關(guān)志林，靳豐蔚，劉婷婷，王毅，譚瑩瑩，楊春慧，李蕊彤，王博，劉克德，董云

甘藍(lán)型油菜光葉性狀的遺傳分析及基因定位

1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，蘭州 730070；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3武漢基諾賽克科技有限公司，武漢 430070

【目的】表皮蠟質(zhì)是覆蓋植物葉片和莖稈等部位的疏水層，在植物抵御逆境方面發(fā)揮著重要作用，同時會影響光合作用和生長發(fā)育；甘藍(lán)型油菜作為世界上主要的油料作物之一，研究表皮蠟質(zhì)突變體的遺傳機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)油菜高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提供參考。【方法】對油菜光葉突變體M8和普通蠟質(zhì)葉中雙11（ZS11）和C20的葉片表征進(jìn)行記載，使用便攜式植物光合作用測量系統(tǒng)測定葉片光合速率；利用M8和ZS11、C20分別雜交獲得2個F1、自交構(gòu)建2個F2分離群體，用于分析油菜光葉性狀的遺傳規(guī)律；選取M8和ZS11雜交的F2群體中光葉和蠟質(zhì)葉表型單株分別進(jìn)行混池，通過集團(tuán)分離分析法結(jié)合靶向測序技術(shù)進(jìn)行基因克隆，結(jié)合比較基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行候選基因預(yù)測，并通過RT-PCR驗(yàn)證候選基因?！窘Y(jié)果】甘藍(lán)型油菜光葉表型葉片氣孔導(dǎo)度更大、光合效率更高；遺傳分析表明M8光葉性狀受1對基因控制，光葉相對蠟質(zhì)葉為隱性。圖位克隆將光葉控制基因定位至A08染色體0.134—0.699 Mb物理區(qū)間內(nèi)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于ZS11，光葉突變體M8中A08染色體0.22—0.58 Mb區(qū)間存在大片段缺失，ZS11在該區(qū)段中的（）可能為光葉的候選基因，該基因編碼一個Kelch-F-box蛋白，在ZS11葉片中表達(dá)量高而M8中未檢測到，該基因缺失可能導(dǎo)致了M8光葉表型?！窘Y(jié)論】甘藍(lán)型油菜光葉新突變體M8相比野生型蠟質(zhì)葉片光合速率更高，該光葉表型受1對隱性基因控制；圖位克隆鑒定到光葉性狀調(diào)控基因?yàn)椋蛉笔Мa(chǎn)生了光葉表型。

