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        肉制品中馬源性成分重組酶介導(dǎo)鏈置換等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

        2024-03-10 13:12:58孔維恒高曉月董雨馨李賀楠郭文萍
        食品科學(xué) 2024年3期
        關(guān)鍵詞:源性檢出限探針

        范 維,孔維恒,高曉月,董雨馨,李賀楠,郭文萍,*

        (1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心,北京食品科學(xué)研究院,北京 100068;2.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 100000)

        隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,肉及肉制品逐漸成為人們餐桌上的主角,而其摻假問(wèn)題也成為國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一[1-2]。目前,肉及肉制品摻假的主要形式之一是使用廉價(jià)肉代替或部分摻入到高價(jià)肉中進(jìn)行銷售[3],這種不法行為不僅給消費(fèi)者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失、干擾肉類行業(yè)有序發(fā)展,更有甚者可引起宗教信仰、食品安全等問(wèn)題[4-5]。馬肉作為一種食用范圍不廣泛的低價(jià)肉,其在色澤、肉質(zhì)等方面與價(jià)格相對(duì)較高的驢肉、牛肉較為相近,尤其是當(dāng)經(jīng)過(guò)深加工制成肉制品后,消費(fèi)者很難通過(guò)肉眼進(jìn)行區(qū)分,這就導(dǎo)致一些用馬肉進(jìn)行蓄意摻假行為的發(fā)生。從歐洲的“馬肉風(fēng)波”[6]到英國(guó)的“掛牛頭賣(mài)馬肉”[7],再到中國(guó)的“馬肉變驢肉”[8]等層出不窮的肉類摻假事件,揭示了馬肉摻假現(xiàn)象的廣泛存在。近些年,我國(guó)深化改革,大力加強(qiáng)肉及肉制品質(zhì)量安全監(jiān)管和摻假鑒別檢測(cè)技術(shù)支撐能力建設(shè),并于2021年發(fā)布了《關(guān)于開(kāi)展肉制品質(zhì)量安全提升行動(dòng)的指導(dǎo)意見(jiàn)》,突出強(qiáng)調(diào)了要持續(xù)性地對(duì)肉及肉制品進(jìn)行源性成分摻假鑒別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè),并要求通過(guò)發(fā)展新技術(shù)進(jìn)一步提升基層肉種快速鑒別檢測(cè)能力,充分發(fā)揮食品安全快速檢測(cè)初級(jí)“過(guò)濾網(wǎng)”作用。因此,開(kāi)發(fā)出快速、準(zhǔn)確、可在基層推廣使用的動(dòng)物源性成分摻假鑒別技術(shù)將成為檢測(cè)行業(yè)未來(lái)的發(fā)展方向。

        目前,國(guó)內(nèi)外主要采用核酸分子生物學(xué)檢測(cè)手段對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒別,包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)及衍生技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[9]。其中PCR及衍生技術(shù)靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng),已經(jīng)成為源性成分鑒定較為常用的方法之一[10],但其實(shí)驗(yàn)過(guò)程需依靠精準(zhǔn)且昂貴的控溫設(shè)備,有時(shí)后期還要結(jié)合電泳跑膠和條帶測(cè)序,使其成本較高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣,適合在大型專業(yè)性實(shí)驗(yàn)室使用[11]。與PCR及衍生技術(shù)不同,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在恒溫條件下對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增,不需要昂貴的溫度循環(huán)控制設(shè)備,且可以與其他微設(shè)備(恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀、橫向流試紙條、微流體芯片等)進(jìn)行偶聯(lián),在低資源配置條件下實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)[12-13]。常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)、重組酶介導(dǎo)鏈置換等溫?cái)U(kuò)增(recombinase aided chain displacement isothermal amplification,RAA)等[14-15]。其中,LAMP技術(shù)較為常用,但4 條引物設(shè)計(jì)難度較大,引物間易發(fā)生交互作用,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性;RCA技術(shù)具有特異性強(qiáng)、高通量等特點(diǎn),但其要求模板為環(huán)狀DNA,若擴(kuò)增線性DNA,需要鎖式探針和連接酶,步驟繁瑣,成本較高;相較之下,RAA技術(shù)僅需要2 條引物,一般在37 ℃至42 ℃等溫條件下反應(yīng)5~20 min即可完成特異性擴(kuò)增,具有反應(yīng)迅速、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[16],可作為一種有效的肉種快速鑒別方法在監(jiān)管部門(mén)、中小企業(yè)及一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室得到推廣使用。

