程馨瑋，高 萍

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院藥學部，湖北 武漢 430015； 2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部，湖北 武漢 430030）

黃芪是被廣泛應用的傳統(tǒng)中藥材，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.） Bge.的干燥根，具有扶正補氣之功效。黃芪的藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)等生物活性，在抗心腦血管疾病、病毒感染、腫瘤、衰老等方面具有重要作用［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃芪對多種疾病的干預效果均與其調控細胞自噬有著密切關系［2］。因此，本文對黃芪及其活性成分調控細胞自噬的分子機制和藥理作用進行總結，以期為黃芪治療自噬相關疾病提供新的探索方向，為其他中藥在細胞自噬領域的研究提供參考。

1 自噬概述

1.1 定義 自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，不僅可以消除細胞內錯誤折疊的蛋白質、功能受損的細胞器以及入侵的微生物，還能作為一種動態(tài)循環(huán)媒介，為細胞更新和內環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡提供新的組件和能量，以協(xié)助細胞應對各種應激和不利條件［3］，但自噬過度激活反而會降解細胞核導致細胞死亡［4］。

1.2 分類與過程 根據細胞中被降解物質與溶酶體結合的形態(tài)和機制的差異，自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。通常研究的自噬是指巨自噬，其過程包括自噬的激活，自噬體的形成、延伸、成熟及自噬體與溶酶體的融合［5］。當細胞處于應激環(huán)境下，如氧化應激、能量缺乏、缺氧等，腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK） 等蛋白能夠廣泛抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 從而啟動自噬。當自噬被激活后，由自噬相關基因蛋白 13（Autophagy-related gene13，Atg13）、unc-51 樣自噬激活激酶1 （unc-51-like kinase 1，ULK1） 和黏著斑激酶家族相互作用蛋白200kda 形成ULK 復合體錨定于自噬囊泡上［6-7］，募集并動員包含VSP34、Beclin1、p150 和Atg14 的Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K） 復合體。Ⅲ型PI3K 復合體能夠結合自噬囊膜組分，引導更多Atg 蛋白定位［8］。隨后，經過Atg12-Atg5 和微管相關蛋白1輕鏈3 （light chain 3，LC3） 2 個類泛素化結合修飾過程［9］，自噬囊泡膜逐漸延伸。LC3 經過切割、泛素修飾、共價結合脂分子磷脂酰乙醇胺形成LC3-Ⅱ，附著在自噬囊泡膜上，參與自噬囊泡的延伸并最終閉合形成自噬體。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體［7］，最終經溶酶體內的蛋白酶發(fā)揮作用完成對內容物的降解。

1.3 在疾病中的作用 自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，自噬與神經紊亂、發(fā)育異常、炎癥性疾病、衰老、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關［10］。對于人體正常組織器官，自噬上調被認為是一種對細胞應激的適應性反應，是機體的自我保護機制之一。自噬作為降解聚集蛋白和受損細胞器的主要機制，其功能障礙與多種神經退行性疾病有關，如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化癥等［11］。然而過度的自噬也會造成器官損傷，在新生兒缺血性腦損傷疾病中，自噬的過度激活可導致神經細胞大量死亡［4］； 缺血-再灌注心肌損傷模型中，再灌注階段觀察到自噬表達大規(guī)模增加和心肌細胞死亡［12］。癌癥發(fā)展的不同階段，自噬分別起著抑制或促進腫瘤作用： 腫瘤發(fā)生早期，自噬可阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并上調腫瘤對化療藥物的敏感性； 晚期階段相反，自噬會促進已形成的腫瘤的生存生長并提高腫瘤的侵襲性［13］。

2 黃芪對自噬的調控及臨床意義

近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬是黃芪發(fā)揮生物活性的重要藥理機制。黃芪含有多種活性成分，包括多糖、皂苷類、黃酮類及氨基酸、微量元素等，目前對自噬的調控機制研究多集中于黃芪多糖、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮。

