占慧慧，劉 媛，孟俊華，崔培梧

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥性與藥效三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，菌物藥研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

三萜化合物（triterpenoids） 是由6 個(gè)異戊二烯單元共30 個(gè)碳原子組成的一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物及動(dòng)物中［1］，是很多藥用真菌的重要活性成分，如靈芝Ganodermalucidum［2］、茯苓Poriacocos［3］、桑黃Phellinuslinteus［4］、樺褐孔菌Inonotusobliquus［5］、蟲草Cordyceps［6］、牛樟芝Antrodiacinnamomea［7］、蘑菇Agaricus campestris［8］、猴頭菌Hericiumerinaceus［9］等； 其化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性也賦予三萜豐富的生物活性，因此被視為新藥開發(fā)的重要來(lái)源之一，如靈芝中的靈芝酸［10-11］、茯苓中的茯苓酸［3，12］、樺褐孔菌中的白樺脂醇［13-15］等，均被證實(shí)具有較好的抗腫瘤、抗炎、降糖及降脂活性，且部分已進(jìn)入臨床研究階段。隨著真菌三萜潛在藥用價(jià)值的持續(xù)發(fā)掘，真菌三萜的生物合成及其綜合開發(fā)相關(guān)研究吸引了眾多科研工作者的關(guān)注。目前，真菌三萜類天然產(chǎn)物主要從其子實(shí)體中提取，但存在野生資源匱乏、人工栽培周期長(zhǎng)、質(zhì)量穩(wěn)定性差、子實(shí)體中三萜含量低等問(wèn)題，同時(shí)三萜化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性也限制了化學(xué)合成法在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。生物合成技術(shù)快速發(fā)展，利用代謝工程、基因工程等技術(shù)超表達(dá)或調(diào)控參與三萜生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因，從而實(shí)現(xiàn)三萜的高效生物合成，已成為真菌三萜資源開發(fā)領(lǐng)域最有前景的開發(fā)模式?，F(xiàn)有研究表明，三萜生物合成途徑可分為3 個(gè)階段，即前體形成、骨架構(gòu)建及后修飾，目前三萜生物合成途徑關(guān)鍵酶的相關(guān)研究主要集中在前2 個(gè)階段； 由于關(guān)鍵酶的多樣性、后修飾反應(yīng)的復(fù)雜性等問(wèn)題，后修飾階段研究進(jìn)展相對(duì)較慢，但其對(duì)于三萜化合物的結(jié)構(gòu)形成及多樣性必不可少［16-18］。因此，有必要對(duì)后修飾階段的關(guān)鍵酶相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)綜述，以期為真菌三萜生物合成途徑的充分解析、重構(gòu)和定向強(qiáng)化提供必要參考?；诖?，本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)真菌三萜生物合成途徑及其關(guān)鍵后修飾酶細(xì)胞色素P450 單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)行綜述。

1 真菌三萜的生物合成途徑

所有真菌萜類天然產(chǎn)物均來(lái)源于常見的五碳二磷酸異戊烯基中間體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP） 及其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），這2 種中間體都是通過(guò)甲羥戊酸途徑 （mevalonate pathway，MVA pathway） 合成［19］，見圖1。

圖1 MVA 合成途徑

經(jīng)MVA 途徑合成三萜類產(chǎn)物的過(guò)程可分為3 個(gè)階段，首先是上游前體物質(zhì)IPP 和DMAPP 的形成； 其次是4 種中間體牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法尼基焦磷酸 （farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）、鯊烯 （squalene，SQ）、2，3-氧化鯊烯（2，3- oxidosqualene） 的合成及三萜骨架構(gòu)建； 最后是下游后修飾過(guò)程（氧化還原、?；⑻腔龋?。圖1 中列舉了具有代表性的三萜骨架類型，包括四環(huán)的達(dá)瑪烷型、環(huán)阿屯烷型，五環(huán)的烏蘇烷型、齊墩果烷型、羽扇豆烷型等，其中環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇也分別是植物甾醇、真菌和動(dòng)物甾醇生物合成的前體。