        RAA技術(shù)的擴(kuò)增原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成聚合體Rec/ssDNA,在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白的幫助下,侵入雙鏈DNA模板形成D-loop區(qū)域,并對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描,當(dāng)找到與引物互補(bǔ)的目標(biāo)區(qū)域后,聚合體Rec/ssDNA解體,同時(shí)聚合酶結(jié)合到引物的3’末端開(kāi)始鏈的延伸,完成擴(kuò)增過(guò)程[17]。目前,RAA技術(shù)主要應(yīng)用在病毒和致病菌檢測(cè)領(lǐng)域[18-19],如Mu Dan等[20]建立了脫脂乳、生菜和湖水中大腸埃希氏菌O157:H7的RAA快速檢測(cè)方法;在動(dòng)物源性成分摻假鑒別方面,尤其是針對(duì)馬源性成分鑒別的應(yīng)用研究較少,如Zhou Chi等[21]建立了一種快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鴨源性成分的RAA方法。因此,本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的馬源性成分RAA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法,并對(duì)該方法在不同加工工藝(生、煮、烤、風(fēng)干、油炸、高溫高壓滅菌)肉制品中的適用性進(jìn)行評(píng)估,使其可以真正應(yīng)用于市售深加工肉制品的真?zhèn)涡澡b別檢測(cè)中,為監(jiān)管部門(mén)開(kāi)展肉制品摻假鑒別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        用于對(duì)照或模擬樣品制備的26 種動(dòng)物肉分別購(gòu)自屠宰廠或由北京市食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)三站提供,均為整塊純?nèi)?,包括:馬肉(蒙古馬、伊犁馬、哈薩克馬)、驢肉(德州驢、關(guān)中驢、新疆驢、云南驢)、豬肉、鴨肉、雞肉、山羊肉、綿羊肉、黃牛肉、水牛肉、牦牛肉、狗肉、貓肉、兔子肉、火雞肉、鵝肉、狍子肉、駱駝肉、鼠肉、狐貍?cè)?、鹿肉、鴿子肉。用于市售樣品檢測(cè)的肉及肉制品,分別購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、生產(chǎn)企業(yè)及餐館,包括:驢肉及其制品(生驢肉、驢肉餡、驢肉火燒、醬驢肉、驢肉火腿等)、牛肉及其制品(生牛肉、牛肉片、醬牛肉、牛肉串等)、羊肉及其制品(生羊肉、羊肉片、羊肉串、燜羊肉等)。

        動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司;RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(熒光法)安普未來(lái)生物科技有限公司;2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司;引物、探針合成 北京華大基因科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        FTC-3000P型實(shí)時(shí)熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司;微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)BioTek公司;3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;DK-80恒溫金屬浴 上海一恒儀器有限公司;ZK系列小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海達(dá)平儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品前處理

        生肉需用清水進(jìn)行簡(jiǎn)單沖洗,清洗掉樣品表面可能沾染的其他源性組織或細(xì)胞;肉制品用清水多次浸泡清洗,盡量去除鹽、糖、色素及油脂等干擾成分。選取樣品瘦肉部分,用清洗干凈的剪刀、高速粉碎機(jī)等將其研磨成肉糜狀。不同源性的樣品使用不同的器具,防止交叉污染。

        1.3.2 DNA提取及濃度測(cè)定

        按照動(dòng)物基因組試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)0.5 g研磨好的肉糜樣品進(jìn)行DNA提取并測(cè)定其純度。DNA的OD260nm/OD280nm在1.8~2.0之間,可用于RAA擴(kuò)增。將提取出的樣品和對(duì)照DNA均稀釋成5 ng/μL,作為擴(kuò)增模板,置于-20 ℃冰箱備用。

        按以下計(jì)算公式進(jìn)行質(zhì)量濃度和拷貝數(shù)之間的換算[22-23]:

        式中:ρ代表馬基因組質(zhì)量濃度/(ng/μL);DNA length代表馬基因組長(zhǎng)度(2.5×109bp)。

        1.3.3 引物、Exo探針設(shè)計(jì)與篩選

        1.3.3.1 引物與探針設(shè)計(jì)