甘藍(lán)型油菜；光葉；蠟質(zhì)；圖位克??；

0 引言

【研究意義】甘藍(lán)型油菜是我國乃至世界上主要的油料作物之一，同時也具有飼用、觀賞、菜用、肥用等其他功能。在油菜的生長發(fā)育過程中，高溫、干旱和病蟲害不利環(huán)境因素會造成嚴(yán)重產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降[1-2]。葉片是植物進(jìn)行光合作用及蒸騰作用的主要場所，葉片表面蠟質(zhì)是疏水層，表現(xiàn)為白霜蠟狀，在陸生植物抵御環(huán)境缺水、紫外線等逆境過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。此外，表皮蠟質(zhì)還可以減少葉表面灰塵、碎屑附著，有助于植物自清潔，提高葉片等光合作用效率[6-7]。通常情況，葉片表皮蠟質(zhì)缺失在視覺上表現(xiàn)為更光滑、明亮[7-9]，稱為光葉；也有部分植物中光葉是葉表皮蠟質(zhì)增加、排布發(fā)生變化引起[10-11]。利用光葉突變體解析油菜表皮蠟質(zhì)形成機(jī)制對于提高油菜抗逆能力、實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物表皮蠟質(zhì)通常形成晶體，下方的蠟分子嵌入角質(zhì)層，由外到內(nèi)可分為突出蠟質(zhì)、平鋪表層蠟質(zhì)、內(nèi)層蠟質(zhì)和角質(zhì)四層[12-13]。表皮蠟質(zhì)主要由超長鏈脂肪酸（very long chain fatty acids，VLCFAs，C20—C34）、VLCFAs衍生物（醛、醇、酮等）、VLC烷烴和蠟酯等組成[14]。蠟質(zhì)組成和含量、形態(tài)和覆蓋率，以及生長環(huán)境條件均會改變蠟質(zhì)的性質(zhì)，從而使植物在應(yīng)對逆境的能力發(fā)生差異[15]。蠟質(zhì)在表皮細(xì)胞中合成[16]，蠟質(zhì)合成包括C16/C18長鏈脂肪酸從頭合成、延伸形成超長鏈脂肪酸和進(jìn)一步衍生化3個階段。其中，C16/C18長鏈脂肪酸從頭合成與油脂代謝相同，在葉片細(xì)胞質(zhì)體中進(jìn)行[17]。其次是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中C16/C18長鏈脂肪酸延伸為VLCFAs[18]，蠟質(zhì)基因/是該過程關(guān)鍵基因，結(jié)合脂肪酸延長酶可將C18等延伸至C28，最高可達(dá)C34；突變會導(dǎo)致莖稈和花粉VLCFAs缺陷、蠟質(zhì)含量大為減少[19]。VLCFAs衍生化分為烷烴合成途徑和醇合成途徑2個衍生化分支[18]，擬南芥中超過80%蠟質(zhì)通過烷烴合成途徑生成[3]，與編碼一種參與產(chǎn)生超長鏈烷烴（蠟的主要成分）的生物合成酶，是烷烴合成途徑中關(guān)鍵基因[20]。通過醇合成途徑調(diào)控蠟質(zhì)合成[10]。蠟質(zhì)合成還受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[21-22]，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，還需轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)胞外運(yùn)輸[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】油菜是白菜和甘藍(lán)雜交形成的異源四倍體，與擬南芥同屬十字花科，但是由于基因組多倍化和染色體重排，變異更為復(fù)雜，光葉性狀的研究也起步較晚。油菜的祖先種白菜和甘藍(lán)中，擬南芥的同源基因均被證實(shí)調(diào)控蠟質(zhì)[24-25]，同源基因也被定位[24, 26]，而相關(guān)基因功能還需進(jìn)一步研究。油菜中，突變體光葉性狀受2對隱形基因控制，分別位于A01和C01染色體[27]，后被證實(shí)為的同源基因[28]。目前，甘藍(lán)型油菜中克隆的蠟質(zhì)相關(guān)基因較少，相關(guān)調(diào)控機(jī)制也不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以油菜光葉突變體M8和正常蠟粉葉品種中雙11雜交構(gòu)建F2分離群體，利用BSA（bulked segregation analysis）結(jié)合靶向測序（target-seq）的快速定位技術(shù)對甘藍(lán)型油菜光葉性狀控制基因進(jìn)行定位，確定候選基因，為油菜蠟質(zhì)形成機(jī)理解析奠定基礎(chǔ)，對油菜葉片表皮蠟質(zhì)的改良及輔助油菜高光效新品種選育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在利用EMS誘變甘藍(lán)型油菜三系雜交種隴油10號父本C20（野生型，普通蠟質(zhì)葉）獲得的突變體中，鑒定到一個穩(wěn)定遺傳的光葉株系，命名M8。光葉突變體M8與普通蠟質(zhì)葉常規(guī)品種中雙11（ZS11）、C20分別雜交并自交，收獲的F1和F2群體用于遺傳分析，M8與ZS11組合的F2分離群體共計2 094個單株用于基因精細(xì)定位。所有材料均種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜育種基地和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。

1.2 性狀調(diào)查及光合作用測定

油菜植株長至5—6片真葉時進(jìn)行表型調(diào)查，2人一組通過肉眼觀察葉片表面有無蠟粉并記錄。對F2群體各單株表型調(diào)查2次并記錄，2次鑒定一致、確保表型無誤后進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計分析。

為了探索葉片蠟粉有無對油菜品種光合作用的影響，使用便攜式植物光合作用測量系統(tǒng)LI-6800（美國LI-COR）對3個親本的苗期植株進(jìn)行光合作用的測定，測定時間為2022年1月18日13:00—14:00。計算公式為A（μmol·m-2·s-1）=F(Cr-Cs)/100S-Cs×E，其中，A表示CO2凈同化速率，F(xiàn)是氣流量（μmol·s-1），S是葉面積（cm2），Cr和Cs是參比室和樣品室的CO2濃度（μmol CO2·mol air-1），E是葉片表面蒸騰速率；氣孔導(dǎo)度單位為mol·m-2·s-1。采用Microsoft Excle計算數(shù)據(jù)的顯著性。