真菌三萜主要為羊毛甾醇骨架來(lái)源的衍生物，其以羊毛甾醇為底物，在氧化酶、?；D(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等后修飾酶的催化下合成結(jié)構(gòu)多樣的羊毛甾烷類三萜，如靈芝中的靈芝酸A 和靈芝酸C、茯苓中的茯苓酸和茯苓新酸B、牛樟芝中的zhankuic acid E、Astraeuspteridis中的3-epiastrapteridiol、白樺茸中的inotodiol 等［1］，因此細(xì)胞色素P450 單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等催化酶為這些三萜化合物合成途徑后修飾階段的關(guān)鍵酶，對(duì)三萜化合物結(jié)構(gòu)的多樣性發(fā)揮著重要作用。

2 細(xì)胞色素P450 單加氧酶

細(xì)胞色素P450 單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases，簡(jiǎn)稱CYP450、P450 或CYP） 屬于超基因家族酶，是一類含有血紅素的鐵硫蛋白，能以還原態(tài)與CO 結(jié)合，在450 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，最先在哺乳動(dòng)物大鼠肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布在細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物、人等各種需氧生物體內(nèi)［20］。P450 的命名是基于其氨基酸序列的同源性，若P450 基因的氨基酸序列同源性大于40%，則納入同一家族； 若同源性大于55%，則納入同一亞家族。

Nelson［21］研究表明，真菌的CYP 基因具有豐富的多樣性，目前已對(duì)八百多種真菌基因組進(jìn)行測(cè)序，已發(fā)現(xiàn)的真菌CYP 基因超過(guò)85 000 條，真菌的CYP 家族結(jié)構(gòu)也逐漸形成，有805 個(gè)家族，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹上的不同分支被分為32 個(gè)集團(tuán)，包括含有3 個(gè)家族（CYP52、63、505） 的52 集團(tuán)、含有7 個(gè)家族（CYP53、57、507、65、60、62、58） 的53 集團(tuán)、含有5 個(gè)家族 （CYP54、506、68、69、503） 的54 集團(tuán)、含有5 個(gè)家族（CYP64、66、502、501、504） 的64 集團(tuán)及其他大量不屬于以上任何集團(tuán)的CYP 家族，如CYP51、56、59、61、67。已分離的真菌CYP 基因多歸屬于CYP51 ～CYP66 家族［22］，其中CYP51 和CYP61的進(jìn)化較為保守，功能研究較為透徹，主要參與麥角甾醇的代謝途徑［23］。

CYP 參與真菌三萜骨架修飾，如催化碳環(huán)骨架上的不同位置發(fā)生氧化反應(yīng)以形成羥基、羧基、酮基、雙鍵等不飽和基團(tuán)，與真菌三萜的多樣性密切相關(guān)。因此，CYP 的克隆和功能研究對(duì)解析真菌三萜生物合成途徑及增加活性物質(zhì)三萜的產(chǎn)量具有重要的作用，但關(guān)于真菌三萜CYP 的研究相對(duì)較少，目前已報(bào)道的參與三萜骨架修飾的CYP 基因絕大多數(shù)來(lái)自于植物，詳見表1［24-25］。

表1 參與三萜結(jié)構(gòu)修飾的CYP 基因

田風(fēng)華［26］將真菌中的元蘑Sarcomyxaedulis參考基因組SE1 與植物中已鑒定的32 個(gè)CYP 超家族中三萜合成相關(guān)的基因進(jìn)行序列比對(duì)，植物包括糙伏毛燕麥、擬南芥、百脈根、大豆、蒺藜苜蓿、烏拉爾甘草、葡萄、人參和長(zhǎng)春花，共獲得142 個(gè)相關(guān)CYP 基因，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析，有82 個(gè)基因呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)，其中有21 個(gè)參與以β-香樹酯醇為骨架的三萜氧化修飾過(guò)程，并對(duì)其在相應(yīng)三萜后修飾途徑中的作用進(jìn)行了預(yù)測(cè)，屬于CYP51 類型 （cyp51h10） 的CYP 基因有5 個(gè)（SE.1A1769、SE.1A3105、SE.1A6400、SE.1A8868、SE.1A8872），主要參與對(duì)β-香樹酯醇的12、13 位的氧化修飾； 屬于CYP71 類型（cyp93E1、cyp93E2、cyp93E3） 的CYP 基因有2 個(gè)（SE.1A5016、SE.1A7086），參與對(duì)β-香樹酯醇的24 位的氧化修飾，也可能參與對(duì)β-香樹酯醇的一級(jí)修飾產(chǎn)物槐二醇（Sophoradiol） 的氧化修飾；屬于CYP72 類型 （cyp72A63、cyp72A154、cyp72A612） 的CYP 基因有5 個(gè)（SE.1A5981、SE.1A0547、SE.1A2193、SE.1A7668、SE.1A7798），其中SE.1A5981 基因參與對(duì)β-香樹酯醇的30 位的氧化修飾，且上調(diào)表達(dá)修飾，而其他4 個(gè)基因則可能參與多種二級(jí)修飾途徑； 屬于CYP85 類型（cyp88D6） 的CYP 基因有3 個(gè)（SE.1A3202、SE.1A7455、SE.1A3577），其中SE.1A3202 和SE.1A7455 參與對(duì)β-香樹酯醇11 位的氧化修飾，而SE.1A3577 基因則參與對(duì)β-香樹酯醇的羧化修飾，三者均為一級(jí)修飾。以上研究表明，眾多的CYP 也都來(lái)源于同一個(gè)祖先，基因序列具有一定的同源性，因此在植物中報(bào)道的與三萜合成相關(guān)的CYP 基因，如朱靈英等［24］總結(jié)的植物中近100 個(gè)與三萜合成相關(guān)的CYP 基因，可以為真菌三萜CYP 基因的挖掘提供參考。

