孫詩卓,劉思奇,呂 錚,周 月,張繼旭,蘆小單,,丁亦男

(1.長春師范大學生命科學學院,吉林 長春 130032;2.吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春 130021)

0 引言

中國肺癌的發(fā)病率和死亡率均在惡性腫瘤中居首位,同時肺癌的死亡率在全球癌癥死亡率中也占有較大比例。非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌病例的85%,而肺腺癌(LUAD)是非小細胞肺癌中最常見的類型[1]。近年來,盡管在LUAD的診斷和治療方面取得了一些進展,但是對LUAD患者進行抗癌藥物的特定篩選仍然是一個相對不明確的領域。

分離相互作用蛋白2同源物A(Disconnected interacting protein 2 homolog A,DIP2A)位于人類染色體21q22.3上,屬于DIP2蛋白家族。DIP2A在細胞存活、信號轉導、細胞生長和細胞遷移等多個生物過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。

在腫瘤學研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)DIP2A在多種癌癥中表達水平升高,包括結直腸癌[4]和骨肉瘤[5]。降低DIP2A的表達被發(fā)現(xiàn)能夠促使抗腫瘤免疫的增強,這揭示了DIP2A在腫瘤免疫逃逸中的一定作用[6]。在非小細胞肺癌中,阻斷DIP2A相關通路被證明對患者具有良好的預后[7]。這表明DIP2A在非小細胞肺癌中的抑制可能為患者的治療提供了新的方向。

然而,對于DIP2A在肺腺癌中的詳細機制研究仍然相對有限,特別是抗癌相關藥物與DIP2A表達水平之間的關系。為填補這一研究空白,本研究運用生物信息學方法,通過對肺腺癌中DIP2A表達水平的高低進行篩選,尋找與DIP2A表達量相關的肺腺癌抗癌藥物。

這一研究的結果將有助于揭示DIP2A在肺腺癌中的藥物敏感性,為未來的治療策略提供新的思路。通過深入挖掘肺腺癌與DIP2A之間的關系,我們有望為患者提供更加有效和定制的治療方案,推動肺腺癌的診療取得新進展。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA(The Cancer Genome Atlas)下載肺腺癌(LUAD)的TPM(Transcripts Per Million)標準化的mRNA表達矩陣。其中正常組59個樣本,腫瘤組526個樣本。

1.2 DIP2A在LUAD中的表達分析

對正常組和腫瘤組進行Wilcoxon秩和檢驗,以驗證在這兩組之間是否存在DIP2A基因的表達差異,用ggplot2繪制箱線圖。

1.3 差異表達分析和富集分析

從LUAD-TPM數(shù)據(jù)中去除正常樣本,保留腫瘤樣本。計算DIP2A表達量的五分位數(shù),將DIP2A表達量高于第四分位數(shù)的樣本歸為高表達組(DIP2A-HIGH),DIP2A表達量低于第一分位數(shù)的樣本歸為低表達組(DIP2A-LOW)。隨后,利用R語言中的Wilcoxon秩和檢驗對這兩組樣本進行差異基因分析,篩選差異表達基因(DEGs),篩選條件為:|log2FC|>1且P<0.05,其中FC表示差異倍數(shù),即高表達組與低表達基因表達量的比值。

通過clusterProfiler包對獲得的 DEGs進行基因本體論 (Gene Ontology,GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,篩選條件為:P<0.05。GO富集分析包括分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞成分(CC)三類;KEGG富集分析揭示了主要的信號通路。

1.4 藥物敏感度分析

利用oncoPredict包對去除正常樣本的LUAD-TPM進行藥物敏感度分析,計算得到各個樣本與198種抗癌藥物的半抑制濃度(IC50)。然后,根據(jù)DIP2A的表達量和得到的198種抗癌藥物IC50進行相關性分析。保留相關性系數(shù)低于-0.3且相關性檢驗P值小于0.05的結果(R<-0.30,P<0.05)。最后,借助ggplot2包,繪制散點圖以直觀展示它們的相關性關系。

2 結果

2.1 DIP2A在LUAD中的表達分析

對正常組和腫瘤組進行Wilcoxon秩和檢驗,結果表明,DIP2A在LUAD中高表達,且有顯著性(圖1)。

圖1 DIP2A在正常組與腫瘤組之間的差異表達水平

2.2 差異表達分析和富集分析

對DIP2A-HIGH與DIP2A-LOW進行Wilcoxon秩和檢驗差異分析,篩選出826個差異基因(DEGs),其中813個上調基因,13個下調基因。

對差異表達基因進行GO分析與KEGG分析,如圖2所示。在GO分析中,富集到的通路為翻譯活性的調控和抑制、mRNA 堿基配對翻譯抑制活性、核小體以及核小體裝配、RNA誘導沉默復合體。在KEGG分析中,富集到的通路為miRNAs在癌癥中的發(fā)生。

圖2 GO分析以及KEGG分析富集到的通路

上述富集到的通路均與翻譯過程的調控和miRNAs有關。

2.3 藥物敏感度分析

通過對DIP2A的表達量和198種抗癌藥物的IC50進行相關性分析,篩選出與DIP2A表達水平負相關,具有顯著性(R<-0.30,P<0.05)的藥物。從198種藥物中,得到了11種藥物,它們分別是阿法替尼(Afatinib)、阿培利司(Alpelisib)、PIM抑制劑(AZD1208)、Dot1l的有效選擇性抑制劑(EPZ004777)、林西替尼(Linsitinib)、馬來酰亞胺類似物(MIRA-1)、口服生物的小分子BCL-2抑制劑(Navitoclax)、奈拉濱(Nelarabine)、奧希替尼(Osimertinib)、索拉非尼(Sinularin)以及選擇性的極光激酶抑制劑(ZM447439)(圖3)。