        參考近年文獻(xiàn)發(fā)表的相關(guān)序列,選擇ATpase 6基因?yàn)榘谢颍瑥腘CBI上查找并下載馬(GenBank:KX377931.1)、驢(GenBank:KT829558.1)、牛(GenBank:DQ347618.1)、羊(GenBank:KY453456.1)的ATpase 6基因序列,使用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對(duì),篩選出種內(nèi)保守、種間差異性區(qū)域片段,按Twist Dx公司給出的引物探針設(shè)計(jì)指南[24],使用Primer Express和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2 對(duì)RAA引物和1 條Exo探針。用于RAA擴(kuò)增的引物長(zhǎng)度一般在30~35 bp,GC相對(duì)含量在30%~70%之間,擴(kuò)增片段避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu),目標(biāo)序列長(zhǎng)度建議在150~300 bp;探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊,長(zhǎng)度為46~52 bp,避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有4 個(gè)修飾位點(diǎn):1)距離5’端30~35 bp中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer(四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF));2)THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)(如熒光染料(fluorescein amidite,F(xiàn)AM));3)THF位點(diǎn)的下游標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)(如BHQ1(black hole quencher 1));4)3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán),例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-spacer。具體序列見(jiàn)表1。之后將設(shè)計(jì)好的引物探針通過(guò)SnapGene軟件檢測(cè)其可行性和特異性。

        表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及Exo探針序列Table 1 Primers and Exo probes used in this study

        1.3.3.2 引物的篩選策略

        將設(shè)計(jì)出的2 對(duì)RAA引物和1 條Exo探針?lè)謩e進(jìn)行組合,形成4 組引物探針組合(F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro),分別用4 組引物探針進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增,根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度和擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(Ct值)篩選出最優(yōu)引物探針組合。

        1.3.4 RAA反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的優(yōu)化

        1.3.4.1 Mg2+添加量的優(yōu)化

        RAA反應(yīng)體系為50 μL:向預(yù)混有重組酶及聚合酶干粉的反應(yīng)管中加入29.4 μL反應(yīng)緩沖液、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、探針(10 μmol/L)0.6 μL以及2 μL模板DNA,用相應(yīng)ddH2O補(bǔ)至總體積分別為49.5、48.5、47.5、46.5、45.5 μL。充分混勻后,對(duì)應(yīng)的分別將0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL MgAc2溶液(280 mmol/L)加到反應(yīng)管蓋內(nèi),上下顛倒8~10 次進(jìn)行混勻。瞬時(shí)離心后,按39 ℃,1 min;39 ℃,30 s,30 個(gè)循環(huán)(熒光PCR儀)或39 ℃,1 min;39 ℃,15 min(恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀)的反應(yīng)條件進(jìn)行RAA擴(kuò)增,根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度、擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(Ct值)以及方法特異性確定最佳反應(yīng)體系。

        1.3.4.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

        用優(yōu)化出的最佳反應(yīng)體系分別于30、35、37、39、42 ℃條件下進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增,根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度、擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(Ct值)確定最佳反應(yīng)溫度。

        1.3.5 RAA方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)

        提取3 種目標(biāo)源性和23 種非目標(biāo)源性的DNA,并以此為模板,進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增,驗(yàn)證本方法的特異性及包容性。同時(shí)以雙蒸水作為空白對(duì)照。

        1.3.6 RAA方法靈敏度實(shí)驗(yàn)

        將1.8×104copies/μL的馬源性DNA溶液進(jìn)行10 倍梯度稀釋,從各梯度的DNA稀釋液中分別取2 μL作為模板加入到反應(yīng)體系中,進(jìn)行RAA擴(kuò)增,各濃度設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。按Ivanov等[16]的方法,以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo),繪制目標(biāo)DNA檢測(cè)靈敏度Box-plot圖,并進(jìn)行Logistic函數(shù)曲線擬合,以此考察該方法的DNA靈敏度。

