劉英健 王瑞靜 常建華

肺炎克雷伯菌可引起多種感染性疾病,包括尿路感染、菌血癥和肝膿腫[1]。目前,肺炎克雷伯菌肝膿腫(KPLA)已成為一種危害全球人類生命健康的疾病[2]。肺炎克雷伯菌分為高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典型肺炎克雷伯菌,高黏液性肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出高黏性、獨特的莢膜血清型、毒力基因、序列型(ST)和耐藥譜,其誘導的肝膿腫可能導致肝外并發(fā)癥,如眼內(nèi)炎、腦膜炎和壞死性筋膜炎等[3,4]。因此,對KPLA,尤其是高黏液性肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床和微生物學特征進行系統(tǒng)調(diào)查是非常必要的。本研究對KPLA患者的臨床、微生物學和分子流行病學進行分析。

資料與方法

一、 病例來源

納入2020年6月至2022年10月北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院診斷KPLA的患者67例。診斷標準:①臨床特征;②影像證據(jù);③血液或膿液培養(yǎng)中存在肺炎克雷伯菌;④經(jīng)皮穿刺術(shù)或手術(shù)治療的證據(jù);⑤排除阿米巴、結(jié)核性肝膿腫[5]。

二、 研究方法

細菌鑒定采用BD Phoenix 100全自動細菌鑒定儀(美國BD公司),同時進行藥物敏感實驗。大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌株。根據(jù)The Clinical &Laboratory Standards Institute進行結(jié)果判定[6]。將肺炎克雷伯菌接種于5%羊血的瓊脂板,37 ℃培養(yǎng)24 h。若菌落粘液絲長度>5 mm則為高黏液性菌株。莢膜血清型基因和毒力基因引物序列信息參考文獻[7],PCR檢測莢膜血清分型基因及相關(guān)毒力基因。尋找肺炎克雷伯菌基因組7個管家基因信息及序列(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella.html),PCR擴增并測序。分析測序結(jié)果,確定菌株ST。

三、統(tǒng)計學分析

應用IBM SPSS Statistics 24.0軟件及Graphpad Prism3.0軟件行統(tǒng)計學分析。偏態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,比較采用曼-惠特尼U檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、臨床特征

67例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者住院時間為18(12～24) d。有基礎疾病16例,其中糖尿病11例,慢性肺病5例;有外傷手術(shù)史3例;肝膽疾病10例。8例患者出現(xiàn)菌血癥,1例死亡。67例患者中,高黏液性肺炎克雷伯菌感染27例,經(jīng)典型肺炎克雷伯菌感染40例,兩組在性別、年齡、實驗室檢查、基礎疾病、外傷手術(shù)史等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而高黏液性肺炎克雷伯菌組肝膽疾病、菌血癥例數(shù)均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌組(P<0.05)。見表1。

表1 高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征比較

二、高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的敏感度比較

如表2所述,除頭孢西丁、氨曲南及左氧氟沙星藥物外,高黏液性肺炎克雷伯菌對其他常用抗菌藥物敏感度均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌。

表2 高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物敏感度[株(%)]

三、高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌病原分子特征

結(jié)果顯示rmpA和aero同時存在于高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典型肺炎克雷伯菌中。高黏液性表型與高毒力基因rmpA和aero呈高度相關(guān)性。27株高黏液性肺炎克雷伯菌中,74%的菌株具有rmpA和aero基因;40株經(jīng)典型肺炎克雷伯菌中,7.6%的菌株具有rmpA和aero基因。2組其他毒力基因檢出率并無明顯差異。2組均未檢出非K1和K2莢膜血清型,高黏液性肺炎克雷伯菌中,血清型K1及K2比例均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌,見表3。

表3 高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯莢膜血清型及毒力基因分析[株(%)]

四、肺炎克雷伯菌MLST分型

MLST顯示在67株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了10種序列類型。以ST23為主(32.8%,22/67),其次為ST30(7.5%,5/67)、ST65(14.9%,10/67)、ST217(7.5%,5/67)、ST367(7.5%,5/67)和其他ST。高黏液性肺炎克雷伯菌共7種序列表現(xiàn)(ST23、ST30、ST217、ST420、ST680、ST774及ST2460),表明其可能是多克隆傳播,ST23所占比例最大(37.3%,10/27)。經(jīng)典型肺炎克雷伯菌有8種序列表現(xiàn),包括ST23、ST30、ST65、ST367、ST420、ST660、ST680及ST774,其ST23所占比例最大(30,12/40)。2者共同擁有的ST表型為ST23、ST30、ST680和ST774。

