張玉梅，謝春艷，吳 信,3

（1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；2.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

炎癥是一種抵抗傷害、感染和壓力的先天防御機制，適當?shù)难装Y刺激對宿主而言是有利的，但是炎癥過度則導致組織損傷[1]。腸道作為機體重要的免疫防線，會在炎癥刺激下引起緊密連接屏障的破壞，進而引發(fā)腸道炎癥和疾病的發(fā)生[2-3]。飲食和環(huán)境中的致炎因子是炎癥的重要介質(zhì)，近年來已在疾病的預防和治療中得到普及，目前，在沒有切實有效的方法完全消除飲食或環(huán)境中致炎因子的情況下，通過補充功能性物質(zhì)，如植物多糖緩解腸道屏障損傷造成的影響顯得尤為重要。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌外膜的組成成分，可透過腸壁引發(fā)機體的細菌移位，增加胃腸黏膜上皮緊密連接屏障的通透性，破壞其完整性，使得內(nèi)毒素進入腸內(nèi)，從而引起細胞因子的失控性表達，加劇腸道炎癥[4-5]。體內(nèi)LPS免疫學挑戰(zhàn)模型是目前較為常見的腸黏膜損傷免疫應激模型[6]。研究表明，給小鼠按照0.5 mg/kgmb注射LPS，24 h后即可引起腸黏膜損傷，進而誘導活化細胞表面Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4），激活下游絲裂原活化蛋白激酶/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路，合成釋放炎性細胞因子，加劇腸道損傷，降低細胞增殖，促進細胞凋亡[7-8]。同時，LPS刺激可上調(diào)腸上皮細胞一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達進而產(chǎn)生一氧化氮和活性氧。

滸苔（Enteromorpha prolifera）是一種藥食兼用的藻類植物，滸苔多糖（E.proliferapolysaccharide，EP）是滸苔的關鍵活性成分，其從天然綠藻滸苔粉中經(jīng)酶解提取、純化、濃縮、噴霧干燥而成，主要由鼠李糖、木糖和葡萄糖等組成，具有降血脂、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)的功能[9-13]。研究表明，EP可促進腸道中產(chǎn)乙酸的有益菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）[14-15]、雙歧桿菌（Bifidobacteriumspp.）和乳桿菌（Lactobacillusspp.）的生長[15-16]。Kim等[10]通過小鼠體內(nèi)實驗證實，硫酸化EP可以增加小鼠干擾素-α（interferon α，IFN-α）和白細胞介素（interleukin，IL）-2的分泌，促進細胞增殖，但其預防或緩解腸道炎癥損傷的作用機制還不明確。因此，本實驗旨在探究EP對LPS誘導腸道炎癥的預防或抑制作用，闡明其調(diào)控腸道炎癥損傷的機制，為EP緩解腸道損傷及其在食品行業(yè)的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡C57BL/6J雄性小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004）湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

EP由青島海大生物集團有限公司提供，其多糖質(zhì)量分數(shù)≥90%；小鼠飼料 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

生理鹽水 桂林普蘭德生物科技有限公司；LPS（O55∶B5）美國Sigma公司；4%多聚甲醛 武漢塞維爾生物科技有限公司；血清髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）試劑盒 上海茁彩生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mix 日本TaKaRa公司；RIPA裂解液、磷酸化酶抑制劑、BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TLR4抗體 美國Cell Signaling Technology公司；E.Z.N.A.?DNA試劑盒 美國BioTek公司；DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司；核酸染料 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Wes全自動蛋白表達分析系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司；LightCycler?480II實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀瑞士Roche公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；離心機 德國Eppendorf公司；冰箱 青島海爾股份有限公司；EM UC7切片機 德國Leica公司；光學顯微鏡 德國Zeiss集團。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立

本研究涉及的所有程序和實驗設計均按照《中國科學院實驗動物倫理委員會指南》進行，并經(jīng)中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物保護與利用委員會批準（編號：ISA-2020-18）。所有小鼠飼養(yǎng)于中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物房內(nèi)，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，12 h/12 h晝夜循環(huán)。

C57BL/6J小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為4 組，每組12 只，分別為空白對照（Ctrl）組、LPS組、EP組、EP+LPS組。其中Ctrl和LPS組飼喂基礎日糧，EP和EP+LPS處理組飼喂600 mg/kg EP日糧（每千克基礎日糧中添加600 mg EP）。實驗期間所有小鼠自由采食和飲水。實驗第28天，LPS和EP+LPS組小鼠按0.5 mg/kgmb劑量腹腔注射200 μL LPS（LPS溶解在無菌的生理鹽水中），Ctrl組和EP組小鼠腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