黃芪對自噬的調控具有兩重性，其具體的調節(jié)方向可能與細胞本身的自噬水平相關。一方面，當細胞內自噬水平處于抑制狀態(tài)時，黃芪能夠上調自噬活性。在糖尿病大鼠模型中，黃芪甲苷可增加自噬相關信號的表達，改善肝功能和血糖穩(wěn)態(tài)［14］，減輕腎足細胞的凋亡，改善大鼠糖尿病腎?。?5］，緩解施旺細胞凋亡導致的周圍神經病變［16］，為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供一種新的策略； 黃芪甲苷還可通過增強自噬減輕細胞的炎癥反應和吸煙導致的肺損傷［17］； 黃芪甲苷也可作為抗先兆子癇的保護劑和治療劑，通過誘導細胞自噬實現(xiàn)對氧化應激誘導的滋養(yǎng)層細胞損傷的保護作用［18］。在黃芪多糖作用下，宮頸癌細胞［19］、胃癌細胞［20］、胰腺癌細胞［21］的自噬相關蛋白表達升高，癌細胞對化療藥物敏感性增加。

另一方面，黃芪能夠下調細胞的過度自噬。毛蕊異黃酮以劑量依賴性抑制血管緊張素Ⅱ誘導腎小球系膜細胞的自噬［22］，還可抑制慢性腎臟病大鼠的骨骼肌細胞自噬，緩解骨骼肌萎縮［23］，對大鼠慢性腎臟疾病及其并發(fā)癥有治療或預防作用； 黃芪甲苷及黃芪注射液抑制缺血性心肌病大鼠心肌細胞的自噬、顯著降低心肌重塑［24-25］； 黃芪多糖對高磷酸鹽誘導損傷動脈平滑肌細胞損傷的保護作用，也是通過抑制過度自噬實現(xiàn)的［26］。

3 黃芪調節(jié)自噬的相關信號通路

3.1 PI3K/AKT 通路 黃芪可通過mTOR 依賴和非依賴性途徑影響PI3K/蛋白激酶B （protein kinase B，PKB 或稱AKT） 通路，從而調節(jié)自噬。Ⅰ型PI3K 可促使AKT 磷酸化而使其激活，活化的AKT 能夠抑制結節(jié)硬化復合物，減弱其對GTP 形式的Ras 家族蛋白腦組織同源類似物（ras homolog enriched in brain，Rheb） 的水解作用，使得Rheb-GTP 積累并進一步活化mTORC1，從而抑制自噬的啟動［27］。眾多研究表明，黃芪甲苷和黃芪多糖可以抑制細胞PI3K/AKT/mTORC1 通路促進自噬，延緩疾病進展［16，28-30］。磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN） 是PI3K/AKT/mTORC1 通路的負調節(jié)因子，能夠直接阻止AKT 磷酸化進程［31-32］。黃芪多糖可增加PTEN 的表達，抑制AKT 的磷酸化，有助于自噬的啟動［33］。Lv 等［34］研究表明microRNA-155 可抑制Rheb 的轉錄從而增強細胞自噬活性。在黃芪甲苷作用下，microRNA-155 的表達上調并促進細胞自噬，減輕施旺細胞凋亡所致的髓鞘損傷［16］。而在自噬水平異常增加的病理狀態(tài)，如缺氧-復氧所致的心肌細胞損傷，黃芪甲苷和黃芪多糖也能夠激活PI3K/AKT/mTORC1 通路抑制自噬［35-36］，其具體調控機制尚不明確。

另一方面，黃芪還可以影響AKT 其他底物，即通過非mTOR 依賴性通路調節(jié)自噬。AKT 能夠增加下游分子質量為160 ku 的蛋白激酶B 的底物蛋白（AKT substrate of 160 ku，AS160） 的磷酸化，致使后者將GDP 轉化為GTP 的作用受到抑制，引起Ras 相關蛋白14 過早在吞噬體膜聚集，而抑制自噬體的成熟，最終抑制自噬活性［37］。Lu 等［30］發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能顯著抑制PI3K/AKT/AS160 通路的激活，增加細胞自噬，改善慢性糖尿病大鼠腎功能的損傷。

