陳細紅，蔡偉，虞赟，李敏，王念武，杜振國，沈建國，高芳鑾

福建省茶樹病毒種類鑒定及多重PCR檢測技術的建立

1福建農林大學植物病毒研究所，福州 350002；2福州海關技術中心/福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福州 350001；3榕城海關綜合技術服務中心，福建福清 350300

【目的】明確福建省茶樹主要病毒種類和分布情況，并建立同時快速檢測多種病毒的多重PCR檢測技術。【方法】2019—2023年，從福建省福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個地市區(qū)采集具有褪綠、皺縮和壞死等疑似病毒感染癥狀的茶樹樣品1 869份，采用高通量測序技術結合PCR和RT-PCR檢測的方法對茶樹病毒病的病原進行鑒定，并將PCR擴增獲得的特異性目的片段進行克隆和測序，對獲得的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析；同時，根據GenBank上已報道的病毒序列設計特異性引物，通過退火溫度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等反應條件和反應程序的優(yōu)化，建立同時檢測福建茶樹主要病毒的多重PCR檢測技術，并測定該技術的特異性、靈敏度及實際應用效果。【結果】從所采集的茶樹病樣上檢出3種病毒，按檢出率從高到低依次為油茶雙生病毒（oil tea associated geminivirus，OTaGV）（48.90%）、茶樹壞死環(huán)斑病毒（tea plant necrotic ring blotch virus，TPNRBV）（26.75%）和茶樹潛隱病毒1（camellia cryptic virus 1，CCV1）（17.98%）；在檢出病毒的1 258份樣品中，有807份為OTaGV、TPNRBV或CCV1單獨侵染，檢出率分別為37.20%、21.38%和5.56%；其余451份樣品為2種或3種病毒復合侵染，復合侵染檢出率達35.85%，OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4種類型復合侵染檢出率分別為17.49%、0.40%、14.71%、3.26%。在地理分布上，OTaGV在福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個地區(qū)均有分布，其中漳州OTaGV檢出率最高，為96.77%；CCV1在福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明、莆田和龍巖8個地區(qū)均有分布，其中三明CCV1檢出率最高，為66.00%；TPNRBV在福州、南平、寧德、泉州和漳州5個地區(qū)均有分布，其中泉州TPNRBV檢出率最高，為79.13%；在福建省9個地區(qū)中，廈門地區(qū)僅檢出OTaGV，三明、莆田和龍巖地區(qū)檢出OTaGV和CCV1，其他5個地區(qū)同時檢出OTaGV、TPNRBV和CCV1；福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明、莆田7個地區(qū)檢測到病毒復合侵染，其中漳州地區(qū)病毒復合侵染檢出率最高（85.00%）、寧德地區(qū)病毒復合侵染檢出率最低（23.03%）。利用測定的CCV1和TPNRBV部分基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明本研究獲得的CCV1分離物（FW）與已報道的福建分離物FJ-SH104（GenBank登錄號：ON807095）親緣關系最近、TPNRBV分離物（FU）與福建分離物QZHA92（GenBank登錄號：OQ948454）親緣關系最近。經優(yōu)化建立的多重PCR檢測技術特異性強，僅OTaGV、TPNRBV和CCV1能擴增出特異性目的片段，而其他病毒及健康茶樹樣品上均未擴增出特異性目的片段；多重PCR靈敏度最低可以檢測到稀釋至10-4倍的OTaGV、TPNRBV和10-3倍的CCV1；利用該多重PCR檢測技術對茶園中采集的60份病樣進行檢測，檢測結果與單一PCR檢測結果完全相符?！窘Y論】OTaGV、TPNRBV和CCV1是當前福建茶樹上主要病毒種類，其中OTaGV為福建地區(qū)首次報道，該病毒可侵染茶樹也為首次發(fā)現(xiàn)；在檢出的3種病毒中，以OTaGV發(fā)生分布范圍最廣，其次為CCV1、TPNRBV；福建地區(qū)茶樹病毒目前仍以單獨侵染為主，但同時存在較多的復合侵染，復合侵染類型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+CCV1+TPNRBV；建立的多重PCR檢測技術特異性強、靈敏度高，可用于茶園茶樹上OTaGV、CCV1和TPNRBV 3種病毒的快速檢測。研究結果可為福建茶樹病毒病的綜合防控提供理論依據和技術支持。