1.3.2 樣品采集與處理

實驗第28天用生理鹽水/LPS處理小鼠24 h后，稱量小鼠體質(zhì)量，眼眶采血于1.5 mL離心管中，靜置4 h，3500 r/min離心10 min，取上清液并于-80 ℃保存，用于血清炎癥因子的分析。解剖后，分離肝臟和脾臟，記錄臟器質(zhì)量，統(tǒng)計臟器指數(shù)（臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量）。分離腸道，截取結(jié)腸中段約5 mm固定于4%多聚甲醛中，用于評定腸壁厚度。另用生理鹽水洗滌除去黏液和消化物后截取結(jié)腸約10 g，迅速放入液氮中，并在-80 ℃保存，用于分子生物學實驗。采集結(jié)腸內(nèi)容物于1.5 mL離心管中，用于測定腸道菌群組成。

1.3.3 血液生化分析

根據(jù)試劑盒說明書測定血清中的MPO和DAO。

1.3.4 腸道形態(tài)學檢測

結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定后，經(jīng)脫水、包埋、切片和蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色處理，利用光學顯微鏡拍照。

1.3.5 相關基因mRNA相對表達量分析

結(jié)腸總RNA提取按照試劑盒說明書進行，之后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成為cDNA。通過使用國家生物技術(shù)信息中心提供的Primer-BLAST設計引物，引物由工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。real-time PCR體系為10 μL：SYBR Green mix 5 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 2.2 μL、cDNA樣品2 μL。反應條件為：1）95 ℃預變性30 s，循環(huán)一次；2）95 ℃變性5 s，循環(huán)40 次；3）60 ℃退火20 s，循環(huán)40 次；4）72 ℃延伸1 min。real-time PCR在Roche LightCycler?480II儀器上進行，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 本研究引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.6 TLR4蛋白相對定量分析

使用含有1%磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液提取結(jié)腸總蛋白，4 ℃、12000×g離心15 min后取上清液，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。采用Wes全自動蛋白表達分析系統(tǒng)定量蛋白，樣品用0.1×sample buffer稀釋，與抗體孵育1 h，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.7 微生物分析

結(jié)腸內(nèi)容物基因組 DNA 使用E.Z.N.A.?DNA 試劑盒提取，用上游引物338 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和反向引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對細菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進行real-time PCR擴增。擴增程序包括：1）95 ℃預變性3 min；2）95 ℃變性30 s，循環(huán)35 次；3）55 ℃退火30 s，循環(huán)35 次；4）72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次；5）最后72 ℃延伸5 min。終產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產(chǎn)物，再采用DNA凝膠提取試劑盒純化，利用Quantus?熒光計進行檢測定量。測序和文庫構(gòu)建在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq平臺進行。使用FLASH對原始測序序列進行拼接，根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，α多樣性以Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)表征，以主成分分析（principal component analysis，PCA）法分析群落組成，此外，分析屬水平上優(yōu)勢菌的相對豐度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析進行顯著性分析，所有結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EP對LPS誘導小鼠臟器指數(shù)的影響

LPS處理24 h后可顯著降低小鼠肝臟質(zhì)量（圖1A，P＜0.05），極顯著升高小鼠脾臟質(zhì)量（圖1 C，P＜0.01）和脾臟指數(shù)（圖1D，P＜0.01）。EP處理4 周后，對LPS誘導的小鼠肝臟損傷和脾臟腫大均沒有顯著影響（P＞0.05）。

圖1 EP對LPS誘導小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.1 Effect of EP on organ indexes of mice induced by LPS

2.2 EP對LPS誘導小鼠血清MPO和DAO的影響

由圖2可知，與Ctrl組相比，LPS處理24 h后未引起血清MPO和DAO含量的升高。EP處理可顯著降低LPS誘導小鼠血清中MPO（圖2A，P＜0.05）和DAO（圖2B，P＜0.01）的活力。

圖2 EP對LPS誘導小鼠血清MPO（A）和DAO（B）活力的影響Fig.2 Effect of EP on serum MPO (A) and DAO (B) activity of mice induced by LPS

2.3 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸形態(tài)的影響

如圖3所示，與Ctrl組相比，經(jīng)LPS處理的小鼠結(jié)腸腸壁厚度變薄，而EP+LPS處理組小鼠的腸壁恢復至與Ctrl組和EP組基本一致。

圖3 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸形態(tài)的影響Fig.3 Effect of EP on colonic histomorphology of mice induced by LPS

2.4 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸TLR4信號通路關鍵基因表達的影響

如圖4所示，與Ctrl組相比，LPS處理24 h后TLR4、MyD88、NF-κB、ERK、TNF-α、IL-1β和iNOS的表達顯著升高。EP處理顯著升高LPS誘導小鼠結(jié)腸IL-1β的表達，顯著降低iNOS的表達（P＜0.05）。

