范 維，孔維恒，高曉月，董雨馨，李賀楠，郭文萍,*

（1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100000）

隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肉及肉制品逐漸成為人們餐桌上的主角，而其摻假問(wèn)題也成為國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一[1-2]。目前，肉及肉制品摻假的主要形式之一是使用廉價(jià)肉代替或部分摻入到高價(jià)肉中進(jìn)行銷售[3]，這種不法行為不僅給消費(fèi)者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失、干擾肉類行業(yè)有序發(fā)展，更有甚者可引起宗教信仰、食品安全等問(wèn)題[4-5]。馬肉作為一種食用范圍不廣泛的低價(jià)肉，其在色澤、肉質(zhì)等方面與價(jià)格相對(duì)較高的驢肉、牛肉較為相近，尤其是當(dāng)經(jīng)過(guò)深加工制成肉制品后，消費(fèi)者很難通過(guò)肉眼進(jìn)行區(qū)分，這就導(dǎo)致一些用馬肉進(jìn)行蓄意摻假行為的發(fā)生。從歐洲的“馬肉風(fēng)波”[6]到英國(guó)的“掛牛頭賣(mài)馬肉”[7]，再到中國(guó)的“馬肉變驢肉”[8]等層出不窮的肉類摻假事件，揭示了馬肉摻假現(xiàn)象的廣泛存在。近些年，我國(guó)深化改革，大力加強(qiáng)肉及肉制品質(zhì)量安全監(jiān)管和摻假鑒別檢測(cè)技術(shù)支撐能力建設(shè)，并于2021年發(fā)布了《關(guān)于開(kāi)展肉制品質(zhì)量安全提升行動(dòng)的指導(dǎo)意見(jiàn)》，突出強(qiáng)調(diào)了要持續(xù)性地對(duì)肉及肉制品進(jìn)行源性成分摻假鑒別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，并要求通過(guò)發(fā)展新技術(shù)進(jìn)一步提升基層肉種快速鑒別檢測(cè)能力，充分發(fā)揮食品安全快速檢測(cè)初級(jí)“過(guò)濾網(wǎng)”作用。因此，開(kāi)發(fā)出快速、準(zhǔn)確、可在基層推廣使用的動(dòng)物源性成分摻假鑒別技術(shù)將成為檢測(cè)行業(yè)未來(lái)的發(fā)展方向。

目前，國(guó)內(nèi)外主要采用核酸分子生物學(xué)檢測(cè)手段對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒別，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及衍生技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[9]。其中PCR及衍生技術(shù)靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，已經(jīng)成為源性成分鑒定較為常用的方法之一[10]，但其實(shí)驗(yàn)過(guò)程需依靠精準(zhǔn)且昂貴的控溫設(shè)備，有時(shí)后期還要結(jié)合電泳跑膠和條帶測(cè)序，使其成本較高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣，適合在大型專業(yè)性實(shí)驗(yàn)室使用[11]。與PCR及衍生技術(shù)不同，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在恒溫條件下對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，不需要昂貴的溫度循環(huán)控制設(shè)備，且可以與其他微設(shè)備（恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀、橫向流試紙條、微流體芯片等）進(jìn)行偶聯(lián)，在低資源配置條件下實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)[12-13]。常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、重組酶介導(dǎo)鏈置換等溫?cái)U(kuò)增（recombinase aided chain displacement isothermal amplification，RAA）等[14-15]。其中，LAMP技術(shù)較為常用，但4 條引物設(shè)計(jì)難度較大，引物間易發(fā)生交互作用，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；RCA技術(shù)具有特異性強(qiáng)、高通量等特點(diǎn)，但其要求模板為環(huán)狀DNA，若擴(kuò)增線性DNA，需要鎖式探針和連接酶，步驟繁瑣，成本較高；相較之下，RAA技術(shù)僅需要2 條引物，一般在37 ℃至42 ℃等溫條件下反應(yīng)5～20 min即可完成特異性擴(kuò)增，具有反應(yīng)迅速、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[16]，可作為一種有效的肉種快速鑒別方法在監(jiān)管部門(mén)、中小企業(yè)及一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室得到推廣使用。