1.3 光葉性狀的遺傳分析

光葉突變體M8與有蠟質(zhì)的常規(guī)品種中雙11（ZS11）、C20分別雜交獲得F1代、自交獲得F2群體，觀察蠟質(zhì)表型；統(tǒng)計2個F2群體中光葉（突變體類型）和普通蠟質(zhì)葉數(shù)目，進(jìn)行卡方檢測。

1.4 BSA混池及測序

按照田間編號對F2群體進(jìn)行取樣，每單株取0.25 g葉片放入96孔深孔板中，采用改良CTAB法[29]提取DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的質(zhì)量。BSA分析[30]混樣：根據(jù)F2群體表型結(jié)果，隨機(jī)選取30個光葉單株DNA和30個普通蠟質(zhì)葉單株DNA，利用Qubit 2.0（Thermo Fisher，USA）測定DNA濃度后，將30個光葉單株和30個蠟質(zhì)葉單株的DNA分別等量混合構(gòu)成光葉DNA混池（Bulk-G）和蠟質(zhì)葉DNA混池（Bulk-L），將2個混池和親本DNA濃度調(diào)整至25 ng·μL-1?；旌虾玫腄NA交由武漢基諾賽克科技有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建并測序，文庫構(gòu)建主要流程包括DNA片段化、末端修復(fù)并連接接頭、片段篩選、磁珠純化等，經(jīng)過質(zhì)檢、定量后，在HiSeq 4000平臺上進(jìn)行Paired-end 150 bp（PE150）測序。

1.5 BSA測序數(shù)據(jù)分析

采用FastQC軟件（https://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/）檢測PE150測序原始序列的質(zhì)量，并通過Trimmomatic軟件[31]對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。隨后經(jīng)由BWA[32]與ZS11參考基因組[33]（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR）比對，再利用GATK[34]提取全基因組范圍變異信息，用ANNOVAR[35]對提取的全部變異信息進(jìn)行注釋。BWA和Samtools軟件分析均使用默認(rèn)參數(shù)，GATK軟件使用參數(shù)“QUAL＜30.0||QD＜4.0||FS＞60.0||MQ＜40.0”過濾。

1.6 候選基因的初定位

以ZS11高質(zhì)量基因組序列作為參考，利用QTLseqr軟件[36]計算每個變異位點(diǎn)在Bulk-G和Bulk-L中的SNP-index，進(jìn)一步計算Δ（SNP-index）衡量2個混池的等位基因頻率差異。使用滑窗分析方法（滑窗大小為500 kb）計算SNP-index及Δ（SNP-index）的平均值，并對其在染色體上的分布進(jìn)行作圖（步長2 Mb）。2個混池中差異較大的區(qū)段即為該油菜突變體光葉性狀控制基因所在的候選區(qū)段。

使用ANNOVAR軟件對初定位區(qū)間的變異進(jìn)行注釋并預(yù)測變異對鄰近基因功能的影響。根據(jù)變異位點(diǎn)及鄰近基因在參考基因組上的位置信息即可得到變異位點(diǎn)在基因組的區(qū)域（基因間區(qū)、基因區(qū)或CDS區(qū)等）及變異對基因產(chǎn)生的影響（同義、非同義突變等）。

1.7 光葉基因的精細(xì)定位

為了進(jìn)一步縮小區(qū)間，根據(jù)BSA初定位區(qū)間的變異信息開發(fā)分子標(biāo)記，通過Target-seq進(jìn)行精細(xì)定位?；赯S11參考基因組，在初定位區(qū)間內(nèi)使用Primer3軟件（version 2.5.0）設(shè)計16個SNP標(biāo)記的引物，分別對親本M8和ZS11和F2群體2 094個單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行建庫測序，并利用生物信息分析進(jìn)行測序序列的比對與變異位點(diǎn)檢測，并進(jìn)行基因分型。Target-seq及基因分型由武漢基諾賽克科技有限公司輔助完成。結(jié)合表型與基因型結(jié)果篩選交換單株，縮小定位區(qū)間。