茶樹病毒；病原鑒定；多重PCR；分子檢測；福建省

0 引言

【研究意義】茶樹（）是山茶科（Theaceae）山茶屬（）的一種具有重要經濟價值的多年生木本植物[1-2]，主要分布于亞洲、非洲和南美洲等溫暖濕潤的熱帶和亞熱帶地區(qū)[3]。茶是世界上最受歡迎的飲料之一，其富含礦物元素、糖、氨基酸等營養(yǎng)物質[4-5]。此外，茶葉因富含兒茶素等次級代謝物而具有抗菌、抗氧化、消炎鎮(zhèn)靜等藥用功效，不僅有益人體健康，還能保護作物植株免受生物或非生物因素的損害[3]。我國是世界上最大的茶葉生產國和消費國，國內茶樹種植主要分布在南部20多個省[6]。其中，福建是我國重要的產茶大省，2020年福建茶園面積為22.93萬公頃，茶產量46.14萬噸，綜合產值達1 300億元。隨著茶樹種植規(guī)模的不斷擴大，茶樹上病蟲害的發(fā)生和危害也逐漸增多，給茶葉的產量和品質造成了不同程度的影響。據報道，茶樹上已知的病蟲害主要為真菌性病害，少數(shù)為細菌、昆蟲和線蟲危害[7]。病毒病是近年來茶樹上新報道的一種病害[8]，為防止病毒病的進一步擴散和蔓延，加強茶樹病毒種類、分布及快速檢測技術研究具有十分重要的現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】茶樹病毒病癥狀主要表現(xiàn)為葉片褪綠、斑駁、花葉、卷曲、壞死和環(huán)斑等，嚴重時植株死亡[8-14]。作為茶樹上的新病害，國內外關于茶樹病毒病的研究報道較少。HAO等[8]以我國浙江省茶園采集的茶樹病葉為材料，采用高通量測序方法發(fā)現(xiàn)了兩種新病毒，即茶樹壞死環(huán)斑病毒（tea plant necrotic ring blotch virus，TPNRBV）和茶樹網斑病毒（tea plant line pattern virus，TPLPV），并測定了全基因組序列，建立了用于兩種病毒快速檢測的普通RT-PCR技術。JO等[9]通過對茶樹轉錄組數(shù)據的分析，發(fā)現(xiàn)了一種與油茶（）上油茶潛隱病毒1（camellia oleifera cryptic virus 1，CoCV1）具有序列同源性的病毒，將其命名為茶樹潛隱病毒1（camellia cryptic virus 1，CCV1）。筆者前期采用RT-PCR方法從福建茶樹上檢測到CCV1，并測定了該病毒的全基因組序列，分析了其序列特征和分子進化關系[10]。Nazerian等[11]在伊朗首次報道了TPNRBV，隨后Maruyama等[12]報道了TPNRBV日本分離物（TPNRBV-J）的全基因組序列。Ren等[13]建立了檢測TPNRBV 4個RNA片段的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法，并利用該方法研究了TPNRBV在茶樹不同部位的分布和傳播特性。Xie等[14]采用ELISA和RT-PCR技術，從我國山東泰安茶樹上檢測發(fā)現(xiàn)了葡萄卷葉伴隨病毒7號（grapevine leafroll-associated virus 7，GLRaV-7），該病毒是國內外茶樹上的首次報道。WANG等[15]在安徽茶樹上發(fā)現(xiàn)了一種新的桿狀病毒——茶樹桿狀病毒1（camellia sinensis badnavirus 1，CSBV1），報道了該病毒的全基因組序列?！颈狙芯壳腥朦c】茶樹是福建省重要的經濟作物，茶產業(yè)已被列為福建九大支柱產業(yè)之一。然而，由病毒引起的茶樹病毒病有進一步擴散和蔓延的趨勢，并可能成為制約茶葉安全生產的主要因素之一。為保護福建省茶樹生產安全、促進茶產業(yè)可持續(xù)發(fā)展，生產上亟需加強茶樹病毒病的預防與控制。然而，針對茶樹病毒病，目前福建地區(qū)缺乏系統(tǒng)全面的研究，病毒發(fā)生的種類、分布、侵染類型等尚不明確，關于茶樹病毒分子快速檢測鑒定技術研究的報道也較少?！緮M解決的關鍵問題】系統(tǒng)調查福建省茶樹病毒病的發(fā)生和危害情況，通過高通量測序、PCR和RT-PCR檢測各地區(qū)采集的疑似病樣，明確福建省茶樹病毒的主要種類、分布特征及侵染類型，并建立用于茶樹病毒快速檢測的多重PCR檢測技術，以期為福建省茶樹病毒病的早期預警與防控提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

試驗于2019—2023年在福建農林大學植物病毒研究所和福州海關技術中心完成。

1.1 材料

2019年1月至2023年3月，在福建省福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個茶樹主要種植區(qū)采集具有疑似病毒感染癥狀（褪綠、斑駁、花葉、卷曲、壞死和環(huán)斑等）病株樣品1 869份，其中福州414份、南平328份、寧德153份、泉州345份、漳州62份、廈門65份、三明50份、莆田81份、龍巖371份。樣品采集后液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Random Hexamer Primer購自Thermo Fisher Scientific（中國）有限公司；RNasin Plus RNase Inhibitor（40 U·μL-1）、M-MLV RT 5×Buffer、M-MLV Reverse Transcriptase（200 U·μL-1）、dNTP Mix（10 mmol·L-1）、Go Taq Green Master Mix（2×）購自美國Promega公司；DL 1000 DNA Marker購自寶生物（大連）有限公司產品；HiScriptⅡOne Step RT-PCR Kit（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T5 Zero載體、Trans-T1感受態(tài)細胞載體購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 高通量測序

選取具有褪綠、斑駁、花葉、卷曲、壞死和環(huán)斑等典型癥狀的茶樹病株進行高通量測序，測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 引物設計

