馮子芳，袁曉航，陳曉偉，胡敏敏，張文明，顧麗紅，楊慶有，2，卞振華*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214074； 2.無錫轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，江蘇 無錫 214000）

目前，慢性腎臟病對人類健康造成嚴(yán)重危害，患病率達10% ～12%，容易與心血管疾病合并而導(dǎo)致高致殘率、高病死率、預(yù)后不良等，是全球公共衛(wèi)生的重要議題［1-2］。益腎泄?jié)岷蟿ㄌK藥制備字Z20220028000） 是無錫市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由黃芪、酒萸肉、紫蘇葉、法半夏、黃連、薏苡仁、熟大黃、燀桃仁、積雪草組成，腎內(nèi)科以健脾益腎、化瘀泄?jié)釣橹笇?dǎo)，根據(jù)治病宜謹(jǐn)守病機的原則創(chuàng)立本方，針對早中期慢性腎臟病療效較好［3］。環(huán)烯醚萜苷類（莫諾苷、馬錢苷等）、有機酸 （沒食子酸） 及其酯類［4］為其君藥山茱萸的主要活性成分，其中莫諾苷和馬錢苷不僅含量最高，而且是特征性成分［5］，沒食子酸還具有抗氧化、抗癌等作用［6］； 大黃中的蒽醌類是一種具有抗炎、保護心血管等作用的重要活性成分，包括大黃酸、大黃酚等［7］。

前期已有對于其臨床療效及提取工藝的研究［8-9］，未見質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報道，本研究參考前期報道，建立HPLC法測定益腎泄?jié)岷蟿┲泻扛摺⒁滋崛〉木廃S芪（毛蕊異黃酮苷）、山茱萸（莫諾苷、馬錢苷、沒食子酸）、佐藥大黃（大黃酸） 的含量，為制劑質(zhì)量的整體控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、DAD 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）； DHG-9101-0SA 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（常州普天儀器制造有限公司）； BSA224S-CW 電子天平（德國Sartorius 公司）； KQ-500DE 數(shù)控超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸（批號C13O9C72105，純度≥98%）、莫諾苷（批號Z12O8B45504，純度≥97%）、馬錢苷（批號P22F10F81444，純度≥98%）、毛蕊異黃酮苷（批號 J19HB174062，純度≥98%）、大黃酸 （ 批號T06J10F92311，純度≥98%） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）； 其他試劑均為分析純； 水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

中藥飲片均來源于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)無錫市中醫(yī)醫(yī)院副主任中藥師王卿鑒定為正品，具體見表1。

表1 中藥飲片信息

益腎泄?jié)岷蟿? mL 相當(dāng)于飲片1.18 g） 由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備（制備工藝［9］為加12 倍量水浸泡30 min，煎煮2 次，每次1.5 h），共10 批（S1 ～S10），批號20221201～20221210。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考前期報道，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～10 min，2% ～4%B； 10 ～15 min，4% ～6% B； 15 ～20 min，6% ～7% B； 20 ～22 min，7% ～10%B； 22 ～32 min，10% B； 32 ～40 min，10% ～13%B； 40～50 min，13%B； 50 ～90 min，13% ～52% B； 90～95 min，52% B； 95 ～100 min，52% ～2% B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長254 nm； 進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加入70%甲醇制成每1 mL 分別含沒食子酸99.20 μg、莫諾苷154.40 μg、馬錢苷97.60 μg、毛蕊異黃酮苷39.20 μg、大黃酸49.60 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取益腎泄?jié)岷蟿?.5 mL，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇超聲（40 kHz、100 W） 處理10 min，冷卻至室溫，稀釋至刻度，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 參考文獻［10］ 報道，根據(jù)處方工藝［9］，按“2.2.2” 項下方法分別制備缺山茱萸、缺黃芪、缺大黃的陰性樣品，即得。