        1.3.7 RAA方法在不同加工工藝中的適用性及檢出限實(shí)驗(yàn)

        1.3.7.1 不同摻入比例混合樣品制備

        分別以驢肉、牛肉和羊肉為本源,向其中摻入馬肉,參照Chen Xiaoyu等[25]的方法制備5 個(gè)不同的質(zhì)量比例梯度(0.01%、0.1%、1%、10%、100%)的二元混合樣品(馬/驢、馬/牛、馬/羊)。以馬/驢二元混合樣品制備為例:使用高速破碎機(jī)將預(yù)先研磨好的1 g馬肉糜與9 g驢肉糜間歇性混合6 min,得到馬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的混合樣品(編碼為A1);取1 g A1樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min,得到馬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品(編碼為A2);取1 g A2樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品(編碼為A3),同樣方法依次制備0.01%混合樣品以及其他源性二元混合樣品。每個(gè)樣品中的兩種肉糜總質(zhì)量為10 g,混合過(guò)程中加入無(wú)毒藍(lán)色染料,混合至顏色均勻(6 min)。各比例混合樣品設(shè)10 個(gè)重復(fù)。

        1.3.7.2 不同加工工藝及條件

        為了評(píng)估不同加工工藝對(duì)所建立方法適用性的影響,參照Kim等[26]的研究,將1.3.7.1節(jié)制備的不同比例混合樣品進(jìn)行以下5 種處理:1)100 ℃沸水浴中煮15 min;2)180 ℃烤箱中烤10 min;3)65 ℃烘箱中干燥12 h;4)180 ℃食用油中炸10 min;5)121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌15 min。各加工工藝樣品設(shè)10 個(gè)重復(fù)。

        1.3.7.3 適用性及檢出限測(cè)定

        取經(jīng)不同加工工藝處理后的不同摻入比例的混合樣品各0.5 g,進(jìn)行DNA提取,用于馬源性成分的RAA檢測(cè)方法的建立。根據(jù)≥95%置信水平法則[25],評(píng)估所建立的RAA方法在不同加工工藝肉制品中的適用性及檢出限,即在10 次平行實(shí)驗(yàn)中,10 次結(jié)果均為檢出的最低目標(biāo)源性摻入量即為該加工工藝條件下目標(biāo)源性的檢出限。

        1.3.8 市售樣品檢測(cè)

        從不同渠道購(gòu)買(mǎi)肉及肉制品共計(jì)90 份,包括驢肉及其制品30 份(編號(hào)1~30)、牛肉及其制品30 份(編號(hào)31~60)、羊肉及其制品30 份(編號(hào)61~90)。將樣品粉碎研磨至肉糜狀,取0.5 g進(jìn)行DNA提取,之后采用建立的RAA方法對(duì)樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè),同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法 第5部分:馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[27]進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

        1.3.9 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

        陽(yáng)性對(duì)照:有熒光信號(hào)檢出,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值≤30.0;空白對(duì)照、陰性對(duì)照:無(wú)熒光信號(hào)檢出,相應(yīng)Ct值>30;樣品判定:熒光通道有熒光信號(hào)檢出,相應(yīng)Ct值≤30.0,判定為陽(yáng)性;熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出,相應(yīng)Ct值>30.0,判定為陰性。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 引物、Exo探針設(shè)計(jì)及篩選結(jié)果

        使用Snap Gene 軟件對(duì)馬(Gen Bank :KX377931.1)、驢(GenBank:KT829558.1)、牛(GenBank:DQ347618.1)、羊(GenBank:KY453456.1)的ATpase 6基因序列進(jìn)行比對(duì),并將設(shè)計(jì)的引物、探針導(dǎo)入軟件中,對(duì)其可行性進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。從馬源性ATpase 6靶基因譜圖(圖1A、B)和不同物種ATpase 6基因序列比對(duì)圖(圖1C)可知,所設(shè)計(jì)的2 對(duì)引物和1 條探針均可以在馬源性的ATpase 6靶基因序列中搜索到,且在引物界定的靶標(biāo)序列區(qū)域內(nèi),馬源性與其他物種的差異性堿基數(shù)均超過(guò)150 個(gè)(相似度僅為43.1%),屬于位于種間序列差異性區(qū)域內(nèi)[28]。因此,本研究設(shè)計(jì)的引物、探針均可以用于馬源性的特異性擴(kuò)增。進(jìn)一步對(duì)適用于RAA方法的最佳引物、探針組合進(jìn)行篩選,采用4 組引物探針(F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro),分別進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知,不同的引物、探針組合均能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,其中F2/R1/Pro組合特異性擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間最早(Ct值為2.86),且熒光信號(hào)最強(qiáng)。綜上,選擇F2、R1、Pro作為馬源性RAA擴(kuò)增的上、下游引物和探針。