根據高通量測序結果及GenBank上已報道的病毒序列設計特異性引物（表1），用于后續(xù)PCR/RT-PCR對采集的茶樹葉片進行病毒檢測和驗證，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 福建茶樹病毒檢測所用引物

F：上游引物Forward primer；R：下游引物Reverse primer；Mtr-Hel：甲基化轉移酶-解旋酶Methyltransferase-helicase；NSP：核穿梭蛋白nuclear shuttle protein

1.4 總核酸提取和反轉錄

稱取茶樹葉片100 mg，采用CTAB法[20]提取總核酸，總核酸-80 ℃保存?zhèn)溆谩NA病毒檢測直接以總核酸為模板，RNA病毒檢測以總核酸反轉錄合成的cDNA為模板。反轉錄反應體系（20 μL）：在PCR管中加入7 μL ddH2O、1 μL Random Hexamer Primer（0.2 μg·μL-1）、3 μL模板，72 ℃ 10 min，冰上5 min，瞬時離心；再加入以下試劑：5 μL M-MLV RT 5× Buffer、2 μL dNTP Mix（10 mmol·L-1）、1 μL RNasin Plus RNase Inhibitor（40 U·μL-1）、1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（200 U·μL-1），42 ℃1 h，72 ℃ 10 min合成cDNA。

1.5 PCR擴增及克隆測序

PCR擴增反應體系（25 μL）：病毒上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，12.5 μL 2×Go Taq Green Master Mix，2 μL模板，8.5 μL ddH2O。PCR擴增反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、X ℃（各病毒具體退火溫度見表1）45 s、72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72 ℃延伸10 min。目的片段經EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收后，連接到pEASY-T5 Zero載體，連接產物轉化Trans-T1感受態(tài)細胞中，然后涂布含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，篩選陽性克隆，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹重建

序列測定的結果采用NCBI中的BLAST程序進行一致性分析。從GenBank中已報道的各病毒基因序列中，分別選取代表性基因序列作為參考序列，采用MEGAX[21]文獻軟件MUSCLE算法[22]對核苷酸序列進行多重比對后，通過IQ-tree軟件[23]應用最大似然法（maximum likelihood，ML）重建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用ModelFinder[24]分析確定CCV1和TPNRBV數(shù)據集最適的核苷酸替代模型分別K80+I和HKY+F，并基于BIC標準設置相關參數(shù)，發(fā)育樹中各分支節(jié)點的可靠性通過超快自舉法（Ultrafast bootstrap）10 000次重復抽樣進行評估。

1.7 多重PCR建立及優(yōu)化

根據GenBank上已報道的OTaGV序列，設計1對特異性引物OTV-F1/OTV-R1（F1：5′-TAGGAGAC GCATTGTGGCAGAAG-3′，R1：5′-GTTAGTCTTGCC TTCGATGCTGC-3′，預期擴增目的片段大小為446 bp），與1.3中TPNRBV、CCV1的引物對組成多重PCR引物組，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。建立多重PCR檢測方法，PCR擴增反應體系（20 μL）：病毒上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，10 μL 2×One Step Mix（Dye Plus），1 μL One Step Enzyme Mix，2 μL模板，2.2 μL ddH2O。PCR擴增反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72 ℃延伸7 min。在建立的多重PCR檢測方法基礎上，分別對退火溫度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等反應體系和反應程序進行優(yōu)化。退火溫度分別設53、55、57、59和61 ℃ 5個處理，引物濃度分別設0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol·L-15個處理，循環(huán)數(shù)分別設25、30、35和40 4個處理。在不同處理下分別進行多重PCR，確定多重PCR的最佳反應體系和反應程序。

1.8 多重PCR特異性、靈敏度測定

根據建立的多重PCR的反應體系和反應程序，對OTaGV、CCV1、TPNRBV及3種病毒不同復合侵染類型的茶樹樣品進行多重PCR擴增，以健康茶樹樣品為陰性對照，測定多重PCR特異性；將CCV1、TPNRBV和OTaGV陽性樣品提取的總核酸等量混合后按10倍梯度稀釋，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍后作為模板進行多重PCR擴增，以健康茶樹樣品為陰性對照，測定多重PCR靈敏度，并與單一PCR進行比較。

1.9 多重PCR實際應用

以茶園采集的60份病樣為檢測對象，應用建立的多重PCR檢測技術進行病毒檢測，同時用單一PCR進行驗證，評價該技術的實際檢測效果。

2 結果

2.1 福建省茶樹病毒病的田間癥狀

在福建省茶樹病毒病的調查中發(fā)現(xiàn)，福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個地區(qū)的茶樹田間癥狀主要表現(xiàn)為葉片褪綠、斑駁、花葉、卷曲、壞死和環(huán)斑等多種類型（圖1），其中以褪綠、花葉、壞死和環(huán)斑較為普遍。在同一棵茶樹病株上，有時會出現(xiàn)多種癥狀。

A：褪綠、斑駁Chlorosis, mottle；B：壞死、環(huán)斑Necrosis, ringspots；C：皺縮、泡斑Crinkle, blotch；D：卷曲Curl