RAA技術(shù)的擴(kuò)增原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成聚合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白的幫助下，侵入雙鏈DNA模板形成D-loop區(qū)域，并對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)找到與引物互補(bǔ)的目標(biāo)區(qū)域后，聚合體Rec/ssDNA解體，同時(shí)聚合酶結(jié)合到引物的3’末端開(kāi)始鏈的延伸，完成擴(kuò)增過(guò)程[17]。目前，RAA技術(shù)主要應(yīng)用在病毒和致病菌檢測(cè)領(lǐng)域[18-19]，如Mu Dan等[20]建立了脫脂乳、生菜和湖水中大腸埃希氏菌O157:H7的RAA快速檢測(cè)方法；在動(dòng)物源性成分摻假鑒別方面，尤其是針對(duì)馬源性成分鑒別的應(yīng)用研究較少，如Zhou Chi等[21]建立了一種快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鴨源性成分的RAA方法。因此，本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的馬源性成分RAA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，并對(duì)該方法在不同加工工藝（生、煮、烤、風(fēng)干、油炸、高溫高壓滅菌）肉制品中的適用性進(jìn)行評(píng)估，使其可以真正應(yīng)用于市售深加工肉制品的真?zhèn)涡澡b別檢測(cè)中，為監(jiān)管部門(mén)開(kāi)展肉制品摻假鑒別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于對(duì)照或模擬樣品制備的26 種動(dòng)物肉分別購(gòu)自屠宰廠或由北京市食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)三站提供，均為整塊純?nèi)?，包括：馬肉（蒙古馬、伊犁馬、哈薩克馬）、驢肉（德州驢、關(guān)中驢、新疆驢、云南驢）、豬肉、鴨肉、雞肉、山羊肉、綿羊肉、黃牛肉、水牛肉、牦牛肉、狗肉、貓肉、兔子肉、火雞肉、鵝肉、狍子肉、駱駝肉、鼠肉、狐貍?cè)?、鹿肉、鴿子肉。用于市售樣品檢測(cè)的肉及肉制品，分別購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、生產(chǎn)企業(yè)及餐館，包括：驢肉及其制品（生驢肉、驢肉餡、驢肉火燒、醬驢肉、驢肉火腿等）、牛肉及其制品（生牛肉、牛肉片、醬牛肉、牛肉串等）、羊肉及其制品（生羊肉、羊肉片、羊肉串、燜羊肉等）。

動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒（熒光法）安普未來(lái)生物科技有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 北京華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FTC-3000P型實(shí)時(shí)熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司；微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)BioTek公司；3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；DK-80恒溫金屬浴 上海一恒儀器有限公司；ZK系列小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海達(dá)平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

生肉需用清水進(jìn)行簡(jiǎn)單沖洗，清洗掉樣品表面可能沾染的其他源性組織或細(xì)胞；肉制品用清水多次浸泡清洗，盡量去除鹽、糖、色素及油脂等干擾成分。選取樣品瘦肉部分，用清洗干凈的剪刀、高速粉碎機(jī)等將其研磨成肉糜狀。不同源性的樣品使用不同的器具，防止交叉污染。

1.3.2 DNA提取及濃度測(cè)定

按照動(dòng)物基因組試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)0.5 g研磨好的肉糜樣品進(jìn)行DNA提取并測(cè)定其純度。DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，可用于RAA擴(kuò)增。將提取出的樣品和對(duì)照DNA均稀釋成5 ng/μL，作為擴(kuò)增模板，置于-20 ℃冰箱備用。

按以下計(jì)算公式進(jìn)行質(zhì)量濃度和拷貝數(shù)之間的換算[22-23]：

式中：ρ代表馬基因組質(zhì)量濃度/（ng/μL）；DNA length代表馬基因組長(zhǎng)度（2.5×109bp）。

1.3.3 引物、Exo探針設(shè)計(jì)與篩選

1.3.3.1 引物與探針設(shè)計(jì)

