熊敏莉 龔曉媛 萬(wàn)舒淇 羅聲政

肝纖維化是各種肝臟疾病不斷進(jìn)展的共同階段,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等[1-3]。當(dāng)肝臟遭受外界損傷后,肝細(xì)胞會(huì)釋放大量細(xì)胞因子,招募巨噬細(xì)胞遷移至肝臟,并且誘發(fā)肝星狀細(xì)胞由靜息態(tài)轉(zhuǎn)換成活化態(tài)。肝星狀細(xì)胞是肝纖維化進(jìn)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞,當(dāng)肝星狀細(xì)胞活化后,細(xì)胞內(nèi)將合成大量的膠原纖維并沉積在細(xì)胞基質(zhì)中。肝小葉中的膠原纖維不斷沉積會(huì)破壞原有正常肝小葉結(jié)構(gòu),導(dǎo)致肝臟假小葉生成,嚴(yán)重?fù)p害肝臟的正常功能[4-5]。肝星狀細(xì)胞的激活是肝臟遭遇損傷的自我修復(fù)過(guò)程,細(xì)胞外基質(zhì)的膠原合成與分解是處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中的。因此肝星狀細(xì)胞的活化與凋亡是調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵因素。目前一般認(rèn)為,當(dāng)外界損傷因素消失后,早期的肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。但持續(xù)的肝纖維化進(jìn)程會(huì)導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌,嚴(yán)重影響人類的健康[6-7]。因此探究緩解甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的分子機(jī)制有著十分重要的意義。

性別決定區(qū)域Y相關(guān)的高遷移率族框9基因(SRY-related high mobility group-box gene 9)是SOX基因家族的重要成員。SOX基因家族是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體損傷修復(fù)等功能中發(fā)揮著重要的作用[8-9]。但是目前SOX9基因是否在肝纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮了作用尚不明確。本研究評(píng)估SOX9基因在肝纖維化中可能發(fā)揮的潛在作用。

材料與方法

一、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。LX2細(xì)胞系購(gòu)買(mǎi)于武漢普諾賽生物科技有限公司,高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Gibco生物科技公司,用于構(gòu)建肝纖維化小鼠模型的四氯化碳及玉米油等試劑購(gòu)買(mǎi)自阿拉丁生物科技有限公司。用于敲減細(xì)胞SOX9基因表達(dá)的小干擾RNA購(gòu)買(mǎi)自上海吉瑪生物科技有限公司,Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen生物科技公司。用于qPCR檢測(cè)的引物購(gòu)買(mǎi)自上海生工生物技術(shù)有限公司,SYBR mix試劑盒購(gòu)買(mǎi)自上海翌圣生物科技有限公司。用于Western Blot的抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam生物科技公司。

二、方法

(一)動(dòng)物模型構(gòu)建 肝纖維化小鼠模型被分為兩組,即對(duì)照組和肝纖維化造模組。12只6周齡大小的雄性C57BL/6J小鼠被隨機(jī)分配至兩個(gè)組中,每組6只。每組小鼠每周分別注射三次15%的四氯化碳或等量玉米油,注射量為2 μL/g體質(zhì)量,持續(xù)注射六周。造模完成后,收集小鼠血清及肝臟標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(二)肝臟組織病理檢查及肝酶檢測(cè) 造模完成后,取適當(dāng)大小的肝臟組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定48小時(shí)。固定完成后將肝臟組織放置于包埋盒中,使用自動(dòng)脫水機(jī)將肝組織進(jìn)行脫水。脫水完成后的肝組織放置于溶解的石蠟池中進(jìn)行包埋,制成肝組織石蠟塊。將包埋于石蠟塊肝組織以5 μm的厚度切片制成白片,以用于組織切片染色。

將制成的肝組織石蠟切片經(jīng)由烤片、脫蠟、水化步驟后,將切片按照HE染色試劑盒及天狼星紅染色試劑盒說(shuō)明書(shū)相應(yīng)步驟進(jìn)行切片染色。染色完成后使用中性樹(shù)膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織染色情況,并拍照存檔。

(三)LX2細(xì)胞培養(yǎng)及活化誘導(dǎo) 以10%胎牛血清+1%雙抗的比例加入高糖DMEM培養(yǎng)基中,配制成完全培養(yǎng)基,將LX2細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中置于37 ℃、50% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%左右,細(xì)胞形態(tài)良好時(shí),行細(xì)胞接種。棄去原培養(yǎng)基,用PBS潤(rùn)洗培養(yǎng)皿中加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞,以1×105密度將細(xì)胞接種于12孔板中,使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為兩組即靜息組與活化組,在活化組使用5 ng/mL濃度的TGFβ1細(xì)胞因子刺激LX2細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞活化。

(四)RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá) 建模后的小鼠組織及轉(zhuǎn)染后的LX2細(xì)胞按照說(shuō)明書(shū)使用TRIZOL提取總RNA,使用分光度儀器檢測(cè)RNA濃度以及純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫(kù)用于qPCR檢測(cè)。使用SYBR Premix染料進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參檢測(cè),相對(duì)表達(dá)量為2-△△Ct計(jì)算組織及細(xì)胞內(nèi)各目的基因的相對(duì)表達(dá)。內(nèi)參基因及目的基因均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。使用的各基因擴(kuò)增引物序列見(jiàn)下表1。

表1 qPCR相關(guān)引物序列

三、統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用GraphPad軟件進(jìn)行作圖。兩組之間的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異使用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肝纖維化小鼠模型組織染色情況