圖1 茶樹病毒病主要癥狀

Fig. 1 Main symptoms caused by tea plant viruses

2.2 高通量測序結果及PCR/RT-PCR驗證

茶樹病株高通量測序后共獲得75 922 118 raw reads（讀長），通過質量控制后進行序列拼接組裝，得到592 335個contigs（重疊群）。經BLAST比對和注釋分析，發(fā)現(xiàn)與植物病毒及類病毒相關的contigs中，與3種已報道能夠侵染山茶屬植物的病毒（OTaGV、CCV1和TPNRBV）核苷酸序列一致性較高，為94.9%—100%。根據高通量測序結果和GenBank上已報道的3種病毒基因組序列設計特異性引物，進行PCR/RT-PCR驗證。驗證結果表明，僅OTaGV、CCV1和TPNRBV分別擴增出預期大小的目的片段，而其余病毒均未擴增出目的片段（圖2）。將PCR產物進行克隆測序和BLAST比對，結果顯示OTaGV、CCV1和TPNRBV目的片段核苷酸序列分別與GenBank已報道的OTaGV江西分離物（GenBank登錄號：MN161582）、CCV1福建分離物（GenBank登錄號：ON807098）和TPNRBV日本分離物（GenBank登錄號：LC566239）核苷酸序列一致性為91.6%、100%和95.5%，進一步證實福建茶樹樣品中存在OTaGV、CCV1和TPNRBV侵染。

2.3 福建茶樹病樣的病毒檢測

針對高通量測序發(fā)現(xiàn)的3種病毒（OTaGV、CCV1、TPNRBV）以及茶樹上已報道的TPLPV、GLRaV-7，采用PCR、RT-PCR對采集的1 869份樣品進行檢測。結果表明，利用OTaGV、CCV1、TPNRBV特異性引物能夠擴增到與預期大小相近的738、707和315 bp目的片段（圖3），而TPLPV、GLRaV-7特異性引物未擴增到任何特異性目的片段。福建茶樹病樣的病毒檢測結果表明（表2），1 869份樣品中檢出病毒的有1 258份，病毒檢出率為67.31%；檢出的病毒種類有3種，分別為OTaGV、CCV1和TPNRBV，檢出率分別為48.90%、17.98%和26.75%，其中以OTaGV檢出率最高；OTaGV在福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個地區(qū)均有分布，其中漳州地區(qū)OTaGV檢出率最高，為96.77%；CCV1在福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明、莆田和龍巖8個地區(qū)均有分布，其中三明地區(qū)CCV1檢出率最高，為66.00%；TPNRBV在福州、南平、寧德、泉州和漳州5個地區(qū)均有分布，其中泉州地區(qū)TPNRBV檢出率最高，為79.13%；在福建省9個地區(qū)中，廈門地區(qū)僅檢出OTaGV，三明、莆田和龍巖地區(qū)檢出OTaGV、CCV1，其他5個地區(qū)同時檢出OTaGV、CCV1和TPNRBV。

M：DNA分子量標準DNA Marker (DL 1000)；1：OTaGV；2：OTaGV檢測的陰性對照Negative control for OTaGV；3：CCV1；4：CCV1檢測的陰性對照Negative control for CCV1；5：TPNRBV；6：TPNRBV檢測的陰性對照Negative control for TPNRBV

圖2 3種茶樹病毒PCR/RT-PCR擴增結果

Fig. 2 PCR/RT-PCR amplification results of three types of tea plant viruses

M：DNA分子量標準DNA Marker (DL 1000)；1—14：茶樹樣品Tea plant sample；15：陰性對照Negative control

圖3 福建茶樹部分病樣OTaGV、CCV1和TPNRBV檢測結果

Fig. 3 The detection results of OTaGV, CCV1 and TPNRBV in some susceptible samples of tea plant from Fujian Province

病毒侵染情況分析結果顯示（表3），在檢出病毒陽性的1 258份茶樹病樣中，有807份樣品為單一病毒侵染，TPNRBV、OTaGV、CCV1單獨侵染率分別為21.38%、37.20%和5.56%；其余451份樣品為2種或3種病毒復合侵染，復合侵染率達35.85%，OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4種類型復合侵染檢出率分別為17.49%、0.40%、14.71%和3.26%。在福建省9個地區(qū)中，福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明和莆田7個地區(qū)檢測到病毒復合侵染，其中漳州地區(qū)病毒復合侵染檢出率最高，為85.00%，寧德地區(qū)病毒復合侵染檢出率最低，為23.03%。