方星等［27］通過(guò)檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)已報(bào)道5 種真菌的CYP51 氨基酸序列比對(duì)后獲得了CYP51 氨基酸序列保守區(qū)域，并利用PCR 技術(shù)克隆得到靈芝CYP51 基因（Glcyp51）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)了Gl-cyp51 在靈芝內(nèi)的超量表達(dá)和靈芝三萜含量的增加。結(jié)合其他相關(guān)研究，CYP51 在三萜骨架修飾中的重要意義被普遍證實(shí)，如孫婷婷［28］在研究中利用已鑒定功能的CYP 氨基酸序列與桑黃基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出7 個(gè)同源性大于55% 的CYP 候選基因，蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明這7 個(gè)候選基因全部具有P450 保守結(jié)構(gòu)域，其中4 個(gè)被注釋為羊毛甾醇14α-脫甲基酶，屬于CYP51 家族； 隨后劉增才等［29-30］在此基礎(chǔ)上克隆得到暴馬桑黃Sanghuangporusbaumii羊毛甾醇14α-脫甲基酶基因（lanosterol14-alpha-demethylase，LSD） 的2 條cDNA 序列，分別命名為SbLSD （登錄號(hào)MN864180） 和SbLSD1 （登錄號(hào)MN640689），通過(guò)生物信息學(xué)及原核差異表達(dá)分析，表明兩條基因都屬于CYP 超家族成員，與靈芝的LSD 蛋白同源性最高（99%），高度的同源性說(shuō)明SbLSD蛋白與靈芝等物種的LSD 蛋白在三萜合成過(guò)程中可能具有相似的功能。