參考近年文獻(xiàn)發(fā)表的相關(guān)序列，選擇ATpase 6基因?yàn)榘谢颍瑥腘CBI上查找并下載馬（GenBank：KX377931.1）、驢（GenBank：KT829558.1）、牛（GenBank：DQ347618.1）、羊（GenBank：KY453456.1）的ATpase 6基因序列，使用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出種內(nèi)保守、種間差異性區(qū)域片段，按Twist Dx公司給出的引物探針設(shè)計(jì)指南[24]，使用Primer Express和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2 對(duì)RAA引物和1 條Exo探針。用于RAA擴(kuò)增的引物長(zhǎng)度一般在30～35 bp，GC相對(duì)含量在30%～70%之間，擴(kuò)增片段避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，目標(biāo)序列長(zhǎng)度建議在150～300 bp；探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長(zhǎng)度為46～52 bp，避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有4 個(gè)修飾位點(diǎn)：1）距離5’端30～35 bp中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF））；2）THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)（如熒光染料（fluorescein amidite，F(xiàn)AM））；3）THF位點(diǎn)的下游標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（如BHQ1（black hole quencher 1））；4）3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-spacer。具體序列見(jiàn)表1。之后將設(shè)計(jì)好的引物探針通過(guò)SnapGene軟件檢測(cè)其可行性和特異性。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及Exo探針序列Table 1 Primers and Exo probes used in this study

1.3.3.2 引物的篩選策略

將設(shè)計(jì)出的2 對(duì)RAA引物和1 條Exo探針?lè)謩e進(jìn)行組合，形成4 組引物探針組合（F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro），分別用4 組引物探針進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度和擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間（Ct值）篩選出最優(yōu)引物探針組合。

1.3.4 RAA反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的優(yōu)化

1.3.4.1 Mg2+添加量的優(yōu)化

RAA反應(yīng)體系為50 μL：向預(yù)混有重組酶及聚合酶干粉的反應(yīng)管中加入29.4 μL反應(yīng)緩沖液、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、探針（10 μmol/L）0.6 μL以及2 μL模板DNA，用相應(yīng)ddH2O補(bǔ)至總體積分別為49.5、48.5、47.5、46.5、45.5 μL。充分混勻后，對(duì)應(yīng)的分別將0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL MgAc2溶液（280 mmol/L）加到反應(yīng)管蓋內(nèi)，上下顛倒8～10 次進(jìn)行混勻。瞬時(shí)離心后，按39 ℃，1 min；39 ℃，30 s，30 個(gè)循環(huán)（熒光PCR儀）或39 ℃，1 min；39 ℃，15 min（恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀）的反應(yīng)條件進(jìn)行RAA擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度、擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間（Ct值）以及方法特異性確定最佳反應(yīng)體系。

1.3.4.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

用優(yōu)化出的最佳反應(yīng)體系分別于30、35、37、39、42 ℃條件下進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度、擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間（Ct值）確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.5 RAA方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)

提取3 種目標(biāo)源性和23 種非目標(biāo)源性的DNA，并以此為模板，進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的特異性及包容性。同時(shí)以雙蒸水作為空白對(duì)照。

1.3.6 RAA方法靈敏度實(shí)驗(yàn)

將1.8×104copies/μL的馬源性DNA溶液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，從各梯度的DNA稀釋液中分別取2 μL作為模板加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行RAA擴(kuò)增，各濃度設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。按Ivanov等[16]的方法，以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目標(biāo)DNA檢測(cè)靈敏度Box-plot圖，并進(jìn)行Logistic函數(shù)曲線擬合，以此考察該方法的DNA靈敏度。

1.3.7 RAA方法在不同加工工藝中的適用性及檢出限實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 不同摻入比例混合樣品制備

分別以驢肉、牛肉和羊肉為本源，向其中摻入馬肉，參照Chen Xiaoyu等[25]的方法制備5 個(gè)不同的質(zhì)量比例梯度（0.01%、0.1%、1%、10%、100%）的二元混合樣品（馬/驢、馬/牛、馬/羊）。以馬/驢二元混合樣品制備為例：使用高速破碎機(jī)將預(yù)先研磨好的1 g馬肉糜與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到馬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的混合樣品（編碼為A1）；取1 g A1樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到馬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品（編碼為A2）；取1 g A2樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品（編碼為A3），同樣方法依次制備0.01%混合樣品以及其他源性二元混合樣品。每個(gè)樣品中的兩種肉糜總質(zhì)量為10 g，混合過(guò)程中加入無(wú)毒藍(lán)色染料，混合至顏色均勻（6 min）。各比例混合樣品設(shè)10 個(gè)重復(fù)。