表2 福建各地區(qū)茶樹病毒檢測結果

表3 福建各地區(qū)茶樹病毒單獨侵染和復合侵染情況

2.4 CCV1和TPNRBV分離物的系統(tǒng)發(fā)育分析

選取CCV1、TPNRBV單獨侵染的茶樹樣品，RT-PCR檢測獲得的CCV1、TPNRBV產物分別進行克隆測序，所測目的片段核苷酸序列提交NCBI，GenBank登錄號分別為OR282452、OR282451。BLAST比對結果表明，本研究獲得的CCV1分離物與CCV1福建分離物FJ_SH90、FJ_SH79、FJ_SH63（GenBank登錄號：ON807096—ON807098）以及韓國分離物Won（GenBank登錄號：MH898484）RNA3的一致性最高（均為99.72%），與其他分離物RNA3的核苷酸序列一致性為96.46%—99.58%；本研究獲得的TPNRBV分離物與GenBank已報道的TPNRBV分離物核苷酸序列一致性為95.24%—96.54%，其中與日本分離物J（GenBank登錄號：LC566239）一致性最高（96.5%）。為進一步明確本研究獲得的CCV1、TPNRBV分離物與GenBank中已報道其他分離物的進化關系，選取CCV1、TPNRBV其他不同地區(qū)代表性分離物，采用ML法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結果顯示本研究獲得的CCV1分離物與已報道的福建分離物FJ-SH104（GenBank登錄號：ON807095）親緣關系最近、TPNRBV分離物與福建分離物QZHA92（GenBank登錄號：OQ948454）親緣關系最近。

分支節(jié)點上的數(shù)值為超快自舉值（＞75%），黑色圓點顯示的為本研究獲得的病毒分離物Numbers above branches on the left indicated Ultrafast bootstrap values (only shown＞75%). The viral isolates from current study were marked with black solid circle

圖4 基于最大似然重建的CCV1和TPNRBV系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig. 4 Phylogenetic tree of CCV1 and TPNRBV based on maximum likelihood (ML) algorithm

2.5 多重PCR的優(yōu)化

在單一PCR基礎上，通過固定單一變量，對多重PCR反應條件和程序進行優(yōu)化，結果表明退火溫度為57 ℃時，3個病毒的目的片段條帶最為清晰、亮度相近（圖5-A）；引物濃度各為0.3 μmol·L-1時，3個病毒的目的片段條帶最亮，且亮度均一（圖5-B）；循環(huán)數(shù)為35以下時，3個病毒的目的片段條帶亮度不一致，當循環(huán)數(shù)達到35、40時，各病毒目的片段條帶均較明亮（圖5-C）。經綜合考慮，確定多重PCR最佳反應體系為總體積20 μL：病毒上下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，10 μL 2×One Step Mix（Dye Plus），1 μL One Step Enzyme Mix，1 μL模板，4.4 μL ddH2O。反應程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72 ℃延伸7 min。

2.6 多重PCR的特異性

利用優(yōu)化建立的多重PCR檢測技術對OTaGV、CCV1、TPNRBV 3種病毒不同侵染類型的茶樹樣品進行檢測，僅從OTaGV、CCV1、TPNRBV 3種病毒復合侵染樣品上同時擴增到大小約446、707和315 bp特異性目的片段，從OTaGV、TPNRBV復合侵染樣品上同時擴增到大小約446和315 bp特異性目的片段，從CCV1、TPNRBV復合侵染樣品上同時擴增到大小約707、315 bp特異性目的片段，從OTaGV、CCV1復合侵染樣品上同時擴增到大小約446和707 bp特異性目的片段，從OTaGV、CCV1、TPNRBV單獨侵染樣品上分別僅擴增到大小約446、707和315 bp特異性目的片段，而從健康茶樹樣品上未擴增到特異性目的片段（圖5-D），表明建立的多重PCR具有較強的特異性。

M：DNA分子量標準DNA Marker (DL1000)。A：多重PCR退火溫度優(yōu)化結果Optimization results of annealing temperature for multiplex PCR；1—5：53、55、57、59、61 ℃；6：陰性對照Negative control。B：多重PCR引物濃度優(yōu)化結果Optimization results of primer concentration for multiplex PCR；1—5：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1；6：陰性對照Negative control。C：多重PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化結果Optimization results of cycle for multiplex PCR；1—4：25、30、35和40個循環(huán)25, 30, 35 and 40 cycles, respectively；5：陰性對照Negative control。D：多重PCR特異性Specificity of multiplex PCR；1：OTaGV、CCV1、TPNRBV復合侵染樣品Sample co-infected by OTaGV, CCV1 and TPNRBV；2：OTaGV、TPNRBV復合侵染樣品Sample co-infected by OTaGV and TPNRBV；3：CCV1、TPNRBV復合侵染樣品Sample co-infected by CCV1 and TPNRBV；4：OTaGV、CCV1復合侵染樣品Sample co-infected by OTaGV and CCV1；5：TPNRBV單獨侵染樣品Sample infected by TPNRBV；6：OTaGV單獨侵染樣品Sample infected by OTaGV；7：CCV1單獨侵染樣品Sample infected by CCV1；8：陰性對照Negative control

圖5 多重PCR優(yōu)化和特異性結果

Fig. 5 Optimization and specificity results of multiplex PCR

2.7 多重PCR的靈敏度

將OTaGV、CCV1、TPNRBV 3種病毒陽性樣品提取的總核酸等量混合后按10倍梯度稀釋后分別進行多重PCR和單一PCR檢測。結果發(fā)現(xiàn)多重PCR最低能同時檢測到稀釋至10-4倍OTaGV、TPNRBV和10-3倍CCV1（圖6-A），單一PCR最低均能檢測稀釋至10-4倍OTaGV、CCV1和TPNRBV（圖6-B—D）。與多重PCR相比，單一PCR靈敏度略高，且在相同稀釋倍數(shù)模板下各病毒目的片段條帶亮度均明顯較多重PCR明亮。