討 論

肺炎克雷伯菌是一種強致病菌,嚴重威脅人類生命,特別是高黏液性肺炎克雷伯菌致病性更強[7-9]。本研究中,高黏液性肺炎克雷伯菌的檢出率與之前的報道接近[10]。文獻報道,糖尿病是KPLA的一個重要危險因素,如果血糖控制不佳會損傷中性粒細胞的吞噬功能,促進病原體在組織中的生長,而代謝紊亂可能會對肝臟產(chǎn)生負面影響。本研究中,男性、糖尿病、肝膽疾病和外傷史是發(fā)生KPLA的因素,這與流行病學趨勢相似[11,12]。因此,對KP-PLA患者應嚴格監(jiān)測和控制血糖水平。目前關(guān)于伴有肝膽疾病或外傷手術(shù)史的KPLA患者并不少見,一種可能的解釋是肺炎克雷伯菌容易通過直接傳播、門脈循環(huán)或穿過腸道屏障進入肝臟,引起KPLA和嚴重的肺炎克雷伯菌感染[13-15]。進一步分析發(fā)現(xiàn),高黏液性肺炎克雷伯肝膿腫患者發(fā)生肝膽疾病及菌血癥的概率大于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌肝膿腫,這表明高黏液性肺炎克雷伯菌的致病性要高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌。

研究表明,高粘滯性和超強毒力之間的對應關(guān)系是可變的,因此需要對來自KPLA的分離株的毒力應結(jié)合基因型和臨床特征進行評估[16]。目前已知肺炎克雷伯菌有77種莢膜血清K抗原,其中K1和K2血清型能合成細胞莢膜,具有很強的抗細胞吞噬能力,對機體殺傷的能力遠大于非KI和K2型[17]。在本研究中,K1和K2的流行率分別為44.5%和33.4%,這表明來自KPLA的大部分分離物是超強毒力的。67株肺炎克雷伯菌含有不同的毒力基因,反映大部分肺炎克雷伯菌都表現(xiàn)出超強毒力和較強的致病力。同時,非K1/K2分離株也在KPLA中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,這些分離株也可能是超強毒力。其中,rmpA是細胞外莢膜多糖合成過程中的一個重要基因,其是超強毒力最重要的基因。rmpA的去除可能導致包膜的丟失或變薄,從而削弱逃避免疫反應的能力,從而使肺炎克雷伯菌的毒力顯著降低。aero通過競爭獲取宿主組織中的鐵以增強其存活能力。有文獻報道,在動物模型中 aero可增加肺炎克雷伯菌的毒力[18]。在本研究中,高黏液性肺炎克雷伯肝膿腫分離株中的rmpA與 aero基因遠遠高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌分離株。從微生物學的角度來看,不應忽視毒力因子在KPLA分離株中的檢測價值,特別是在結(jié)合抗生素耐藥性的情況下。同時對毒力因子的探索可能為hvKp感染提供新的治療靶點和開發(fā)新的疫苗,而不僅僅局限于KPLA的管理[19]。有研究表明高黏液性菌株對抗生素耐藥比較罕見[20],本研究中hvKP對大多數(shù)抗生素的敏感度高于cKP。此外,從KPLA分離的肺炎克雷伯菌對幾乎所有抗菌藥物都高度敏感,這可能與KPLA中豐富的hvKp有關(guān)。在67株菌株中,一共鑒定出10種ST型,其中ST23型和ST65型最普遍。高黏液性菌株和經(jīng)典菌株有共同的ST型別,表明這兩種類型的肺炎克雷伯菌具有相同的遺傳背景。

綜上所述,患者感染 hvKP更容易并發(fā)菌血癥。臨床檢測應注意肺炎克雷伯菌的黏液性狀、莢膜血清型和抗菌藥物敏感性,從而幫助臨床醫(yī)師迅速有效診斷及治療。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。