圖3 DIP2A與11種抗癌藥物IC50之間的相關性分析

3 討論

肺腺癌是肺癌的常見類型之一,DIP2A基因的高表達是導致肺腺癌發(fā)生的因素之一,其高表達也是腫瘤異質性的核心。

基于TCGA數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)LUAD中DIP2A的表達量明顯高于正常組,這與多項已發(fā)表研究的結果基本一致[6]。

以DIP2A的五分位數(shù)將腫瘤組分為DIP2A高表達組與低表達組,并進行差異分析,結果顯示有826個差異基因,均為在DIP2A高表達組的差異基因。在這些基因中,引起關注的是MIR499A這一miRNA。2019年的一項研究發(fā)現(xiàn),MIR499A通過mTOR信號通路促進肺腺癌細胞的增殖[8]。

除了MIR499A之外,在分析得到的差異基因中還包括MIR421、MIR6075。其中,MIR421在非小細胞肺癌中的過度表達與患者總生存期較短相關,其過表達可以促進NSCLC細胞的增殖和細胞周期的進展[9];MIR6075在肺癌切除術后的診斷指數(shù)顯著降低[10]。

根據(jù)上述研究結果,DIP2A的高表達可能與上述miRNAs的異常表達相關,而這些miRNAs可能在肺腺癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用。這進一步強調了對這些miRNAs深入研究的重要性,以加深對肺腺癌發(fā)病機制的理解。

在差異分析中,還發(fā)現(xiàn)了一些核仁小核糖核酸(snoRNAs),其中SNORA7B的敲除減少了肺癌細胞的增殖[11],SNORA22則有助于細胞侵襲性和腫瘤的轉移[12]。此外,NSCLC細胞中SNORA80E的敲低可抑制體外和體內(nèi)的致瘤性,肺腫瘤組織標本中SNORA80E的表達與NSCLC患者的生存呈負相關[13],因此,SNORA80E的激活可能在肺腫瘤發(fā)生中發(fā)揮致癌作用,并為惡性腫瘤提供潛在的診斷和治療靶點。

在GO富集分析中,富集到的通路與翻譯的調控和抑制相關,通過Stéphan Vagner等的研究顯示,由于翻譯的能量成本較高,癌細胞在整體水平上會降低翻譯的啟動[14]。這主要通過誘導整合應激反應(ISR)和抑制mTORC1來實現(xiàn),或者通過抑制翻譯的延伸過程來完成。整合應激反應(ISR)是一種復雜的細胞應激響應機制,它在細胞受到各種壓力和刺激時被激活。在癌細胞中,ISR的激活有助于調節(jié)翻譯過程,從而減少能量的浪費,使細胞更好地適應惡劣的環(huán)境[15]。mTORC1是一個關鍵的細胞信號通路,控制蛋白質合成和細胞生長。癌細胞可能通過抑制mTORC1來降低蛋白質合成的速率,從而節(jié)約能量和資源,促使細胞更好地適應癌癥微環(huán)境的壓力。另外,癌細胞也可能通過抑制翻譯的延伸過程來減少蛋白質的合成。這種策略有助于維持細胞內(nèi)的蛋白質平衡,并確保資源的有效利用,從而支持癌細胞的生存和增殖?？傮w而言,癌細胞通過調控翻譯的啟動和延伸過程,以適應惡劣的生存環(huán)境,這為癌癥細胞的生存和增殖提供了一種有效的適應策略[16]。

在KEGG富集分析中,富集到的通路為miRNAs在癌癥中的發(fā)生,miRNAs通過調節(jié)細胞周期、轉移、血管生成、新陳代謝和細胞凋亡,在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[17]。這也驗證了差異基因大多為miRNAs。

藥物敏感度分析結果顯示,有11種抗癌藥物隨DIP2A表達量的增高,IC50下降,這一發(fā)現(xiàn)與前文中我們觀察到的miRNAs和snoRNAs的異常表達可能存在關聯(lián)。miRNAs在肺腺癌的發(fā)展中起到關鍵作用,而snoRNAs與肺癌細胞的增殖、侵襲和轉移等方面相關。因此,DIP2A的高表達可能通過影響miRNAs和snoRNAs的表達,進而影響藥物敏感度。

4 結論

在LUAD-TPM的DIP2A高表達組中,有813個上調的DEGs和13個下調的DEGs,其中大多為非編碼RNA,差異基因的富集通路是與翻譯的抑制與調控以及miRNAs在癌癥中的發(fā)生相關,由此推斷出DIP2A的表達影響翻譯的抑制與調控以及miRNAs的表達。藥物敏感性分析得到11種抗癌藥物,隨DIP2A表達量的增高,IC50下降,這一發(fā)現(xiàn)與非編碼RNA的異常表達可能存在關聯(lián),非編碼RNA與肺癌細胞的增殖、侵襲和轉移等方面相關。DIP2A的異?？赡芡ㄟ^影響非編碼RNA的表達,進而影響藥物敏感度。