2.8 茶園樣品的多重PCR檢測

利用優(yōu)化建立的多重PCR檢測技術對60份茶園樣品進行檢測。結果顯示OTaGV、CCV1、TPNRBV、OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV陽性樣品檢出率分別為26.7%（16/60）、3.3%（2/60）、1.7%（1/60）、45.0%（27/60）、1.7%（1/60）、13.3%（8/60）和5.0%（3/60）（表4），該檢測結果與樣品單一PCR檢測結果完全相符，符合率為100%，表明建立的多重PCR檢測技術能夠有效用于茶園樣品中OTaGV、CCV1和TPNRBV的檢測。

A：多重PCR Multiplex PCR；B：CCV1單一PCR Single PCR of CCV1；C：OTaGV單一PCR Single PCR of OTaGV；D：TPNRBV單一PCR Single PCR of TPNRBV。M：DNA分子量標準DNA Marker (DL1000)；1—6：101、102、103、104、105和106倍稀釋101, 102, 103, 104, 105, and 106times dilution, respectively；7：陰性對照Negative control

圖6 多重PCR靈敏度

Fig. 6 Sensitivity of multiplex PCR

表4 茶園樣品多重PCR檢測結果

3 討論

茶樹是福建省特色經濟作物，茶產業(yè)也已成為福建省重要特色優(yōu)勢產業(yè)。近年來，隨著福建省茶樹種植面積和規(guī)?；潭炔粩嗵岣?，茶樹上病害發(fā)生種類和數(shù)量也在不斷增多，嚴重威脅了茶葉的產量和品質。針對茶樹上新報道的病毒病，福建地區(qū)至今尚未開展系統(tǒng)的調查和鑒定。本研究采用高通量測序和PCR、RT-PCR相結合的方法對福建茶樹病毒種類進行了檢測鑒定，明確了茶樹病毒的主要種類、分布特征及侵染類型，并建立了多重快速檢測技術。

3.1 福建省茶樹病毒主要種類

高通量測序作為檢測病毒的一項重要技術手段，目前已被越來越多地用于農作物上病毒的檢測鑒定，除檢出已知病毒外，還發(fā)現(xiàn)了多種新病毒[25-32]。本研究通過高通量測序、PCR和RT-PCR，從采集的1 869份茶樹樣品中檢測出攜帶病毒的樣品1 258份，發(fā)現(xiàn)了OTaGV、CCV1和TPNRBV 3種病毒，其中OTaGV為福建地區(qū)茶樹上首次檢出。病毒檢出率從高到低依次為OTaGV、TPNRBV和CCV1。OTaGV檢出率為48.90%，發(fā)生最為普遍，在福建省9個地區(qū)均有分布；TPNRBV檢出率26.75%，在5個地區(qū)有分布；而CCV1檢出率為17.98%，除廈門外，在福建省其他8個地區(qū)均有分布。從病毒檢出率和分布范圍推測OTaGV、TPNRBV和CCV1為當前福建省茶樹病毒主要種類。我國浙江、山東茶樹上先后報道了TPLPV、GLRaV-7的發(fā)生，但本研究中未檢出這兩種病毒。湯亞飛等[33]研究發(fā)現(xiàn)，植株體內的某些病毒因含量過低，導致高通量測序可能無法檢測到。為防止NGS的漏檢，本研究利用TPLPV、GLRaV-7特異性引物對所有樣品進行了RT-PCR檢測，但均未檢出TPLPV和GLRaV-7。分析原因一方面可能是病毒分布存在地理差異，福建茶樹上尚無TPLPV和GLRaV-7侵染，另一方面也有可能是未采集到攜帶有這兩種病毒的樣品。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)CCV1分離物與已報道的福建分離物親緣關系最近、TPNRBV分離物與福建分離物親緣關系最近。由于GenBank上公布的OTaGV相應序列僅有一條，因此該病毒未構建系統(tǒng)發(fā)育樹。OTaGV是在油茶上發(fā)現(xiàn)的一種新的雙生病毒[16]，本研究發(fā)現(xiàn)OTaGV也可以侵染茶樹，該OTaGV茶樹分離物的全基因組序列有待進一步測定。