1.3.7.2 不同加工工藝及條件

為了評(píng)估不同加工工藝對(duì)所建立方法適用性的影響，參照Kim等[26]的研究，將1.3.7.1節(jié)制備的不同比例混合樣品進(jìn)行以下5 種處理：1）100 ℃沸水浴中煮15 min；2）180 ℃烤箱中烤10 min；3）65 ℃烘箱中干燥12 h；4）180 ℃食用油中炸10 min；5）121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌15 min。各加工工藝樣品設(shè)10 個(gè)重復(fù)。

1.3.7.3 適用性及檢出限測(cè)定

取經(jīng)不同加工工藝處理后的不同摻入比例的混合樣品各0.5 g，進(jìn)行DNA提取，用于馬源性成分的RAA檢測(cè)方法的建立。根據(jù)≥95%置信水平法則[25]，評(píng)估所建立的RAA方法在不同加工工藝肉制品中的適用性及檢出限，即在10 次平行實(shí)驗(yàn)中，10 次結(jié)果均為檢出的最低目標(biāo)源性摻入量即為該加工工藝條件下目標(biāo)源性的檢出限。

1.3.8 市售樣品檢測(cè)

從不同渠道購(gòu)買(mǎi)肉及肉制品共計(jì)90 份，包括驢肉及其制品30 份（編號(hào)1～30）、牛肉及其制品30 份（編號(hào)31～60）、羊肉及其制品30 份（編號(hào)61～90）。將樣品粉碎研磨至肉糜狀，取0.5 g進(jìn)行DNA提取，之后采用建立的RAA方法對(duì)樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)，同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[27]進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.3.9 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性對(duì)照：有熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤30.0；空白對(duì)照、陰性對(duì)照：無(wú)熒光信號(hào)檢出，相應(yīng)Ct值＞30；樣品判定：熒光通道有熒光信號(hào)檢出，相應(yīng)Ct值≤30.0，判定為陽(yáng)性；熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出，相應(yīng)Ct值＞30.0，判定為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 引物、Exo探針設(shè)計(jì)及篩選結(jié)果

使用Snap Gene 軟件對(duì)馬（Gen Bank ：KX377931.1）、驢（GenBank：KT829558.1）、牛（GenBank：DQ347618.1）、羊（GenBank：KY453456.1）的ATpase 6基因序列進(jìn)行比對(duì)，并將設(shè)計(jì)的引物、探針導(dǎo)入軟件中，對(duì)其可行性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。從馬源性ATpase 6靶基因譜圖（圖1A、B）和不同物種ATpase 6基因序列比對(duì)圖（圖1C）可知，所設(shè)計(jì)的2 對(duì)引物和1 條探針均可以在馬源性的ATpase 6靶基因序列中搜索到，且在引物界定的靶標(biāo)序列區(qū)域內(nèi)，馬源性與其他物種的差異性堿基數(shù)均超過(guò)150 個(gè)（相似度僅為43.1%），屬于位于種間序列差異性區(qū)域內(nèi)[28]。因此，本研究設(shè)計(jì)的引物、探針均可以用于馬源性的特異性擴(kuò)增。進(jìn)一步對(duì)適用于RAA方法的最佳引物、探針組合進(jìn)行篩選，采用4 組引物探針（F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro），分別進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知，不同的引物、探針組合均能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，其中F2/R1/Pro組合特異性擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間最早（Ct值為2.86），且熒光信號(hào)最強(qiáng)。綜上，選擇F2、R1、Pro作為馬源性RAA擴(kuò)增的上、下游引物和探針。