3.2 MAPK 信號通路 絲裂原活化激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 通路包括細胞外信號調控的蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 和p38 有絲分裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），共同調節(jié)細胞的生長、分化、應激、自噬、炎癥反應等多種重要的生理/病理活動［38］，但這3 種蛋白對自噬的調節(jié)位點不盡相同。p38 MAPK 既可通過抑制ULK1 的活性，阻斷其與Atg13 的相互作用［39］，亦可通過降低PTEN 的磷酸化水平來調節(jié)自噬［40］。Wu等［41］發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過抑制p38 MAPK，激活自噬，增加Ⅰ型膠原蛋白的積聚，保護中波紫外線誘導的光老化細胞，提示黃芪甲苷在抗光老化治療中具有潛在的應用前景。ERK 對自噬的調控具有兩面性，一方面，激活的ERK 可增加LC3 表達、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化、誘導Baclin-1 表達等，促進自噬［42］； 另一方面，ERK 抑制溶酶體相關膜蛋白1、2 表達，阻止溶酶體與自噬體結合，從而阻斷自噬流［43］。Ding 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮通過劑量依賴方式抑制腎系膜細胞ERK 的表達從而抑制自噬，發(fā)揮腎臟保護作用。JNK 信號通路主要是通過磷酸化B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 家族蛋白，使Baclin-1 從Bcl-2/Baclin-1 復合體中游離出來并與Vsp34、Atg14、p500 結合形成Ⅲ型PI3K 復合體，發(fā)揮促進自噬作用［44-45］。黃芪甲苷對JNK 通路有抑制作用，但目前研究僅限于凋亡、炎癥相關疾?。?6］。

3.3 AMPK 通路 AMPK 通路是細胞內生物能量調節(jié)的關鍵分子感受器［47］，也是自噬的主要正調控因子。AMPK 通過磷酸化mTORC1、ULK1 和PI3K 復合物中的自噬相關蛋白直接促進自噬，或通過調節(jié)叉頭盒狀O 轉錄因子3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3a）、轉錄調節(jié)因子EB 等轉錄因子調節(jié)下游自噬相關基因的表達間接促進自噬［48］。AMPK的活性受其上游激酶，如鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKK） 和肝激酶B1 （the liver kinase B1，LKB1） 的調節(jié)。LKB1/AMPK能量通路影響代謝應激過程中的增殖和凋亡，是自噬關鍵調節(jié)因子［49］。黃芪多糖對CaMKK 和LKB1 表達均有促進作用［50］。黃芪總皂苷能夠通過激活LKB1/AMPK 通路誘導乳腺癌細胞自噬，抑制腫瘤細胞生長和遷徙［51］。此外，黃芪多糖還能夠直接激活AMPK 誘導自噬，對脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥模型發(fā)揮抑制作用［52］，從而保護過度運動誘發(fā)的心肌損傷［53］。然而，黃芪不同活性成分對于AMPK通路可產生不同的作用。例如，在慢性腎病小鼠模型中，毛蕊異黃酮能夠抑制AMPK 和FOXO3a，從而下調LC3I/II和ATG7 的表達，減少自噬小體的形成，緩解骨骼肌萎縮［23］。