3.2 福建省茶樹病毒分布特征及侵染類型

在本研究中，OTaGV、CCV1和TPNRBV 3種病毒在福建不同地區(qū)的分布呈現(xiàn)出明顯的差異。OTaGV在漳州地區(qū)檢出率最高（96.77%），龍巖地區(qū)檢出率最低（5.12%）；CCV1在三明地區(qū)檢出率最高（66.00%），廈門地區(qū)未檢出；TPNRBV在泉州地區(qū)檢出率最高（79.13%），廈門、三明、莆田和龍巖4個地區(qū)未檢出。上述結果表明，福建9個地區(qū)茶樹的優(yōu)勢病毒存在顯著的不同，這可能與各地區(qū)氣候條件、茶樹品種抗性和栽培制度以及病毒傳播特性等不同有關。在自然界中，植物病毒復合侵染現(xiàn)象較為普遍[34]。劉勇等[35]報道，我國蔬菜作物中普遍存在多種病毒復合侵染現(xiàn)象，已發(fā)現(xiàn)2—6種病毒復合侵染。本研究1 258份病毒檢出為陽性的茶樹樣品中，807份樣品為單一病毒侵染，總單獨侵染率為64.15%，其中OTaGV、TPNRBV和CCV1單獨侵染率分別為37.20%、21.38%和5.56%，451份樣品為2種或3種病毒復合侵染，總復合侵染率為35.85%。單一病毒侵染率約為復合侵染率的兩倍，說明福建茶樹病毒目前仍以單獨侵染為主，同時存在較多的復合侵染。茶樹病毒復合侵染類型有OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+ OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4種，檢出率分別為17.49%、0.40%、14.71%、3.26%，其中以OTaGV+ CCV1、TPNRBV+OTaGV檢出率較高，表明復合侵染是以OTaGV與另一種病毒（CCV1或TPNRBV）的復合侵染為主。在福建省9個地區(qū)中，除龍巖、廈門地區(qū)未發(fā)現(xiàn)復合侵染外，其他7個地區(qū)均檢測到病毒復合侵染，其中以漳州地區(qū)病毒復合侵染檢出率最高（85.00%）、寧德地區(qū)病毒復合侵染檢出率最低（23.03%）。病毒的復合侵染有可能會加重對茶樹生產的危害，但目前尚無相關的研究數(shù)據，這方面有待進一步研究。

3.3 茶樹病毒多重PCR檢測

多重PCR檢測技術具有快速、準確、高效和檢測成本低的優(yōu)點，在植物病毒常規(guī)檢測上具有重要應用價值[36]。Xu等[37]根據百合無癥病毒（lily symptomless virus）、百合斑駁病毒（lily mottle virus）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus）和車前草花葉病毒（plantago asiatica mosaic virus）的基因組序列保守區(qū)域設計特異性引物，建立了同時檢測4種百合病毒的多重RT-PCR檢測方法。吐遜艾力·艾孜提力等[38]為了快速檢測危害無花果的病毒種類，研究建立了一種同時檢測無花果斑點相關病毒（fig fleck-associated virus）、無花果葉斑相關病毒（fig leaf mottle-associated virus）和無花果花葉病毒（fig mosaic virus）3種無花果病毒的多重RT-PCR檢測體系。本研究針對福建茶樹病毒的主要種類和發(fā)生特點，建立了可用于OTaGV、CCV1和TPNRBV快速檢測的多重PCR技術，適用于目前茶樹病毒常見侵染類型的檢測。OTaGV為DNA病毒，而TPNRBV、CCV1為RNA病毒，傳統(tǒng)的核酸提取方法是將RNA、DNA分開提取，然后將RNA反轉錄得到的cDNA與DNA混合后作為模板。本研究采用改良的CTAB法[20]，提取的總核酸既有RNA，也有DNA，直接作為多重PCR的模板，不僅簡化了操作步驟、節(jié)約了檢測成本，還減少了實驗污染。此外，多重PCR采用了一步法RT-PCR擴增，RNA和DNA病毒在同一反應體系中進行檢測，進一步提高了檢測效率。引物濃度、退火溫度、循環(huán)數(shù)等因素常常影響多重PCR檢測技術的建立。本研究在單重PCR反應體系和反應條件基礎上，通過引物濃度、退火溫度、循環(huán)數(shù)因素優(yōu)化，最終建立了同時檢測茶樹上OTaGV、CCV1和TPNRBV 3種病毒的多重PCR檢測技術。特異性和靈敏度是檢驗多重PCR方法是否成功的關鍵。本研究建立的多重PCR檢測技術，對OTaGV、CCV1、TPNRBV具有良好的特異性和靈敏度。利用建立的多重PCR檢測技術對采集的福建茶樹疑似病樣進行了實際檢測，檢測結果與單重PCR完全一致，進一步驗證了該技術的實用性。

4 結論

對福建省9個地區(qū)采集的1 869份樣品進行了檢測鑒定，明確了當前福建茶樹的主要病毒種類為OTaGV、CCV1、TPNRBV，其中OTaGV為福建地區(qū)首次報道，并發(fā)現(xiàn)該病毒也可以侵染茶樹；在檢出的3種病毒中，OTaGV分布范圍最廣，在福建9個地區(qū)均有分布，而CCV1、TPNRBV分別在8個、5個地區(qū)有分布；福建茶樹病毒目前以單獨侵染為主，但同時存在較為普遍的復合侵染現(xiàn)象，復合侵染類型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+ CCV1+TPNRBV；建立了快速、準確、靈敏和高效的多重PCR檢測技術，可用于茶園茶樹上OTaGV、CCV1和TPNRBV的檢測鑒定。

