陳 靜，張佳寧，田紅茹，，趙志敏，，徐新軍，朱龍平，楊得坡，*

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省現(xiàn)代中藥工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 廣州 510006）

目前，痤瘡、腦膜炎、敗血癥等細(xì)菌感染性疾病已越來(lái)越引起人們的重視，而細(xì)菌的致病性與誘導(dǎo)感染的能力與生物膜的形成及毒力因子的分泌密切相關(guān)［1-5］。痤瘡丙酸桿菌Cutibacteriumacnes作為一種條件致病菌，其在面部過(guò)度繁殖是痤瘡產(chǎn)生的主要原因之一，它還可以釋放一系列毒力因子或脂肪酶等毒力酶導(dǎo)致皮膚細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)痤瘡的發(fā)生［6-7］。同時(shí)，痤瘡丙酸桿菌產(chǎn)生生物膜幫助其留置于醫(yī)療器械上，增加置換手術(shù)術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)［8］。目前，很多天然產(chǎn)物具有良好的抑菌效果且不易產(chǎn)生多重耐藥性，可作為理想的抗菌劑使用［9］。

山蒼子是樟科木姜子屬植物山雞椒Litseacubeba（Lour.） Pers.的果實(shí)，是我國(guó)傳統(tǒng)木本精油植物資源，其揮發(fā)油具有濃郁的檸檬香味，是常見(jiàn)的的天然食用香料［10］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油主要成分有檸檬醛、檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-側(cè)柏烯、檜烯、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯等，具有抑菌、抗炎、殺蟲等良好的藥理活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥、化工及畜禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用潛力［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了山蒼子精油主要成分對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性，通過(guò)探究精油對(duì)菌生物膜的破壞及毒力酶分泌的影響及對(duì)痤瘡丙酸桿菌致病性的抑制作用，以期為其應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 山蒼子成熟果實(shí)于7 月中旬采自廣東省廣州市從化區(qū)，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院楊得坡教授鑒定為正品，保存于中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

檸檬醛、檜烯對(duì)照品（純度98%、98%，上海源葉生物科技有限公司）； 檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯對(duì)照品（純度95%、98%、98%、95%、98%、90%，上海麥克林生化科技有限公司）； α-側(cè)柏烯對(duì)照品（純度95%，信陽(yáng)萊耀生物科技有限公司）。

Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司； 脂肪酶試劑盒Lipase assay kit 購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基 腦心浸出液肉湯（BHI） 干粉購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司； 強(qiáng)化梭菌瓊脂（RCA） 購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。

1.3 菌株 痤瘡丙酸桿菌 （Cutibacteriumacnes，ATCC6919） 由中山大學(xué)藥劑學(xué)徐月紅課題組贈(zèng)予，保存于中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 儀器 紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； Synergy H1 型酶標(biāo)儀 （美國(guó)Bio-Tek 公司）；CytoFLEX S 型流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

2 方法

2.1 山蒼子精油主要成分對(duì)細(xì)菌的MIC 測(cè)定 課題組前期研究表明，山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌有較好抑制作用［12］。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI） 推薦，采用微量二倍稀釋法測(cè)定山蒼子精油主要成分對(duì)痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）［13］，將相應(yīng)對(duì)照品連續(xù)對(duì)半稀釋后加入96 孔板中，1.0×105CFU/mL 大腸桿菌在質(zhì)量濃度19.2～0.009 375 mg/mL 的精油中厭氧培養(yǎng)48 h 后測(cè)定MIC，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照為氨芐西林，陰性對(duì)照為0.1% 吐溫80 溶液，每個(gè)濃度3 個(gè)平行，每組重復(fù)3 次。

2.2 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜形成的影響

2.2.1 細(xì)菌表面疏水性測(cè)定 根據(jù)唐才林等［14］報(bào)道并作適當(dāng)修改，將不同質(zhì)量濃度精油組（200、400、800 μg/mL）、對(duì)照組（0.1%吐溫80 溶液） 菌液于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后調(diào)整菌液OD600為0.5±0.05，加入2 mL 正十六烷至3 mL 菌懸液中，渦旋60 s混勻，室溫下靜置30 min，待有機(jī)相完全分離后吸去上層有機(jī)相，取水相測(cè)定值，并借助疏水性指數(shù)對(duì)細(xì)菌表面疏水性進(jìn)行量化，公式如下。

2.2.2 細(xì)菌生物膜形成測(cè)定 參考先前研究方法，采用96 孔板結(jié)晶紫染色法。添加精油到一定濃度的菌液中，使其最終給藥質(zhì)量濃度分別為200、400、800、1 600 μg/mL，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)6 d，棄去上層浮游細(xì)胞，用無(wú)菌水洗滌后加入甲醇固定10 min，移去后風(fēng)干5 min，用0.1%結(jié)晶紫對(duì)生物膜進(jìn)行染色20 min，移除并加入95%乙醇脫色15 min，取脫色液100 μL 于空白96 孔板，用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以未添加精油對(duì)照組的生物膜形成為100%，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組生物膜形成百分比進(jìn)行計(jì)算［15］。

2.2.3 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA 泄露實(shí)驗(yàn)測(cè)定 參考陳嘉麗等［16］報(bào)道并稍加改動(dòng)，給藥組為山蒼子精油（質(zhì)量濃度為“2.2.2” 項(xiàng)下），對(duì)照組為0.1%吐溫80 溶液，2 組與細(xì)菌共培養(yǎng)1、2 h 后檢測(cè)培養(yǎng)基中DNA 和RNA。