3.4 PINK1/Parkin 信號通路 線粒體在產生能量的同時也會生成并釋放副產物活性氧類 （reactive oxygen species，ROS）［54］，從而對細胞內大分子物質和線粒體造成損傷，受損的線粒體會產生更多的ROS。過量的ROS 會損傷細胞，也會觸發(fā)線粒體自噬這一細胞自我保護機制，以清除受損的線粒體、降低ROS 水平并穩(wěn)定細胞內線粒體的功能［55］。PTEN 誘導激酶1 （PTEN induced putative kinase1，PINK1） 和Parkin 蛋白是調控線粒體自噬的特異性蛋白。PINK1 能夠識別并聚集在受損傷線粒體外膜［56］，Parkin 則能夠促進線粒體外膜蛋白的泛素化，泛素化的線粒體可在多種自噬受體調節(jié)蛋白及LC3 協(xié)助下移動到自噬囊泡。在不同疾病中，黃芪甲苷對PINK1/Parkin 通路可表現(xiàn)出不同的調控作用，在5-氟尿嘧啶誘導的小鼠心肌損傷模型中，過度的自噬導致細胞死亡和心肌受損，黃芪甲苷可降低PINK1/Parkin 信號通路蛋白表達，從而抑制線粒體自噬水平，發(fā)揮心肌細胞保護作用［57］； 在心肌再灌注損傷模型中，黃芪甲苷亦可下調PINK1 和Parkin 的表達，抑制過度線粒體自噬，而且呈劑量依賴性［25，58］。同時也有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷也能夠激活該通路發(fā)揮細胞保護作用。在藍光誘導損傷的視網膜色素上皮細胞中，黃芪甲苷可通過上調細胞PINK1/Parkin 信號通路，抑制細胞產生大量ROS，緩解細胞線粒體損傷和細胞凋亡，維持細胞活力和自噬過程［59］。Su 等［15］的研究也發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠促進核因子E2 相關因子2 和KELCH 樣ECH 關聯(lián)蛋白1 的解離，上調PINK1 誘導的線粒體自噬，發(fā)揮對糖尿病大鼠的腎臟的保護作用。

3.5 其他通路 缺氧誘導因子-1 （hypoxia induciblef actor1，HIF-1） /BCL2 反應蛋白 3 （ BCL2 interacting protein3，BNIP3，BNIP3） 通路屬于非典型的自噬調節(jié)通路。HIF-1 誘導BNIP3 基因表達，BNIP3 與Beclin-1 競爭結合BCL2，然后通過從BCL2 釋放Beclin-1 而誘導自噬［60］。激素所致股骨頭壞死模型中，黃芪多糖通過下調microRNA-206，靶向增加HIF-1α 進而誘導BNIP3 表達增加，促進細胞自噬和抑制細胞凋亡，有效改善激素性股骨頭壞死［61］。

Kruppel 樣因子2 （Kruppel-like factor 2，KLF2） /混交激酶域蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL） 是新的自噬調節(jié)通路。磷酸化的MLKL 能夠被轉運到質膜上，增加其通透性，導致溶酶體功能下降［62］。KLF2 和自噬相關分子（beclin、ATG7 等） 的變化呈正相關［63］。Ma 等［64］研究表明，KLF2 是MLKL 的負調控因子，而毛蕊異黃酮能上調KLF2-MLKL 介導的自噬，顯著抑制動脈粥樣硬化的形成。

沉默信息調節(jié)因子2 相關酶1 （silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1） 是細胞中具有脫乙?；δ艿牡鞍?，有研究表明SIRT1 通過促進細胞核LC3 的脫乙酰化從而上調饑餓誘導的自噬［65］。Wang 等［66］發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可增加SIRT1 的表達，激活自噬和NF-κB途徑，抑制葡萄糖誘導的足細胞上皮-間充質轉化，改善腎功能，但這一作用可被SIRT1 抑制劑逆轉。

4 結語和展望

眾多研究表明，黃芪可通過調控自噬發(fā)揮抗炎、抗凋亡等保護性作用，進而緩解多種疾病，如癌癥、糖尿病及心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。該藥是通過直接或間接作用于PI3K/AKT、AMPK、MAPK、PINK1/Parkin 等多條信號通路來調控細胞自噬水平，調節(jié)機制見圖1。與其他自噬調節(jié)劑如雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤等不同的是，黃芪對細胞自噬的調節(jié)具有兩重性，其對自噬的抑制或促進作用可能與其活性成分、使用劑量、靶細胞的濃度以及細胞本身的病理生理條件有關。因此，未來的研究中還需要深入挖掘黃芪及其活性成分雙向調節(jié)自噬的具體機制，了解不同機制之間的潛在相互影響，從而闡明影響黃芪自噬雙重調節(jié)的因素，為其臨床治療的應用提供理論依據。

圖1 黃芪調控細胞自噬的分子機制