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Identification of Tea Plant Viruses in Fujian Province and Establishment of Multiplex PCR Detection Assay

1Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;2Technology Center of Fuzhou Custom District/Fujian Key Laboratory for Technology Research of Inspection and Quarantine, Fuzhou 350001;3Comprehensive Technical Service Center of Rongcheng Customs District, Fuqing 350300, Fujian

【Objective】This study endeavors to explore the species diversity and prevalence of viruses within tea plantations in Fujian Province. Furthermore, it aims to devise a multiplex PCR assay capable of swiftly detecting multiple viruses simultaneously.【Method】From 2019 to 2023, a total of 1 869 samples were gathered from tea plants displaying virus-like symptoms, including chlorosis, blotch, and necrosis, across nine regions, encompassing Fuzhou, Nanping, Ningde, Quanzhou, Zhangzhou, Xiamen, Sanming, Putian, and Longyan cities. High-throughput sequencing technology, combined with PCR and RT-PCR detection methods, was used to identify the pathogens causing viral diseases in tea plants. Specific target fragments amplified by PCR were cloned, sequenced, and subjected to phylogenetic analysis. In addition, specific primers were designed based on reported virus sequences in GenBank, and a multiplex PCR assay was established for detecting major tea plant viruses in Fujian Province by optimizing reaction conditions, including annealing temperature, primer concentration, and cycle number. The assay’s specificity, sensitivity, and practical application were subsequently determined.【Result】Three viruses were detected in tea plant samples from Fujian tea plantations, with detection rates ranked as follows: oil tea associated geminivirus (OTaGV) at 48.90%, tea plant necrotic ring blotch virus (TPNRBV) at 26.75%, and camellia cryptic virus 1 (CCV1) at 17.98%. Among the 1 258 samples that tested positive for viruses, 807 samples were infected with only one of the three viruses (OTaGV, TPNRBV, or CCV1), corresponding to detection rates of 37.20%, 21.38%, and 5.56%, respectively. The remaining 451 samples were co-infected with two or three viruses, resulting in a co-infection rate of 35.85%. The most common co-infection types were OTaGV+CCV1 (17.49%), TPNRBV+CCV1 (0.40%), TPNRBV+OTaGV (14.71%), and OTaGV+CCV1+TPNRBV (3.26%). Geographically, OTaGV was distributed in all nine regions, with the highest detection rate in Zhangzhou at 96.77%. CCV1 was present in eight regions (excluding Xiamen), with the highest detection rate in Sanming at 66.00%. TPNRBV was found in five regions (Fuzhou, Nanping, Ningde, Quanzhou and Zhangzhou), with the highest detection rate in Quanzhou at 79.13%. Among the nine regions, only OTaGV was detected in Xiamen, OTaGV and CCV1 were detected in Sanming, Putian, and Longyan, and all three viruses were detected in the other five regions. The viral co-infection rate was highest in Zhangzhou at 85.00% and lowest in Ningde at 23.03%. Phylogenetic tree construction based on CCV1 and TPNRBV gene sequences indicated that the CCV1 isolate FW obtained in this study had the closest resemblance to the reported Fujian isolate FJ_SH104 (GenBank accession number: ON807095), and the TPNRBV isolate FU had the closest resemblance to the Fujian isolate QZHA92 (GenBank accession number: OQ948454). The established multiplex PCR detection assay exhibited strong specificity, as it only amplified specific target fragments of OTaGV, TPNRBV, and CCV1, while no amplification product was observed in other viruses or healthy tea plant samples. The lowest sensitivity of the multiplex PCR was detecting OTaGV and TPNRBV at dilutions of 10-4and CCV1 at a dilution of 10-3. The multiplex PCR assay successfully detected all three viruses in 60 disease samples collected from tea plantations, and the results were consistent with those obtained by single PCR detection.【Conclusion】OTaGV, CCV1, and TPNRBV are the major virus species in tea plants in the Fujian, with OTaGV being reported for the first time in this province. This study also revealed that OTaGV can infect tea plants. Among the detected viruses, OTaGV has the widest distribution, followed by CCV1 and TPNRBV. Presently, tea plants in Fujian are still mainly infected by single virus infections. However, viral co-infections are prevalent, showcasing combinations such as TPNRBV+CCV1, TPNRBV+OTaGV, CCV1+OTaGV, and OTaGV+CCV1+TPNRBV. The established multiplex PCR assay exhibits strong specificity and high sensitivity, making it suitable for the rapid detection of the three viruses (OTaGV, CCV1 and TPNRBV) in tea plantations. Taken together, the findings obtained in this study will provide a theoretical basis and technical support for prevention and control of viral diseases in tea plants in Fujian Province.

tea plant virus; pathogen identification; multiplex PCR; molecular detection; Fujian Province

2023-10-07；

2023-11-05

福建省農業(yè)引導性（重點）項目（2020N0024）、福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室開放課題（FJKF2019-03）

陳細紅，E-mail：kaishilvxing00@163.com。通信作者沈建國，E-mail：shenjg_agri@163.com。通信作者高芳鑾，E-mail：raindy@fafu.edu.cn

（責任編輯 岳梅）