1.8 基因表達(dá)量測定及數(shù)據(jù)來源

取M8和ZS11幼嫩葉片，用常規(guī)的Trizol Reagent方法提取RNA，并檢測其完整性。使用RevertAid First strand cDNA synthesis kit（Thermo scientific, USA）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度調(diào)整至50 ng·μL-1，作為qPCR的模板。參照SYBR Green master mixture（Roche）說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以油菜Epsin N-terminal homology（）為內(nèi)參基因，每個生物學(xué)樣品設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。引物見電子附表1。利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量，低表達(dá)量計為1（Livak and Schmittgen 2001）。

在定位區(qū)段，根據(jù)基因的功能注釋信息推斷候選基因。在候選基因的時空表達(dá)分析中，候選基因及其同源基因在ZS11各組織各時期的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)來源于ZS11轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（http://yanglab.hzau.edu.cn/ BnIR）[37]，包括根、莖、葉、花、果、種等共計6個組織80個樣本。

2 結(jié)果

2.1 油菜光葉突變體葉片表型特征

前期在甘藍(lán)型油菜三系雜交種隴油10號父本C20通過EMS誘變?nèi)后w中鑒定到光葉突變體M8，連續(xù)多代自交和田間觀察發(fā)現(xiàn)該突變體光葉性狀能穩(wěn)定遺傳。與野生型蠟質(zhì)葉自交系C20及普通蠟質(zhì)葉油菜品種中雙11相比，光葉材料M8的葉片表現(xiàn)得更加嫩綠，且表面光滑、明亮；而ZS11普通蠟質(zhì)葉正面和背面均覆蓋一層明顯的白色蠟質(zhì)，葉面粗糙沒有光澤、易附著塵屑（圖1-a—b）。

通過測定普通蠟質(zhì)葉與光葉的凈光合速率，發(fā)現(xiàn)光葉突變體M8葉片CO2凈同化速率最高（圖1-c），平均為（27.57±1.28） μmol·m-2·s-1，而普通蠟質(zhì)葉ZS11和野生型C20葉片中CO2凈同化速率分別為（24.51±1.29）和（20.16±1.38） μmol·m-2·s-1。光葉突變體CO2凈同化速率顯著高于普通蠟質(zhì)葉ZS11和野生型蠟質(zhì)葉C20。同時，光葉突變體M8的氣孔導(dǎo)度（（0.519±0.014） mol·m-2·s-1）極顯著大于普通蠟質(zhì)葉ZS11（（0.395±0.028） mol·m-2·s-1）和野生型蠟質(zhì)葉C20（（0.271±0.015） mol·m-2·s-1）。光葉突變體可能因?yàn)槿~表蠟質(zhì)變化、葉表光滑清潔等導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度更大，光合速率更快。

a：葉片正面；b：葉片背面；c：葉片CO2凈同化速率；d：氣孔導(dǎo)度。bar=20 cm

a: Photographs of the front leaves; b: Photographs of the back leaves; c: The net CO2assimilation rate; d: The stomatal conductance to water. bar=20 cm

圖1 甘藍(lán)型油菜光葉和普通蠟質(zhì)葉品種間的性狀及凈光合速率比較

Fig. 1 Comparison of characteristics and net photosynthetic rate of cultivars with glossy- and waxy- leaf in

2.2 油菜光葉性狀的遺傳分析

以光葉材料M8為父本，分別以普通蠟質(zhì)葉品系ZS11和野生型C20為母本雜交獲得F1，2個雜交組合的F1單株均表現(xiàn)為普通蠟質(zhì)葉，說明光葉性狀為隱性。F1單株分別自交獲得2個組合的F2群體，均分離出光葉表型單株（表1）。M8和ZS11雜交的F2群體443個單株中，光葉表型95個單株，普通蠟質(zhì)葉表型348個單株，光葉與普通蠟質(zhì)葉性狀單株數(shù)量之比經(jīng)卡方驗(yàn)證符合1﹕3分離（χ2=2.80＜3.84= χ20.05）。M8和C20雜交的F2群體中，光葉表型109個單株，普通蠟質(zhì)葉表型275個單株，光葉與普通蠟質(zhì)葉性狀單株數(shù)量之比經(jīng)卡方驗(yàn)證符合1﹕3分離（χ2=2.17＜3.84=χ20.05）。對2個F2分離群體的遺傳分析均表明，突變體M8光葉性狀受單個隱性基因控制。

表1 光葉和普通蠟質(zhì)葉F2單株分離的卡方測驗(yàn)