2.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，加入精油-吐溫溶液 （質(zhì)量濃度為 “2.2.2” 項(xiàng)下），180 r/min 培養(yǎng)8 h 后離心，用PBS 緩沖液沖洗3 次，將菌懸液濃度稀釋為1.0×106CFU/mL，取100 μL，按照Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 山蒼子精油對(duì)細(xì)菌釋放脂肪酶影響 痤瘡丙酸桿菌（1×109CFU/mL） 與質(zhì)量濃度為400、200 μg/mL 的精油-吐溫80 溶液共培養(yǎng)，對(duì)照組與之前相同。在37 ℃、180 r/min厭氧條件下培養(yǎng)8 h 后離心取上清液，用脂肪酶試劑盒Lipase assay kit 檢測(cè)其脂肪酶的含量變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行計(jì)算并作圖，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山蒼子精油主要成分MIC 表1 顯示，各成分MIC 依次為α-松油醇、β-月桂烯＜4-萜烯醇、α-側(cè)柏烯與檜烯＜芳樟醇＜β-蒎烯＜檸檬醛。

3.2 細(xì)菌表面疏水性測(cè)定 對(duì)照組的初始疏水性指數(shù)為37.78%，精油干預(yù)后其隨給藥質(zhì)量濃度增加而降低（P＜0.01），分別為20.99%、10.94%、7.35%，見(jiàn)圖1。

圖1 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌表面疏水性的影響（n＝9）

3.3 生物膜形成測(cè)定 精油抑制痤瘡丙酸桿菌生物膜形成（P＜0.01），并且隨著給藥質(zhì)量濃度增加分別減少至48.95%、75.97%、76.97%、80.73%，見(jiàn)圖2。

圖2 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜形成的影響（n＝12）

3.4 DNA 和RNA 泄露實(shí)驗(yàn) 精油干預(yù)1 h 后，上清液中DNA 含量隨給藥質(zhì)量濃度增加而升高，分別是對(duì)照組的12.3、19.2、18.9、32.5 倍； 精油干預(yù)2 h 后，DNA 含量分別是對(duì)照組的18.4、25.4、25.9、34.1 倍，RNA 在培養(yǎng)基中的滲漏情況與DNA 基本一致，表明精油增加了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性（P＜0.01），并呈濃度和時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖3。

圖3 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響（n＝9）

3.5 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記法 利用FITC 標(biāo)記的Annexin-V 與PI 進(jìn)行雙染色，圖中4 個(gè)象限Q1～Q4 分別代表壞死細(xì)胞和碎片、死細(xì)胞、受傷細(xì)胞和活細(xì)胞。與對(duì)照組比較，精油干預(yù)后受傷細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05），并且呈濃度依賴性； 為200 μg/mL 時(shí)，受傷細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記的影響（n＝3）

3.6 脂肪酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，添加了精油的培養(yǎng)基中脂肪酶隨著給藥質(zhì)量濃度增加而減少（P＜0.01），分泌量分別減少78.6%、88.8%，見(jiàn)圖5。

圖5 山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌脂肪酶分泌的影響（n＝9）

4 討論

痤瘡是目前全球最常見(jiàn)的慢性皮膚病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有80%以上的人曾經(jīng)或者現(xiàn)在正在受到該疾病的影響，其成因非常復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為是由過(guò)度角化、皮脂分泌、炎癥介質(zhì)釋放及痤瘡丙酸桿菌皮脂腺定植導(dǎo)致的［17-18］。作為誘發(fā)痤瘡的重要菌株，痤瘡丙酸桿菌一直是研究熱點(diǎn)。與其他細(xì)菌一樣，由于存在缺乏新型抗生素、濫用抗生素等問(wèn)題，天然產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于痤瘡丙酸桿菌的治療［19］。

山蒼子揮發(fā)油是一種使用歷史悠久的芳香精油，很多研究表明，該精油對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有很好的抑菌活性［10］。根據(jù)課題組前期對(duì)山蒼子精油藥敏活性篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)痤瘡丙酸桿菌有較好抑制作用。目前未見(jiàn)有關(guān)山蒼子精油各成分的抗痤瘡丙酸桿菌活性的研究報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了該精油各成分的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)檸檬醛作為山蒼子精油主要成分（超過(guò)50%），其對(duì)痤瘡丙酸桿菌抑菌活性較好（MIC 為800 μg/mL）； 其他含量較低的成分，如α-松油醇、β-月桂烯、4-萜烯醇、α-側(cè)柏烯、檜烯、芳樟醇、β-蒎烯，均對(duì)該菌表現(xiàn)出較好的抑制作用。

痤瘡丙酸桿菌與金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌一樣，都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山蒼子精油會(huì)破壞痤瘡丙酸桿菌的細(xì)胞膜，造成細(xì)胞內(nèi)重要生物大分子的外泄，這與之前報(bào)道的該精油對(duì)其他陽(yáng)性菌細(xì)胞膜破壞現(xiàn)象類似［20-21］。根據(jù)Higaki 等［22］研究表明，痤瘡丙酸桿菌所釋放的脂肪酶是誘發(fā)痤瘡的重要致病因素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山蒼子精油對(duì)痤瘡丙酸桿菌脂肪酶釋放量有很好的抑制作用，精油在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞無(wú)顯著性損傷的質(zhì)量濃度（200 μg/mL） 下即可顯著抑制脂肪酶活性，說(shuō)明精油可能通過(guò)抑制該毒力酶的分泌而降低誘發(fā)痤瘡的可能性。

綜上所述，山蒼子精油可能是通過(guò)破壞痤瘡丙酸桿菌生物膜及減少毒力酶的分泌，降低其誘導(dǎo)感染的能力。此外，該精油中的主要成分檸檬醛及其他含量較低的次要成分也有助于其抗痤瘡丙酸桿菌。