圖1 引物、Exo探針可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of primers and Exo probes

圖2 引物、Exo探針的篩選Fig.2 Screening of primers and Exo probes

2.2 RAA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

為了確定最佳的RAA擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)，本研究對(duì)Mg2+添加量和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)Mg2+添加量?jī)?yōu)化結(jié)果（圖3A）可知，隨著反應(yīng)體系中Mg2+添加量的增加（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL），RAA擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間逐漸提前且熒光信號(hào)顯示出增強(qiáng)的趨勢(shì)，這與吳昊等[29]的研究相似。這主要是由于Mg2+作為聚合酶的輔助因子在整個(gè)RAA擴(kuò)增中起到啟動(dòng)反應(yīng)的作用，并且對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增效率也有至關(guān)重要的影響[22,29]。但隨著進(jìn)一步特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Mg2+添加量較高時(shí)（3.5、4.5 μL），反應(yīng)的特異性會(huì)降低，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，這與Lin Liyun等[22]的研究結(jié)果一致。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇2.5 μL作為Mg2+最佳添加量。從反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果（圖3B）可知，在30～42 ℃擴(kuò)增溫度范圍內(nèi)均可以擴(kuò)增出馬源性特異性目標(biāo)條帶。但當(dāng)擴(kuò)增溫度較低時(shí)（30、35 ℃），不利于酶活性維持，使得擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間較晚；而當(dāng)擴(kuò)增溫度為37、39、42 ℃時(shí)，特異性擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間和熒光信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)明顯差異，這與Lin Liyun[22]、郭燕華[30]等的研究結(jié)果相近。綜上，選擇39 ℃作為馬源性RAA擴(kuò)增反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

圖3 RAA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of RAA reaction conditions

2.3 RAA方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以3 種馬源性和23 種非目標(biāo)源性DNA為模板，進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的方法對(duì)常見(jiàn)的馬品種均可以檢出，且當(dāng)添加的DNA模板初始質(zhì)量濃度為5 ng/μL時(shí)，非目標(biāo)源性（陰性對(duì)照）及空白對(duì)照均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。由此可知，建立的RAA方法對(duì)于馬源性具有較好包容性，且對(duì)非目標(biāo)源性無(wú)交叉反應(yīng)。

圖4 引物、Exo探針特異性分析Fig.4 Specificity analysis of primers and Exo probes

表2 方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of specificity and inclusiveness experiments

2.4 RAA方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以Ct值為縱坐標(biāo)（Y），DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）繪制目標(biāo)DNA檢測(cè)靈敏度Box-plot圖，并進(jìn)行Logistic函數(shù)曲線擬合，結(jié)果如圖5所示。隨著目標(biāo)DNA拷貝數(shù)的增加，RAA擴(kuò)增反應(yīng)Ct值隨之減小，但DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值并非呈嚴(yán)格的線性關(guān)系，這與Ivanov[16]、張雅薇[31]等的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的RAA方法可準(zhǔn)確檢測(cè)到拷貝數(shù)為1.8 copies/μL的馬源性DNA，而當(dāng)模板DNA拷貝數(shù)低于該值時(shí)，仍有擴(kuò)增，但重復(fù)性和準(zhǔn)確性差。

圖5 目標(biāo)源性擴(kuò)增曲線及靈敏度Box-plot圖Fig.5 Amplification curves and sensitivity Box-plot for target animal origin