2.3 油菜光葉性狀控制基因初定位

由于ZS11已有高質(zhì)量基因組序列作為參考，選用M8和ZS11雜交的F2群體用于基因定位。BSA測序結(jié)果統(tǒng)計分析顯示，親本M8和ZS11分別獲得82 441 310條和68 380 245條雙端序列，混池Bulk-G和Bulk-L分別得到175 668 813和121 874 422條序列，樣本平均測序數(shù)據(jù)量為32 G。

測序數(shù)據(jù)分別與ZS11參考基因組比對，比對率超過87.61%，覆蓋度達(dá)78%—87%。變異檢測共獲得482 322個SNP（single nucleotide polymorphism）和57 461個InDel（insertions or deletion），SNP中約61%為C/T或A/G變異，在19條染色體上均勻分布，平均每Mb含有502個SNP和60個Indel。利用BSA-seq常用軟件QTLseqr[21]分別計算光葉混池Bulk-G和普通葉混池Bulk-L的SNP-index及Δ（SNP-index），以2 Mb區(qū)間為滑動窗口考察Δ（SNP-index）在全基因上的分布（圖2），結(jié)果顯示，在A08染色體0.13—2.40 Mb區(qū)間內(nèi)Δ（SNP-index）超過閾值，表明甘藍(lán)型油菜光葉基因可能位于該區(qū)間內(nèi)。

紅色箭頭表示Δ（SNP-index）超過閾值（灰色線，=0.0001）的區(qū)域

Red arrow indicates the region where the value of Δ(SNP-index) exceeds the threshold (gray line,=0.0001)

圖2 BSA-seq定位甘藍(lán)型油菜光葉候選基因

Fig. 2 Genetic mapping of candidate glossy leaf genes by BSA-seq in

甘藍(lán)型油菜光葉基因候選區(qū)間A08：0.13—2.40 Mb內(nèi)共含有287個注釋基因。這段長度為2.27 Mb的物理區(qū)間內(nèi)含1 071個SNP和174個InDel，25.8%位于基因間區(qū)，60.0%位于基因區(qū)，其余14.2%位于基因上游或下游區(qū)域。其中，有143個SNP和33個InDel導(dǎo)致共移碼突變或提前終止，最終導(dǎo)致氨基酸序列改變。

2.4 油菜光葉性狀控制基因精細(xì)定位

為進(jìn)一步精細(xì)定位該光葉控制基因，利用初定位獲得的變異信息，在候選區(qū)間內(nèi)開發(fā)了16個SNP標(biāo)記（表2），利用Target-seq對M8和ZS11雜交的F2群體全部單株進(jìn)行基因分型。16個SNP標(biāo)記中，P2、P3、P4這3個標(biāo)記表現(xiàn)為顯性外，其余13個標(biāo)記均為共顯性，均獲得較為完整的基因型信息。結(jié)合重點(diǎn)交換單株及葉片蠟質(zhì)有無表型，將目的基因定位于標(biāo)記P1和P5之間（圖3），對應(yīng)ZS11基因組A08染色體133 863—698 791 bp物理區(qū)間。在定位群體中，顯性標(biāo)記P2、P3、P4與葉片蠟質(zhì)有無表型呈共分離。

表2 A08染色體分子標(biāo)記信息

圖中從上至下為油菜光葉基因精細(xì)定位標(biāo)記及重點(diǎn)交換單株基因型示意圖。M8為光葉突變體，gs1205為基因型全雜合的普通蠟質(zhì)葉單株，淺綠色部分表示M8類基因型，橙色為ZS11類基因型，淡黃色部分表示雜合基因型；GL：光葉，WL：蠟質(zhì)葉

The diagram shows the fine mapping markers and key exchange of single plant genotypes for rapeseed light leaf genes. M8 is the glossy leaf mutant, gs1205 is a common waxy leaf individual with heterozygous genotypes. The light green part represents the M8-genotype, the orange part represents the ZS11-genotype, and the light yellow part represents the heterozygotes. GL: glossy leaf trait, WL: waxy leaf trait