圖4 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸TLR4信號通路關鍵基因表達的影響Fig.4 Effect of EP on the colonic expression of key genes associated with the TLR4 signaling pathway in mice induced by LPS

2.5 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸TLR4蛋白表達的影響

與Ctrl組相比，LPS處理24 h后TLR4的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），EP 處理使其顯著降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 EP對LPS誘導小鼠結(jié)腸TLR4蛋白表達的影響Fig.5 Effect of EP on relative protein expression of TLR4 in the colon of mice induced by LPS

2.6 EP對小鼠腸道微生物豐富度和多樣性的影響

為研究EP對小鼠腸道微生物豐富度和多樣性的影響，采用16S rRNA高通量測序分析結(jié)腸內(nèi)容物，測序結(jié)果如圖6所示。采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)衡量微生物群落的多樣性和豐富度（圖6A～D），由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)指示的微生物群落多樣性中，EP+LPS組Simpson指數(shù)極顯著低于EP組（P＜0.01）。由ACE指數(shù)和Chao指數(shù)指示的微生物群落豐富度中，EP組極顯著低于EP+LPS組（P＜0.01），且EP組Chao指數(shù)極顯著低于Ctrl組（P＜0.01）。為進一步分析微生物的結(jié)構(gòu)組成，進行了OTU水平上的PCA聚類分析（圖6E），結(jié)果表明，LPS處理前后菌群結(jié)構(gòu)顯著區(qū)分，聚成不同類群，EP對微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定影響。

圖6 EP對小鼠腸道微生物α多樣性和β多樣性的影響Fig.6 Effect of EP on α-diversity and β-diversity of intestinal microbiota in mice

2.7 EP對LPS誘導小鼠腸道微生物門水平上物種組成的影響

如圖7 A 所示，通過微生物物種組成豐度分析可得，在門水平上，Bacteroidota、Firmicutes、Campilobacterota、Verrucomicrobiota、Actinobacteria、Desulfobacterota和Proteobacteria為優(yōu)勢菌。與Ctrl組相比，LPS 處理極顯著降低了Firmicutes 的豐度（P＜0.05）；EP 極顯著提高了LPS 誘導小鼠Verrucomicrobiota的豐度（P＜0.01）（圖7B～D）。

圖7 EP對小鼠腸道微生物門水平上物種組成的影響Fig.7 Effect of EP on phylum-level composition of intestinal microbiota in mice

2.8 EP對LPS誘導小鼠腸道微生物屬水平上物種組成的影響

如圖8A所示，通過微生物物種組成豐度分析可得，在屬水平上，norank_f__Muribaculaceae、Lactobacillus、Alloprevotella、Bacteroides和Lachnospiraceae_NK4A136_group為優(yōu)勢菌。利用Kruskal-Wallis秩和檢驗對屬水平排名前15的菌種進行微生物菌群組成的差異性分析（圖8B）。結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，LPS處理顯著提升了Alloprevotella、Bacteroides、unclassified_o__Bacteroidales和Parabacteroides的豐度，極顯著降低了Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度（P＜0.01）。EP處理顯著降低了LPS誘導小鼠Alloprevotella、Bacteroides和unclassified_o__Bacteroidales的豐度（P＜0.05），提高了Lachnospiraceae_NK4A136_group、Anaerostipes和Akkermansia的豐度（P＜0.05）。

圖8 EP對小鼠腸道微生物屬水平上物種組成的影響Fig.8 Effect of EP on genus-level composition of intestinal microbiota in mice

3 討論

LPS刺激可引起許多病理變化，包括引起脾臟和肝臟腫大，破壞腸道黏膜的完整性，增加黏膜的通透性，引起腸道炎癥等[17-18]。植物多糖具有潛在的抗炎活性，可抑制LPS誘導的巨噬細胞分泌炎癥細胞因子[19]。在本研究中，LPS處理24 h可以顯著降低小鼠的體質(zhì)量以及肝臟質(zhì)量，提高小鼠的脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)，而EP處理對LPS誘導引起的肝臟和脾臟指數(shù)變化沒有顯著性影響，說明肝臟和脾臟可能不是炎癥狀態(tài)下EP作用的主要靶向器官。

MPO是一種與炎癥狀態(tài)下組織損傷有關的酶[20]。DAO位于小腸黏膜的上部絨毛中，血清DAO水平可以反映腸道的通透性和完整性[21]。當腸道黏膜被破壞時，MPO和DAO這兩種分子都被釋放到血液中[22]。注射LPS未引起小鼠血清MPO和DAO活性增加，而用EP處理可降低LPS組小鼠血清MPO和DAO的活性，這表明EP可預防炎癥狀態(tài)下的腸道黏膜損傷，維持腸道屏障功能。