除了通過(guò)與植物和真菌中已鑒定的三萜合成相關(guān)CYP基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析從而獲得目標(biāo)真菌三萜合成相關(guān)的CYP 基因外，也有學(xué)者直接對(duì)多種目標(biāo)真菌CYP 家族基因進(jìn)行富集、鑒定和分析，從整體上比較和把握真菌三萜合成相關(guān)CYP 基因的共性。如Syed 等［31］首次對(duì)黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium、Phanerochaete carnosa、雙孢菇Agaricusbisporus、褐腐菌Postiaplacenta、Ganodermasp.和干朽菌Serpulalacrymans這6 種模式擔(dān)子菌富集的CYP 家族進(jìn)行鑒定和進(jìn)化比較分析，發(fā)現(xiàn)在68 個(gè)CYP 家族中富集了11 個(gè)CYP 家族基因，分別是CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5141、CYP5144、CYP5146、CYP5150、CYP5348 和 CYP5359。CYP 系統(tǒng)發(fā)育分析和基因結(jié)構(gòu)分析顯示，除黃孢原毛平革菌和Phanerochaetecarnosa的CYP 家族外，其余4 個(gè)菌種的CYP 家族均具有種特異性排列，表明CYP 家族在模式擔(dān)子菌中存在副同源進(jìn)化； 在這6 個(gè)真菌基因組中也存在相同基因結(jié)構(gòu)的CYP 序列。此前，Chen 等［32］對(duì)靈芝菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)含有的219 個(gè)CYP 基因中有78 個(gè)CYP基因（包含cyp512 基因15 個(gè)、cyp5144 基因1 個(gè)） 在靈芝菌絲體到原基階段的發(fā)育過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，并在原基階段達(dá)到最高表達(dá)水平，在子實(shí)體階段則下調(diào)表達(dá)，這些CYP基因的表達(dá)與靈芝三萜的含量變化呈正相關(guān)且與羊毛甾醇合酶基因的表達(dá)變化一致，提示這78 個(gè)CYP 基因可能與靈芝三萜的生物合成相關(guān)。Wang［33］、Yang 等［34］在此基礎(chǔ)上利用過(guò)表達(dá)策略和UPLC-MS 等檢測(cè)手段從靈芝菌株中分別鑒定出參與靈芝三萜生物合成的CYP 基因cyp5150l8 和cyp512u6，這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的僅有的2 個(gè)參與靈芝酸生物合成后修飾CYP 基因。此外，Yang 等［34］還克隆了靈芝的NADPH-細(xì)胞色素P450 還原酶（GLCPR），該酶可以協(xié)同cyp512u6 進(jìn)行靈芝三萜的催化反應(yīng)，為體外研究真菌三萜CYP 基因的功能提供了試驗(yàn)參照。另外，通過(guò)比較真菌不同用藥部位或不同菌種培養(yǎng)時(shí)的三萜成分差異，針對(duì)性地尋找與三萜合成相關(guān)基因，近年來(lái)已成為一種新的產(chǎn)物合成基因研究策略。在具有代表性的藥食兩用真菌茯苓中，王維皓［35］采用UHPLC-DAD-FT/MSn技術(shù)對(duì)白茯苓和茯苓皮定性分析，發(fā)現(xiàn)茯苓皮中三萜酸的含量明顯高于白茯苓，尤其是3，4-開環(huán)型三萜酸類化合物，為進(jìn)一步探尋其成分差異的分子機(jī)制，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)初步篩選到56 條可能與3，4-開環(huán)型三萜酸生物合成相關(guān)的CYP450 基因，并預(yù)測(cè)3，4-開環(huán)型三萜酸可能的生物合成途徑。

3 糖基轉(zhuǎn)移酶

真菌三萜結(jié)構(gòu)通過(guò) UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶 （ UDPglycosyltransferase，UGTs） 在羥基和或羧基上的糖基化進(jìn)一步多樣化。UGTs 基因?qū)儆诔蚣易澹鋽?shù)量龐大、底物靈活且具有高度的專一性，能夠利用已活化的糖基供體如UDP-葡萄糖、-半乳糖、-阿拉伯糖、-鼠李糖、-木糖或-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到不同受體分子上，激活或抑制一系列化合物或者調(diào)節(jié)其溶解度，從而參與到生物體的多種調(diào)控和代謝途徑中。與P450 一樣，UGTs 的命名是基于氨基酸序列的同源性，同源性超過(guò)40%歸為同一家族，超過(guò)60%歸為同一亞家族。

近年來(lái)，基于expressed sequence tag （EST） 分析、454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、表達(dá)譜、系統(tǒng)發(fā)育樹等方法，越來(lái)越多來(lái)自細(xì)菌、植物和動(dòng)物的GT 基因被挖掘出來(lái)，但目前從真菌中克隆和表征的UGTs 只有數(shù)個(gè)，如來(lái)自于凍土毛霉菌的MhGT1［36］、來(lái)自Rhizopusjaponicus的UGT58A1［35］和來(lái)自Absidiacoerulea的UGT59A1［37］。郭溆等［38］采用RT-PCR 方法根據(jù)靈芝基因組中1 條可能參與靈芝三萜合成的UGT 基因轉(zhuǎn)錄本（GL2527） 克隆得到了茯苓UGT 基因并將其命名為GLUGT1，基因全長(zhǎng)1 491 bp，編碼含有496 個(gè)氨基酸的多肽，與云芝UGTs 中EIW63452 的相似度較高（50%），其成功克隆和序列分析為進(jìn)一步研究靈芝三萜或其他真菌三萜的代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。