圖3 甘藍(lán)型油菜光葉候選基因的精細(xì)定位

Fig. 3 Fine mapping of candidate glossy leaf genes in

鑒于位于精細(xì)定位的A08染色體0.1338—0.6988 Mb區(qū)間內(nèi)的P2、P3、P4 3個標(biāo)記基因分型失敗，檢測了親本及2個混池二代測序數(shù)據(jù)在A08染色體上的覆蓋，發(fā)現(xiàn)光葉突變體M8及光葉混池Bulk-G在0—0.6 Mb區(qū)間內(nèi)平均覆蓋測序reads數(shù)偏低，而ZS11和普通蠟質(zhì)葉混池Bulk-L測序reads覆蓋正常（圖4-a），推測光葉突變體M8在0—0.6 Mb物理區(qū)間可能存在片段缺失。為驗(yàn)證這一推測，在該區(qū)間內(nèi)間隔50 kb物理距離分段設(shè)計9對引物擴(kuò)增親本ZS11及M8中的基因組中對應(yīng)9個片段（Fr.1—Fr.9，表3），除Fr.9外，其余8個目標(biāo)片段只在ZS11檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物，而光葉突變體M8沒有檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4-b），證實(shí)光葉突變體M8中A08染色體上對應(yīng)ZS11基因組0.22—0.58 Mb區(qū)間存在缺失（圖4-c），具體缺失斷點(diǎn)仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 油菜光葉性狀候選基因鑒定及基因表達(dá)分析

在光葉基因定位區(qū)段內(nèi)，ZS11參考基因組共注釋了75個基因。根據(jù)ZS11全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫顯示（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/），其中，有9個基因在ZS11全部組織均未表達(dá)，有24個基因在葉片中不表達(dá)，因此，可以排除這些基因。另外42個基因主要編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、線粒體導(dǎo)入內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶亞基、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、F-box蛋白、光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基Ⅴ、TATA-box結(jié)合蛋白、谷氨酰胺依賴性NAD+合成酶、功能未知蛋白等。其中，基因（A08:532 818..534 788）對應(yīng)擬南芥同源基因，編碼一個富含Kelch重復(fù)序列的F-box（Kelch-F-box）蛋白，又名SAGL1（SMALL AND GLOSSY LEAVES1）。擬南芥和突變體表現(xiàn)為葉片小而肥厚、有光澤[38]，與M8光葉表型相似，因此，推測（）為光葉候選基因，突變體M8光葉表型可能因缺失該基因?qū)е隆?/p>

a：中雙11、突變體M8、Bulk-L和Bulk-G 4個樣品A8染色體上測序read覆蓋度和測序深度；b：ZS11和M8中9個片段的擴(kuò)增結(jié)果；c：光葉突變體M8中A08染色體片段缺失示意圖，紅色箭頭為目標(biāo)候選基因

a: The coverage and depth distribution map on of the sequencing data of 4 samples including ZS11, M8, Bulk-L and Bulk-G; b: the PCR amplification results of 9 fragments in ZS11 and M8; c: Schematic diagram of fragment deletion on A08 chromosome in the glossy leaf mutant M8, and the red arrow represents the target candidate gene

圖4 甘藍(lán)型油菜光葉突變體M8中A08染色體存在片段缺失

Fig. 4 Fragment deletion on A08 chromosome in theglossy leaf mutant M8

在甘藍(lán)型油菜中鑒定到6個擬南芥（）的同源拷貝，分別位于A08/C03、A05/ C06、A06/C06染色體。擬南芥中，調(diào)控的靶基因[38]在油菜中有位于A02/C02和A10/ C09染色體的4個同源拷貝。油菜和與擬南芥同源性較高，在中雙11的根、莖、葉等7個組織中，表達(dá)水平最高，尤其是根、葉、角果皮等裸露、接觸光和空氣等部位（圖5-a—b）。通過檢測光葉突變體M8和蠟質(zhì)葉ZS11葉片和的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)M8中的幾乎不表達(dá)，而ZS11中的高表達(dá)；在M8和ZS11中均不表達(dá)（圖5-c）。同時，在M8中表達(dá)量高出ZS11約12倍，在M8中表達(dá)量高出ZS11約5倍（圖5-d），進(jìn)一步說明可能為M8光葉性狀控制基因。