NF-κB通過合成和釋放促炎癥細胞因子（TNF-α和IL-1β）在腸道炎癥的發(fā)展中起著關鍵的作用。據(jù)報道，LPS能與TLR4結(jié)合并激活依賴于MyD88的NF-κB途徑，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和iNOS等炎性細胞因子，引起炎癥反應[4,23]，LPS處理的小鼠過度釋放炎癥細胞因子可能是引起慢性炎癥的主要原因之一[17]。本研究中，LPS處理24 h可以上調(diào)結(jié)腸TLR4蛋白的表達，進而促進NF-κB信號通路下游炎癥相關因子TNF-α、IL-1β和iNOS的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，說明LPS處理成功誘導了小鼠的炎癥反應。而在EP處理的LPS組小鼠中，TLR4的蛋白表達和iNOS的基因表達明顯下調(diào)，說明EP通過抑制LPS與TLR4的結(jié)合緩解了LPS誘導的炎癥反應，而IL-1β卻在EP+LPS組小鼠中顯著上調(diào)，可能是由于多糖激活了免疫應答[24]，LPS處理進一步強化了免疫刺激作用所致。

多糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，且能通過增加有益菌的豐富度、抑制有害菌的繁殖達到促進腸道微生態(tài)區(qū)系平衡的作用[15,25-26]。腸道菌群可通過促進代謝物及致病菌成分對腸上皮模式識別受體的刺激，激活信號傳導，調(diào)節(jié)宿主免疫防御和耐受，指導先天性及適應性免疫功能成熟，維持腸道穩(wěn)態(tài)[27]。腸道免疫細胞可以直接或間接地影響腸道菌群，通過免疫反應調(diào)節(jié)腸道菌群組成、多樣性和轉(zhuǎn)移[28]。本研究中觀察到LPS處理小鼠的微生物群落多樣性更低，而群落豐富度更高，說明LPS刺激具有調(diào)節(jié)腸道菌群豐度的作用。Bacteroidota和Firmicutes是門水平上豐度最高的兩個菌群，這與之前的研究[7,15]一致。Bacteroidota以其降解多種復雜碳水化合物的能力而聞名，通過改變相關酶的基因表達和蛋白質(zhì)分泌，快速在固體表面移動，精確感知附近多糖進而降解多糖[29]。研究表明，LPS處理可降低Firmicutes的豐度，F(xiàn)irmicutes的降低與克羅恩病相關[30]。EP不影響LPS刺激小鼠Firmicutes的豐度，說明EP緩解腸道炎癥的作用不是通過改變Firmicutes的組成而起作用。A.muciniphila作為唯一一種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的屬于Verrucomicrobia的潛在益生菌，與炎癥水平呈負相關[31]。文獻報道EP可促進雌性C57BL/6J小鼠腸道中產(chǎn)乙酸的有益菌A.muciniphila、Bifidobacteriumspp.和Lactobacillusspp.的生長[15-16]。本研究表明，在正常生理狀態(tài)下，EP不改變Akkermansia菌的豐度，但LPS刺激后，EP顯著升高Akkermansia的豐度，說明在LPS刺激的炎癥狀態(tài)下，Akkermansia在EP緩解腸道炎癥過程中發(fā)揮重要作用。Anaerostipes是屬于Lachnospiraceae的厭氧菌，可將一些無法被消化的植物多糖在結(jié)腸中發(fā)酵代謝產(chǎn)生丁酸鹽，進而為細胞提供能量，有助于維持細胞的穩(wěn)態(tài)[32]。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激后，EP顯著升高Anaerostipes的豐度，表明其在EP緩解腸道炎癥過程中同樣具有重要作用，由此說明，EP主要通過調(diào)節(jié)Akkermansia及Anaerostipes的豐度緩解炎癥，推測其可能是通過發(fā)酵多糖產(chǎn)乙酸和丁酸鹽，進而與腸上皮模式識別受體結(jié)合，調(diào)節(jié)機體免疫防御。以上結(jié)果表明腸道菌群在EP緩解腸道炎癥的過程中具有重要作用，但具體作用機制還待進一步研究。

4 結(jié)論

EP可以預防LPS刺激引起的腸道屏障功能受損，通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路相關基因的表達和腸道微生物的組成緩解LPS刺激引起的腸道黏膜受損，進而緩解炎癥，調(diào)節(jié)機體的免疫防御。作為一種藥食兼用的藻類植物，滸苔具有廣闊的應用前景，未來課題組將采用糞菌移植，結(jié)合代謝組學等技術(shù)，進一步分析腸道菌群在EP緩解腸道炎癥的過程中發(fā)揮功能的作用機制。