        圖1 引物、Exo探針可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of primers and Exo probes

        圖2 引物、Exo探針的篩選Fig.2 Screening of primers and Exo probes

        2.2 RAA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

        為了確定最佳的RAA擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù),本研究對(duì)Mg2+添加量和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)Mg2+添加量?jī)?yōu)化結(jié)果(圖3A)可知,隨著反應(yīng)體系中Mg2+添加量的增加(0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL),RAA擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間逐漸提前且熒光信號(hào)顯示出增強(qiáng)的趨勢(shì),這與吳昊等[29]的研究相似。這主要是由于Mg2+作為聚合酶的輔助因子在整個(gè)RAA擴(kuò)增中起到啟動(dòng)反應(yīng)的作用,并且對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增效率也有至關(guān)重要的影響[22,29]。但隨著進(jìn)一步特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Mg2+添加量較高時(shí)(3.5、4.5 μL),反應(yīng)的特異性會(huì)降低,會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶,這與Lin Liyun等[22]的研究結(jié)果一致。綜上,本實(shí)驗(yàn)選擇2.5 μL作為Mg2+最佳添加量。從反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果(圖3B)可知,在30~42 ℃擴(kuò)增溫度范圍內(nèi)均可以擴(kuò)增出馬源性特異性目標(biāo)條帶。但當(dāng)擴(kuò)增溫度較低時(shí)(30、35 ℃),不利于酶活性維持,使得擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間較晚;而當(dāng)擴(kuò)增溫度為37、39、42 ℃時(shí),特異性擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間和熒光信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)明顯差異,這與Lin Liyun[22]、郭燕華[30]等的研究結(jié)果相近。綜上,選擇39 ℃作為馬源性RAA擴(kuò)增反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

        圖3 RAA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of RAA reaction conditions

        2.3 RAA方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        以3 種馬源性和23 種非目標(biāo)源性DNA為模板,進(jìn)行馬源性RAA擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的方法對(duì)常見(jiàn)的馬品種均可以檢出,且當(dāng)添加的DNA模板初始質(zhì)量濃度為5 ng/μL時(shí),非目標(biāo)源性(陰性對(duì)照)及空白對(duì)照均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。由此可知,建立的RAA方法對(duì)于馬源性具有較好包容性,且對(duì)非目標(biāo)源性無(wú)交叉反應(yīng)。

        圖4 引物、Exo探針特異性分析Fig.4 Specificity analysis of primers and Exo probes

        表2 方法特異性及包容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of specificity and inclusiveness experiments

        2.4 RAA方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        以Ct值為縱坐標(biāo)(Y),DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)繪制目標(biāo)DNA檢測(cè)靈敏度Box-plot圖,并進(jìn)行Logistic函數(shù)曲線擬合,結(jié)果如圖5所示。隨著目標(biāo)DNA拷貝數(shù)的增加,RAA擴(kuò)增反應(yīng)Ct值隨之減小,但DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值并非呈嚴(yán)格的線性關(guān)系,這與Ivanov[16]、張雅薇[31]等的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的RAA方法可準(zhǔn)確檢測(cè)到拷貝數(shù)為1.8 copies/μL的馬源性DNA,而當(dāng)模板DNA拷貝數(shù)低于該值時(shí),仍有擴(kuò)增,但重復(fù)性和準(zhǔn)確性差。

        圖5 目標(biāo)源性擴(kuò)增曲線及靈敏度Box-plot圖Fig.5 Amplification curves and sensitivity Box-plot for target animal origin