表4 基因表達(dá)量分析引物信息

在油菜ZS11葉片中，在新葉中表達(dá)水平低，老葉中表達(dá)水平高；而和相反，在新葉中表達(dá)水平高，老葉中表達(dá)水平低（圖5-e—f）；角果皮是油菜角果成熟時期的主要光和器官，成熟過程中，角果皮中表達(dá)不斷增強(qiáng)，和表達(dá)呈同樣降低趨勢（圖5-g—h）。與表達(dá)趨勢相反，暗示油菜中可能與擬南芥存在相似的調(diào)控機(jī)制，即通過調(diào)控表皮蠟質(zhì)合成，同時，表皮蠟質(zhì)與光合作用相關(guān)。

3 討論

3.1 植物表皮蠟質(zhì)具有多重保護(hù)作用

植物角質(zhì)層的發(fā)育是陸生植物進(jìn)化的關(guān)鍵步驟，葉片表皮蠟質(zhì)作為一道保護(hù)植物的屏障不僅可以抵御干旱，防止病蟲害侵入，還可以防止強(qiáng)光輻射等逆境傷害。本研究光葉突變體M8氣孔導(dǎo)度更大，光合效率高。在抗病表現(xiàn)上，光葉可能也是優(yōu)勢性狀；從圖1-b可明顯看出，有蠟質(zhì)的ZS11葉片背面有白色菌絲（白粉?。└街?，而光葉突變體M8背面光滑、無明顯附著，可見光葉賦予葉片更強(qiáng)的自潔能力。

3.2 油菜光葉性狀可作為形態(tài)標(biāo)記利用

葉片表皮蠟質(zhì)有無是一個肉眼可識別的形態(tài)特征，在油菜育種中還可發(fā)揮形態(tài)標(biāo)記作用，如將光葉性狀與育性關(guān)聯(lián)可用于鑒定、選育不育系和恢復(fù)系[39-40]。本研究光葉突變體M8來源于三系雜交種隴油10號父本，M8攜帶相應(yīng)的恢復(fù)基因，光葉可作為形態(tài)標(biāo)記在選育新的恢復(fù)系，還可以應(yīng)用于品系去雜。近年來，薹用油菜越來越受到重視，光葉由于葉片亮綠、食用品質(zhì)好，還可用于蔬菜雜交制種。

3.3 油菜光葉性狀產(chǎn)生與葉表蠟質(zhì)含量和結(jié)構(gòu)相關(guān)

油菜中發(fā)現(xiàn)的光葉突變體多為隱性，與前人研究[27-28]光葉性狀受2對隱性基因控制不同，本研究突變體M8光葉表型受單對隱性基因控制，遺傳上更為簡單。油菜與擬南芥親緣關(guān)系近，BnaA08.SAGL1的同源蛋白SAGL1在擬南芥中通過調(diào)節(jié)CER3的穩(wěn)定性來負(fù)調(diào)控表皮蠟質(zhì)合成，擬南芥突變?nèi)~片變現(xiàn)為光葉[38]，CER3是一種參與VLC烷烴生產(chǎn)的生物合成酶，VLC烷烴占擬南芥葉和莖角質(zhì)層總蠟含量的60%—75%[20]，低濕度條件下，過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥莖中VLC烷烴含量降低約15%[38]。E3泛素連接酶在進(jìn)化上是保守的，在植物生命周期中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的作用，表明擬南芥中SAGL1-CER3模塊調(diào)節(jié)機(jī)制也可能參與調(diào)節(jié)油菜、番茄等多種植物的表皮蠟生物合成[6]。結(jié)合基因定位和表達(dá)量測定結(jié)果，推測為突變體M8光葉性狀控制基因，可能由于葉表VLC烷烴含量變化排布差異導(dǎo)致了光葉表型。

a：基因在油菜不同組織中的平均表達(dá)水平；b：基因在油菜不同組織中的平均表達(dá)水平；c：基因和在油菜ZS11和M8葉片中的相對表達(dá)水平；d：基因和在油菜ZS11和M8葉片中的相對表達(dá)水平；e和f：基因（e）和（f）在不同部位葉片中的表達(dá)水平，其中，1是油菜最上部的新葉，依次向下，23是莖稈基部的老葉；g和h：基因（h）和（h）在不同生長發(fā)育時期角果皮中的表達(dá)水平

a: The average expression level of thein different tissues of rapeseed ZS11; b: The average expression level ofin different tissues of rapeseed ZS11; c: The relative expression level of theandand(e) and(f) in leaves at different lacations of ZS11, Among the 1-23, 1 is the new leaf at the top, descending in order, the 23 is the old leaf at the bottom of the stem of the rapeseed; g and h: The expression levels of(g) and(h) in silique wall at different development stages of ZS11