Xie 等［39］利用基因組挖掘和異源表達(dá)技術(shù)相結(jié)合的方法，從Hypocreales真菌中鑒定出4 個(gè)新的糖基轉(zhuǎn)移酶-甲基轉(zhuǎn)移酶（UGT-MT） 功能模塊，這些模塊顯示出良好的底物雜泛性和區(qū)域特異性，能夠?qū)㈩慄S酮、二苯乙烯類、蒽醌類、苯二醇內(nèi)酯等天然產(chǎn)物的甲基葡萄糖基化。有學(xué)者將這些來(lái)源于真菌的底物雜泛性的UGT 應(yīng)用到植物三萜的異源生物合成中，如Zhuang 等［40］通過(guò)利用來(lái)源于釀酒酵母的UGT51 來(lái)異源合成人參三萜，由于微生物中關(guān)鍵的人參糖基轉(zhuǎn)移酶的催化能力低，于是通過(guò)解析UGT51 的晶體結(jié)構(gòu)并進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)，使得UGT51 體外催化原人參二醇底物生成人參皂苷Rh2 產(chǎn)物的效率提高了1 800 倍，將突變的UGT51 基因?qū)氲骄邆湓藚⒍己铣赏緩降尼劸平湍钢羞M(jìn)行真核表達(dá)，可將Rh2 的產(chǎn)量從0.003 2 mg/g 增加到0.39 mg/g 細(xì)胞干重（dry cell weight，DCW）。Dai 等［41］利用一種來(lái)自于枯草芽孢桿菌168 的具有底物雜泛性的UGT酶Bs-YjiC 來(lái)合成人參三萜，分別以原人參三醇、UDP-葡萄糖作為糖基受體和糖基供體進(jìn)行體外催化反應(yīng)，結(jié)果表明Bs-YjiC 能將葡萄糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到原人參三醇的C3、C6 和C12 位的OH 上生成5 種原人參三醇型人參三萜（包括人參三萜Rh1 和4 種非天然的人參三萜）。Zhang 等［42］則利用另一種來(lái)自于枯草芽孢桿菌的具有底物雜泛性的酶UGT109A1在大腸桿菌中異源合成人參三萜，分別以人參三萜Rh1、R1、Re、Rf 及UDP-葡萄糖作為糖基受體和糖基供體進(jìn)行體外催化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UGT109A1 可以將糖基轉(zhuǎn)移到人參皂苷Re 和R1 的C3 位OH 上，也可以將糖基轉(zhuǎn)移到人參皂苷Rf、Rh1 的C3 及C-12 位的OH 上，合成的產(chǎn)物中包括多種非天然的人參皂苷。以上研究揭示了不同來(lái)源的UGT酶在三萜類天然化合物生物合成中的巨大潛力，為利用底物雜泛性的GT 修飾酶進(jìn)行三萜天然產(chǎn)物合成提供了參考。此外，UGT51 亦可催化膽固醇、谷甾醇等甾醇底物的糖基化，為甾醇類化合物的結(jié)構(gòu)多樣化發(fā)揮著重要作用［43］。

除了利用來(lái)自真菌內(nèi)源性UGT 合成其它物種三萜外，也有學(xué)者利用來(lái)自于其它物種的UGT 來(lái)合成真菌內(nèi)源三萜，Wu 等［44］使用4 種芽孢桿菌UGTs，包括來(lái)自蘇云金芽孢桿菌GAA07 菌株的BTGT16345 和來(lái)自枯草芽孢桿菌ATCC6633 菌株的3 種UGTs （BsGT110、BsUGT398 和BsUGT489），對(duì)真菌三萜靈芝酸G （GAG） 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化并合成了2 種新化合物GAG-3-O-β-葡萄糖苷和GAG-26-Oβ-葡萄糖苷。對(duì)于真菌三萜合成途徑中UGTs 基因元件的挖掘及其參與的具體步驟的解析尚處于初步研究階段，通過(guò)設(shè)計(jì)合成路徑、構(gòu)建細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)高效獲取三萜類化合物的方法一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。Wang 等［45］在對(duì)真菌釀酒酵母底盤宿主MVA 途徑及P450 表達(dá)水平優(yōu)化的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列生產(chǎn)人參皂苷Rh2 的細(xì)胞工廠，通過(guò)提高C3-OH 的糖基化效率、增加UGTPg45 的基因拷貝數(shù)、改造UGTPg45 的啟動(dòng)子提高其表達(dá)水平，并挖掘新的糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPg45，建立了一個(gè)迄今為止人參皂苷Rh2 產(chǎn)量最大的酵母細(xì)胞工廠，搖瓶產(chǎn)量達(dá)到179.3 mg/L，10 L 發(fā)酵罐中的產(chǎn)量達(dá)到了2.25 g/L，該研究結(jié)果為酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)稀有天然產(chǎn)物，特別是糖基化產(chǎn)物，提供了成功的范例。

