jié)腸在門(mén)水平上的差異。

A. NBW和IUGR仔豬空腸、回腸和結(jié)腸菌群在屬水平上的組成；B～E. NBW和IUGR仔豬空腸的差異菌；F～I(xiàn). NBW和IUGR仔豬回腸的差異菌；J～M. NBW和IUGR仔豬回腸的差異菌。

2.4 NBW與IUGR仔豬腸道菌群在屬水平上比較

如圖示4所示，在空腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus，18.34%)，鏈球菌屬(Streptococcus,14.71%),魏斯氏菌屬(Weissella,4.79%)和SMB53(1.68%),而IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)actobacillus(18.65%)，Streptococcus(14.10%)，假單胞菌屬(Pseudomonas，5.40%)和Weissella(4.28%)；在回腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus(24.65%)，Streptococcus(16.13%),Weissella(4.81%)和梭菌屬(Clostridium,1.99%),IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus(15.74%)，Streptococcus(15.11%)，Weissella(3.25%)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium，2.83%)；在結(jié)腸內(nèi)容物中，NBW仔豬優(yōu)勢(shì)菌屬為普氏菌屬(Prevotella，23.05%)，Lactobacillus(5.09%)，顫螺旋菌屬(Oscillospira，4.87%)和羅斯氏菌屬(Roseburia，3.07%)，IUGR仔豬優(yōu)勢(shì)菌屬為Prevotella(18.44%)，Oscillospira(3.61%)，糞桿菌屬(Faecalibacterium，2.85%)和Roseburia(2.72%)。

此外，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸葡萄球菌屬(Staphylococcus)和布雷德菌屬(Bulleidia)豐度顯著升高(P<0.05)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Allobaculum豐度顯著降低(P<0.05)；IUGR仔豬回腸Corynebacterium、放線菌屬(Actinomyces)、芽殖菌屬(Gemmiger)和Bulleidia豐度均顯著升高(P<0.05)；IUGR仔豬結(jié)腸Clostridium和Bulleidia豐度顯著升高(P<0.05)，Dorea和布勞特氏菌屬(Blautia)豐度顯著降低(P<0.05)。

2.5 NBW與IUGR仔豬腸道菌群豐度與器官生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)性分析

如圖5所示，仔豬空腸Firmicutes與肝系數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Bulleidia與末重、肝臟重和空腸重呈顯著負(fù)相關(guān)、與脾系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Staphylococcus與末重、肝臟重和胰腺重呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；仔豬回腸Firmicutes與回腸重、回腸長(zhǎng)度和回腸系數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Proteobacter與回腸重、回腸系數(shù)和肝系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Actinomyces與肝系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Gemmiger與回腸系數(shù)和肝系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Bulleidia與回腸系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；仔豬結(jié)腸Actinobacteria與結(jié)腸重和結(jié)腸系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Proteobacteria與胰腺重呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

A. NBW和IUGR仔豬空腸差異菌與器官發(fā)育的相關(guān)性熱圖；B. NBW和IUGR仔豬回腸差異菌與器官發(fā)育的相關(guān)性熱圖；C. NBW和IUGR仔豬結(jié)腸差異菌與器官發(fā)育的相關(guān)性熱圖。

3 討論

哺乳動(dòng)物腸道微生物深刻影響著宿主的健康和疾病進(jìn)程[1]。越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群改變了宿主腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程[2]，并且還對(duì)宿主代謝和生長(zhǎng)發(fā)育有著深遠(yuǎn)影響[10]。本文研究了NBW仔豬和IUGR仔豬腸道菌群定植特征的差異，并探討了其與仔豬器官發(fā)育的潛在聯(lián)系。研究結(jié)果表明，IUGR嚴(yán)重阻礙了仔豬器官的生長(zhǎng)發(fā)育，還顯著改變了斷奶仔豬腸道菌的組成和豐度，并且二者之間存在一定的聯(lián)系。