2.5 不同加工工藝條件下RAA方法適用性及檢出限結(jié)果

通過(guò)對(duì)5 種加工條件（煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌）下處理的不同比例混合肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法在深加工熟肉制品和生肉中的適用性及方法的檢出限。如表3所示，同等摻入比例條件下，經(jīng)過(guò)加工處理的樣品目標(biāo)源性檢測(cè)Ct值相對(duì)高于生肉的Ct值，說(shuō)明深加工工藝會(huì)對(duì)目標(biāo)源性的RAA檢測(cè)造成影響，可能是由于高溫和高壓條件使得DNA發(fā)生降解[26]。此外，通過(guò)不同摻入比例樣品的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)摻入量為0.01%時(shí)，生肉樣品10 次平行實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)源性的檢出次數(shù)可以達(dá)到10 次，滿足不小于95%置信區(qū)間的測(cè)試要求，表明該摻入量可以檢出且重復(fù)性較好；而煮肉、烤肉、干制肉、油炸肉、高溫高壓滅菌肉樣品的檢出次數(shù)均有小于10 次的情況，說(shuō)明該摻入量存在無(wú)法檢出的可能性，若以0.01%摻入量作為熟肉制品的檢出限，會(huì)造成假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。綜上，為了確保使用本方法進(jìn)行肉及肉制品檢測(cè)時(shí)的準(zhǔn)確性，現(xiàn)規(guī)定本方法對(duì)于生肉的檢出限為0.01%，對(duì)于熟肉制品的檢出限為0.1%。該檢出限與Jonas[28]、苗麗[32]等的研究結(jié)果一致，但低于Kumar[24]、吳昊[29]等研究的1%和0.2%。

表3 不同加工工藝下RAA方法適用性及樣品檢出限結(jié)果Table 3 Applicability of RAA and detection limits for samples under different processing techniques

2.6 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)建立的RAA方法與標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)對(duì)90 份市售樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果一致，均有8 個(gè)樣品檢出含有馬源性成分，不合格率為8.9%（8/90）。8 個(gè)不合格樣品中包括6 個(gè)驢肉及其制品和2 個(gè)牛肉制品。其中6 個(gè)不合格驢肉及其制品中有2 個(gè)生驢肉（1 個(gè)生鮮驢肉、1 個(gè)驢肉餡）和4 個(gè)熟肉制品（3 個(gè)驢肉火燒、1 個(gè)醬驢肉）；2 個(gè)不合格牛肉制品均為熟肉制品（醬牛肉）。此外，用所建的RAA方法僅需16 min即可完成對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)，而標(biāo)準(zhǔn)方法則需要大約1 h（94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性34 s，60 ℃退火45 s，40 個(gè)循環(huán)）。綜上可知，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，且所建方法的檢測(cè)時(shí)間僅為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/4，說(shuō)明該方法快速、準(zhǔn)確，可作為一種有效技術(shù)手段用于市售肉及肉制品中馬源性成分的摻假鑒別檢測(cè)。

表4 市售樣品中不合格樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of problem commercial samples

3 結(jié)論

本研究通過(guò)靶基因篩選、目標(biāo)區(qū)域片段比對(duì)、特異性引物探針設(shè)計(jì)以及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化，開(kāi)發(fā)出一種可快速鑒定肉及肉制品中馬源性成分的RAA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。研究采用多拷貝線粒體基因?yàn)榘谢?，克服了單拷貝基因在樣品熱處理溫度越高、摻假比例越低時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果偏差越大的問(wèn)題[33-34]，并充分考慮了不同加工工藝（煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌）對(duì)方法適用性的影響，使得該方法的應(yīng)用范圍從生鮮肉進(jìn)一步擴(kuò)展到了深加工熟肉制品。本方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速，可在39 ℃恒溫條件下16 min內(nèi)完成對(duì)馬源性成分的特異性檢測(cè)，且對(duì)檢測(cè)儀器要求低，適用于熒光PCR儀或成本更低的便攜式恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀，具有較強(qiáng)的基層推廣性和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)實(shí)用性。此外，該方法的靈敏度、特異性和檢出限均可以與現(xiàn)有的PCR方法相媲美，其目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.8 copies/μL水平；與常見(jiàn)的23 種畜禽均無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)生肉的檢出限為0.01%，對(duì)熟肉制品的檢出限為0.1%，滿足目前各標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)馬源性檢出限的要求。用該方法對(duì)90 份市售樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法一致，而用時(shí)僅為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/4。綜上，本研究建立的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)方法可以作為一種有效的檢測(cè)手段，應(yīng)用在生肉及深加工熟肉制品中馬源性成分的真?zhèn)涡澡b別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中，為提升基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力、打擊非法摻假欺詐、規(guī)范市場(chǎng)秩序和保障人民食品安全提供技術(shù)支持。