2.3 方法學(xué)考察 參考文獻［11］ 報道。

2.3.1 專屬性考察 分別取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，可見色譜峰分離度較好，陰性無干擾，缺山茱萸陰性樣品溶液中無沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷峰，缺黃芪陰性樣品溶液中無毛蕊異黃酮苷峰，缺大黃陰性樣品溶液中無大黃酸峰，表明該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 參考文獻［12］ 報道，精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，70%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，稀釋5 倍，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷、大黃酸峰面積RSD 分別為0.16%、0.70%、0.16%、0.11%、0.07%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密量取益腎泄?jié)岷蟿ㄅ?0221205，S5） 6 份，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷、大黃酸峰面積RSD分別為1.81%、1.00%、0.98%、1.00%、1.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一份益腎泄?jié)岷蟿ㄅ?0221205，S5），于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷、大黃酸峰面積RSD 分別為1.43%、0.31%、0.42%、0.52%、0.52%，表明溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 參考文獻［13］ 報道，精密量取各成分含量已知的益腎泄?jié)岷蟿⊿5） 0.75 mL，共6 份，置于10 mL 量瓶中，精密加入含沒食子酸130.10 μg/mL、莫諾苷422.00 μg/mL、馬錢苷160.30 μg/mL、毛蕊異黃酮苷40.20 μg/mL、大黃酸65.30 μg/mL 的對照品溶液1 mL，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷、大黃酸平均加樣回收率分別為102.15%、103.82%、100.30%、97.76%、97.97%，RSD 分別為2.70%、2.64%、2.83%、2.59%、2.58%。

2.3.7 樣品含量測定 按“2.2.2” 項下方法制備10 批益腎泄?jié)岷蟿┑墓┰嚻啡芤?，在?.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（μg/mL）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 本方以黃芪、山茱萸為君藥，2020年版《中國藥典》 將毛蕊異黃酮苷作為黃芪質(zhì)量控制成分［14］，專屬性強，療效確切。山茱萸中含量最高的一類化合物是環(huán)烯醚類，這些化合物大多與糖分子結(jié)合成環(huán)烯醚萜苷［15］，其主要成分莫諾苷和馬錢苷含量高達85%，是主要的有效成分，在糖尿病、腎病、炎癥的治療上效果較好，同時也是2020 年版《中國藥典》 中山茱萸的質(zhì)量控制成分［14，16-18］?，F(xiàn)代研究表明，山茱萸含有的有機酸及其酯類成分，對腎虛、月經(jīng)過多氣血虛弱等患者療效較好［19-20］。大黃為佐藥，吳新程［21］研究表明，大黃酸的抗纖維化作用是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 信號通路來實現(xiàn)的。鐘瑜萍等［22］研究發(fā)現(xiàn)，大黃-黃芪配伍可減輕慢性腎衰大鼠蛋白尿的臨床癥狀，減少腎臟的病理損害，從而保護腎臟功能，提高腎小球濾過率。

3.2 色譜柱選擇 通過查閱文獻［23-24］，采用不同色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、YMC-Pack ODS-AC18、Waters XBridge C18） 測定各成分含量，發(fā)現(xiàn)均能較好地分離，無顯著差異，表明該方法適用性較好。

3.3 流動相選擇 考察不同流動相對色譜峰分離的影響，采用甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈的洗脫效果優(yōu)于甲醇，加入一定量的磷酸可以改善峰形，因此選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

3.4 柱溫選擇 對色譜峰在不同柱溫（25、30、35 ℃）下的出峰情況進行考察，發(fā)現(xiàn)柱溫降低，色譜峰保留時間延后，相反則提前出峰； 為25 ℃時，各成分出峰時間明顯延后，洗脫時間較長，分離效率較低； 為35 ℃時，沒食子酸保留時間在5 min 內(nèi)，與溶劑峰重合，最終確定為30 ℃。

3.5 檢測波長選擇 對沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷和大黃酸進行全波長掃描，最終確定為254 nm，此時益腎泄?jié)岷蟿┲懈鞒煞肿贤馕蛰^好，雜質(zhì)干擾較小。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC 法同時測定益腎泄?jié)岷蟿┲? 種成分（沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、毛蕊異黃酮苷和大黃酸） 的含量，該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可為該方質(zhì)量評價和控制提供依據(jù)。