腸道的正常發(fā)育對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[11]。有研究結(jié)果表明，仔豬小腸長(zhǎng)度與其平均日增重、平均日采食量和末重呈顯著正相關(guān)，小腸較長(zhǎng)的仔豬具有更好的消化和吸收能力[12]。在本試驗(yàn)中，斷奶仔豬經(jīng)28 d飼喂后發(fā)現(xiàn)，IUGR仔豬的末重和器官系數(shù)(包括肝臟和腸道等)仍然顯著低于NBW仔豬，并且IUGR豬的空腸、回腸和結(jié)腸重量和長(zhǎng)度也明顯降低，這與我們的前期研究結(jié)果一致[7]。綜上結(jié)果表明，IUGR可降低斷奶仔豬器官的正常生長(zhǎng)發(fā)育，并且腸道發(fā)育受損可能是影響IUGR仔豬生長(zhǎng)的重要因素[13]。

腸道菌群在維護(hù)宿主正常生理過(guò)程方面發(fā)揮著重要作用，并且其組成和活性也受到宿主腸道內(nèi)環(huán)境的影響。我們的前期研究表明，哺乳IUGR仔豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度以及與宿主代謝相關(guān)的腸道菌群代謝通路發(fā)生明顯改變[14]。在本試驗(yàn)中，NBW仔豬和IUGR仔豬斷奶后28 d內(nèi)腸道菌群的多樣性和豐富度未發(fā)生明顯改變，而斷奶前IUGR仔豬腸道微生物的多樣性低于NBW仔豬[7]，這可能是因?yàn)殡S著日齡的增加IUGR仔豬腸道發(fā)育更加成熟，有助于腸道正常菌群的定植[15]。此外，在本試驗(yàn)中，仔豬腸道菌群在門(mén)和屬水平上的組成與豐度發(fā)生明顯改變。與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸Proteobacteria豐度以及回腸Proteobacteria和Actinobacteria豐度顯著升高，而Proteobacteria中包括埃希菌屬、沙門(mén)菌屬和弧菌屬等與腸道炎癥有關(guān)的菌群[16]。這表明盡管隨著日齡的增長(zhǎng)IUGR仔豬腸道功能有所恢復(fù)，但是仔豬仍然面臨著腸道疾病的威脅。此外，F(xiàn)irmicutes與宿主對(duì)食物中能量的攝取能力有關(guān)，肥胖兒童和成人腸道中含有更高的Firmicutes數(shù)量[17]。本試驗(yàn)中IUGR仔豬腸道Firmicutes豐度顯著降低，提示腸道菌群可能是阻礙IUGR仔豬能量獲得的原因之一。

Spearman分析常用來(lái)研究?jī)蓚€(gè)或多個(gè)變量之間的潛在聯(lián)系。本試驗(yàn)采用Spearman分析發(fā)現(xiàn)了多對(duì)仔豬腸道菌豐度與器官發(fā)育指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，其中，負(fù)相關(guān)關(guān)系包括回腸Firmicutes與回腸重、回腸長(zhǎng)度和回腸系數(shù)等；正相關(guān)關(guān)系包括Proteobacter與回腸重、回腸系數(shù)和肝系數(shù)，Actinomyces與肝系數(shù)等。有研究表明，腸道中Firmicutes的豐度降低不利于腸道能量的利用，進(jìn)而影響宿主能量代謝[18]；而Proteobacteria豐度升高可能導(dǎo)致致病菌的增加，引起腸道嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，不利于仔豬的腸道健康[19]。此外，有研究表明，無(wú)菌小鼠有著更小的肝臟和腸質(zhì)量、更薄的腸壁和更大的盲腸[20]，這顯示出腸道菌具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和器官發(fā)育的重要作用。以上結(jié)果表明，腸道菌群可能在IUGR仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育中有負(fù)面效應(yīng)，提示通過(guò)改善IUGR仔豬腸道菌群穩(wěn)態(tài)可能是提高其腸道健康和促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育的有效手段之一。

4 結(jié)論

IUGR可降低斷奶仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育和器官系數(shù)，而對(duì)仔豬空腸、回腸和結(jié)腸菌群的α多樣性沒(méi)有影響，但是顯著改變仔豬各腸段菌群的組成和豐度，且這種改變與仔豬的器官生長(zhǎng)發(fā)育存在一定的關(guān)系。