上述研究表明GTs 在三萜結(jié)構(gòu)的糖基化修飾過(guò)程發(fā)揮著重要作用，因此挖掘可作用于不同三萜骨架、合成不同皂苷的GTs 并探索其結(jié)構(gòu)改造、重組表達(dá)、體外催化等相關(guān)研究，將為實(shí)現(xiàn)三萜皂苷類化合物的高效開發(fā)提供重要數(shù)據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

真菌中含有豐富的具有多種生物活性的三萜類化合物，是發(fā)現(xiàn)新穎三萜的重要資源寶庫(kù)。真菌三萜的MVA生物合成途徑從乙酰輔酶A 開始，經(jīng)由3 個(gè)階段，包括IPP 和DMAPP 前體物質(zhì)的形成、三萜皂苷骨架的構(gòu)建及調(diào)控三萜結(jié)構(gòu)多樣性的后修飾過(guò)程，第三階段中參與三萜后修飾催化的CYP450s 和GTs 基因研究報(bào)道依然很少，因此挖掘真菌中可能參與到三萜合成的后修飾酶基因并解析其功能，將有利于實(shí)現(xiàn)真菌三萜的人工生物合成，同時(shí)也為真菌三萜產(chǎn)物合成途徑的解析奠定基礎(chǔ)。目前，可用于尋找、克隆和鑒定真菌三萜生物合成相關(guān)基因的方法已有很多種，如EST 分析可鑒定不同組織中的轉(zhuǎn)錄組和識(shí)別新基因，表達(dá)譜及系統(tǒng)發(fā)育分析可以鑒別候選基因，結(jié)合基因重組表達(dá)、無(wú)細(xì)胞催化及高效分析技術(shù)，可為MVA 途徑關(guān)鍵后修飾酶CYPs、GTs 等基因的挖掘提供重要手段。

本文從真菌三萜MVA 生物合成途徑切入，介紹了后修飾階段的兩大類關(guān)鍵酶CYPs、GTs 及其對(duì)三萜合成的相關(guān)研究，為真菌三萜生物合成途徑的解析、調(diào)控、重構(gòu)提供了理論參考。近年來(lái)，隨著三萜化合物化學(xué)成分、藥效活性的發(fā)現(xiàn)和在生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)三萜類天然活性產(chǎn)物的重視度也在不斷提升，而在真菌三萜在已有的化學(xué)成分、藥理作用等研究基礎(chǔ)上探索三萜合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)、調(diào)控以及在細(xì)胞代謝中的作用，不僅很好地順應(yīng)了這一發(fā)展需求，而且可以進(jìn)一步的促進(jìn)真菌三萜資源庫(kù)的挖掘和三萜MVA 途徑關(guān)鍵酶參與合成具體步驟的闡明。

除三萜外，甾醇為真菌通過(guò)MVA 途徑合成的另一類重要代謝產(chǎn)物，其中麥角甾醇為真菌類的特征甾體化合物，可作為維生素D2 的前體，具有代謝調(diào)節(jié)、調(diào)控激素水平、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤等活性［46］。麥角甾醇合成途徑為一條由多種Erg 蛋白參與、經(jīng)羊毛甾醇節(jié)點(diǎn)的代謝途徑。erg24 基因編碼的甾醇 14α-去甲基酶 （ sterol 14αdemethylase） 催化羊毛甾醇、鈍葉醇等C-14 位的甲基發(fā)生羥基化，屬于CYP51 家族，為一類專門負(fù)責(zé)甾醇氧化的CYP450［47］。由此可見，三萜和甾醇的后修飾過(guò)程也存在一些功能相似的酶發(fā)揮三萜骨架和甾醇骨架結(jié)構(gòu)多樣性的催化作用，對(duì)三萜生物合成途徑關(guān)鍵后修飾酶的挖掘也可為甾醇生物合成途徑的解析提供參考。