        2.5 不同加工工藝條件下RAA方法適用性及檢出限結(jié)果

        通過(guò)對(duì)5 種加工條件(煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌)下處理的不同比例混合肉樣品進(jìn)行檢測(cè),確定該方法在深加工熟肉制品和生肉中的適用性及方法的檢出限。如表3所示,同等摻入比例條件下,經(jīng)過(guò)加工處理的樣品目標(biāo)源性檢測(cè)Ct值相對(duì)高于生肉的Ct值,說(shuō)明深加工工藝會(huì)對(duì)目標(biāo)源性的RAA檢測(cè)造成影響,可能是由于高溫和高壓條件使得DNA發(fā)生降解[26]。此外,通過(guò)不同摻入比例樣品的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)摻入量為0.01%時(shí),生肉樣品10 次平行實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)源性的檢出次數(shù)可以達(dá)到10 次,滿足不小于95%置信區(qū)間的測(cè)試要求,表明該摻入量可以檢出且重復(fù)性較好;而煮肉、烤肉、干制肉、油炸肉、高溫高壓滅菌肉樣品的檢出次數(shù)均有小于10 次的情況,說(shuō)明該摻入量存在無(wú)法檢出的可能性,若以0.01%摻入量作為熟肉制品的檢出限,會(huì)造成假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。綜上,為了確保使用本方法進(jìn)行肉及肉制品檢測(cè)時(shí)的準(zhǔn)確性,現(xiàn)規(guī)定本方法對(duì)于生肉的檢出限為0.01%,對(duì)于熟肉制品的檢出限為0.1%。該檢出限與Jonas[28]、苗麗[32]等的研究結(jié)果一致,但低于Kumar[24]、吳昊[29]等研究的1%和0.2%。

        表3 不同加工工藝下RAA方法適用性及樣品檢出限結(jié)果Table 3 Applicability of RAA and detection limits for samples under different processing techniques

        2.6 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

        采用本實(shí)驗(yàn)建立的RAA方法與標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)對(duì)90 份市售樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表4。本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果一致,均有8 個(gè)樣品檢出含有馬源性成分,不合格率為8.9%(8/90)。8 個(gè)不合格樣品中包括6 個(gè)驢肉及其制品和2 個(gè)牛肉制品。其中6 個(gè)不合格驢肉及其制品中有2 個(gè)生驢肉(1 個(gè)生鮮驢肉、1 個(gè)驢肉餡)和4 個(gè)熟肉制品(3 個(gè)驢肉火燒、1 個(gè)醬驢肉);2 個(gè)不合格牛肉制品均為熟肉制品(醬牛肉)。此外,用所建的RAA方法僅需16 min即可完成對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè),而標(biāo)準(zhǔn)方法則需要大約1 h(94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性34 s,60 ℃退火45 s,40 個(gè)循環(huán))。綜上可知,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致,且所建方法的檢測(cè)時(shí)間僅為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/4,說(shuō)明該方法快速、準(zhǔn)確,可作為一種有效技術(shù)手段用于市售肉及肉制品中馬源性成分的摻假鑒別檢測(cè)。

        表4 市售樣品中不合格樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of problem commercial samples

        3 結(jié)論

        本研究通過(guò)靶基因篩選、目標(biāo)區(qū)域片段比對(duì)、特異性引物探針設(shè)計(jì)以及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化,開(kāi)發(fā)出一種可快速鑒定肉及肉制品中馬源性成分的RAA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。研究采用多拷貝線粒體基因?yàn)榘谢?,克服了單拷貝基因在樣品熱處理溫度越高、摻假比例越低時(shí),其檢測(cè)結(jié)果偏差越大的問(wèn)題[33-34],并充分考慮了不同加工工藝(煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌)對(duì)方法適用性的影響,使得該方法的應(yīng)用范圍從生鮮肉進(jìn)一步擴(kuò)展到了深加工熟肉制品。本方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速,可在39 ℃恒溫條件下16 min內(nèi)完成對(duì)馬源性成分的特異性檢測(cè),且對(duì)檢測(cè)儀器要求低,適用于熒光PCR儀或成本更低的便攜式恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀,具有較強(qiáng)的基層推廣性和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)實(shí)用性。此外,該方法的靈敏度、特異性和檢出限均可以與現(xiàn)有的PCR方法相媲美,其目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.8 copies/μL水平;與常見(jiàn)的23 種畜禽均無(wú)交叉反應(yīng);對(duì)生肉的檢出限為0.01%,對(duì)熟肉制品的檢出限為0.1%,滿足目前各標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)馬源性檢出限的要求。用該方法對(duì)90 份市售樣品進(jìn)行馬源性成分檢測(cè),結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法一致,而用時(shí)僅為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/4。綜上,本研究建立的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)方法可以作為一種有效的檢測(cè)手段,應(yīng)用在生肉及深加工熟肉制品中馬源性成分的真?zhèn)涡澡b別風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中,為提升基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力、打擊非法摻假欺詐、規(guī)范市場(chǎng)秩序和保障人民食品安全提供技術(shù)支持。

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