圖5 油菜基因和的表達(dá)水平分析

Fig. 5 Expression level analysis ofandgenes in rapeseed

本研究通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在油菜品種ZS11葉片和角果皮等器官中，表達(dá)隨發(fā)育進(jìn)程不斷升高，表達(dá)呈降低趨勢，暗示油菜中可能與擬南芥存在相似的調(diào)控機(jī)制，即通過調(diào)控表皮蠟質(zhì)合成。同時，發(fā)育后期表皮蠟質(zhì)合成減弱，一方面可能為蠟質(zhì)層已相對穩(wěn)定，一方面可能光合效率更高，有待進(jìn)一步研究。綜上，本研究定位了光葉調(diào)控基因，解析了甘藍(lán)型油菜光葉性狀的形成機(jī)制，這對指導(dǎo)葉片表皮蠟質(zhì)組分改良及輔助選育甘藍(lán)型油菜高光效品種具有重要意義。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜光葉新突變體M8相比野生型蠟質(zhì)葉片光合速率更高，該光葉表型受1對隱性基因控制。圖位克隆鑒定到光葉性狀調(diào)控基因?yàn)椋蛉笔Мa(chǎn)生了光葉表型。

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Genetic analysis and gene mapping of glossy leaf in

1Crop Research Institute of Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;2National Key Laboratory of Crop Genetic and Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070;3Wuhan Genoseq Technology Co., Ltd., Wuhan 430070

【Objective】Epicuticular waxes is a hydrophobic layer covering plant leaves and stems, playing an important role in stress resistance and affecting photosynthesis, growth and development. Rapeseed (L.) is one of the main oil crops in the world, but the mechanism of epicuticular waxes formation on its leaves is still unclear. This study aims to reveal the genetic mechanism of epicuticular wax on leaves through a mutant, which will help to achieve high and stable yield of rapeseed.【Method】In this study, leaf of glossy leaf mutant M8 and common waxy leaf inbred lines Zhongshuang 11 (ZS11) and the C20 were characterized, and its photosynthetic rate were measured by portable plant photosynthesis measurement system. Two F1hybrids and F2segregating populations were constructed by crossing the M8 with ZS11 and C20, respectively, and were used to analyze the heredity of leaf characters in rapeseed. The F2population hybridized by M8 and ZS11 was constructed to analyze the genetic regulation of the glossy leaf trait in rapeseed by bulked segregation analysis (BSA) combined with target-sequencing (Target-seq). Combined with comparative genome and transcriptome database, candidate genes were predicted and then verified by RT-PCR.【Result】The leaf stomatal conductance and photosynthetic efficiency were higher in the glossy leaf mutant M8, compared with ZS11 in rapeseed. The genetic analysis results showed that the glossy leaf was controlled by one pair of recessive genes and glossy leaf was recessive compared with waxy leaf. It was finally fine mapped in the physical region of 0.134-0.699 Mb on chromosome A08 by map based cloning method. Further analysis revealed that there was a large segmental deletion in the 0.22-0.58 Mb region of chromosome A08 in the M8 glossy leaf mutant compared to ZS11, and() in this region of the genome was identified as the candidate gene for the glossy leaf trait. This gene encodes a Kelch-F-box protein, and its deletion may lead to the observed glossy leaf trait in the M8 mutant, as it was highly expressed in ZS11 but none in M8. 【Conclusion】Compared with wild-type waxy leaves, the photosynthetic rate of the new glossy leaf mutant M8 was higher, and the glossy leaf phenotype was controlled by a recessive gene. In the picture, the glossy leaf phenotype regulatory gene was identified as, and deletion of the gene resulted in glossy leaf in rapeseed.

L.; glossy leaf; epicuticular wax; map-based gene cloning;

2023-07-14；

2023-08-30

甘肅省科技計劃重大項(xiàng)目（21ZD4NA022）、國家自然科學(xué)基金（31960436）、甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院列項(xiàng)目（2022GAAS54、2021GAAS13、2021GAAS43、2023GAAS43）

關(guān)志林，E-mail：zhilinggg@163.com。通信作者董云，E-mail：dongyungs@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）