與造模組比,HE染色可見(jiàn)對(duì)照組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞形態(tài)良好,排列整齊,沿小葉中央靜脈放射狀分布,無(wú)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。造模組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)明顯被破壞,肝細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)于肝臟血管周圍。Masson染色顯示,對(duì)照組小鼠肝臟內(nèi)無(wú)明顯膠原沉積,造模組小鼠中出現(xiàn)了大量藍(lán)色膠原纖維沉積于肝小葉中,肝臟正常結(jié)構(gòu)被明顯破壞,出現(xiàn)了明顯肝纖維化的表現(xiàn)。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色(×100)、Masson染色結(jié)果(×100)

二、肝纖維化小鼠模型中,膠原相關(guān)基因及SOX9基因表達(dá)明顯上升

檢測(cè)二組小鼠肝臟組織中膠原相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果表明(表1)與對(duì)照組相比,造模組小鼠肝臟中膠原合成的標(biāo)志基因α-SMA(造模組:2.568±0.726 vs對(duì)照組:1.000±0.272,t=4.518,P=0.002)與Col1(造模組:3.125±0.775 vs對(duì)照組:1.000±0.398,t=5.454,P=0.001)的表達(dá)明顯上升,這表明纖維化小鼠肝臟中的膠原生成明顯增加,小鼠肝臟出現(xiàn)明細(xì)纖維化表現(xiàn)。此外SOX9基因的表達(dá)也在造模組中顯著升高(造模組:1.986±0.643 vs對(duì)照組:1.000±0.288,t=3.126,P=0.014)。SOX9基因的異常升高提示其可能參與小鼠肝纖維化的進(jìn)展。

三、活化的肝星狀細(xì)胞中,膠原合成相關(guān)基因及SOX9基因表達(dá)顯著上升

本研究使用5 ng/mL濃度的TGFβ1因子刺激LX2細(xì)胞48 h誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化,發(fā)現(xiàn)LX2細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志膠原生成的α-SMA(活化組:1.856±0.342 vs對(duì)照組:1.000±0.191,t=4.874,P=0.001)與Col1(活化組:2.133±0.494 vs對(duì)照組:1.000±0.129,t=4.963,P=0.001)基因表達(dá)都出現(xiàn)了顯著升高(表2)。與肝纖維化小鼠模型相似,活化的LX2細(xì)胞中SOX9基因的表達(dá)也上升了1.718倍(表2),進(jìn)一步表明了SOX9基因可能在小鼠肝纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。

表2 qPCR檢測(cè)各組小鼠肝組織膠原合成基因及SOX9基因相對(duì)表達(dá)

四、在LX2細(xì)胞中敲減SOX9基因后,膠原合成與細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)降低

為了進(jìn)一步了解SOX9基因在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮的作用,我們?cè)诨罨母涡菭罴?xì)胞中轉(zhuǎn)染了SOX9小干擾RNA來(lái)降低活化LX2細(xì)胞內(nèi)SOX9基因的表達(dá)。經(jīng)小干擾RNA轉(zhuǎn)染后,LX2細(xì)胞內(nèi)SOX9基因的表達(dá)將為原來(lái)的0.32倍(表3),小干擾RNA敲減效果良好。隨后我們檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膠原合成相關(guān)基因α-SMA(活化組:0.621±0.142 vs對(duì)照組:1.000±0.188,t=3.590,P=0.007)及Col1(活化組:0.558±0.170 vs對(duì)照組:1.000±0.130,t=4.608,P=0.002)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因均出現(xiàn)了顯著降低(表3)。此外細(xì)胞增殖的相關(guān)基因CyclinD1(活化組:0.614±0.106 vs對(duì)照組:1.000±0.166,t=4.392,P=0.002)和PCNA(活化組:0.525±0.138 vs對(duì)照組:1.000±0.234,t=3.897,P=0.005)的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯下降(表3),這表明細(xì)胞增殖也被顯著抑制。以上的結(jié)果表明,在體外模型中SOX9基因可以調(diào)控活化的LX2細(xì)胞的活化與增殖,敲減LX2細(xì)胞中的SOX9基因有可能起到緩解肝纖維化的作用。

表3 qPCR檢測(cè)LX2細(xì)胞膠原合成基因及SOX9基因相對(duì)表達(dá)

表4 敲減SOX9基因后檢測(cè)細(xì)胞活化與增殖相關(guān)基因

討 論

肝纖維化是不同肝臟疾病進(jìn)展的共同階段,持續(xù)的肝纖維化進(jìn)展常伴隨著多種預(yù)后不良的表現(xiàn),如肝硬化、門(mén)脈高壓、肝性腦病、肝腎綜合征等,嚴(yán)重影響了人類的健康[10-11]。目前慢性肝病已經(jīng)成為了慢性疾病的最主要原因之一,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等都是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展的終末階段,但是目前仍沒(méi)有有效的治療手段。因此深入探討肝纖維化的病理生理學(xué)機(jī)制并且尋找到有效的治療靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

目前對(duì)于肝纖維化的治療主要是以病因治療及對(duì)癥治療為主。針對(duì)病毒性肝炎主要是對(duì)應(yīng)的抗病毒治療治療,NAFLD則是飲食習(xí)慣的調(diào)整及運(yùn)動(dòng)改善,自身免疫性肝病則是相對(duì)應(yīng)的激素及膽汁酸治療。但是這些治療手段都有一定的局限性,因此尋找肝纖維化的治療靶點(diǎn)有很好臨床轉(zhuǎn)化研究意義。在本項(xiàng)研究中,我們構(gòu)建了肝纖維化小鼠模型以及使用了LX2人肝星狀細(xì)胞系來(lái)評(píng)估SOX9基因在肝纖維化中發(fā)揮的作用。首先我們使用經(jīng)典的四氯化碳腹腔注射的方向構(gòu)建肝纖維化小鼠模型以及使用TGFβ1誘導(dǎo)LX2細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞活化。我們發(fā)現(xiàn)在纖維化的小鼠肝臟及活化的LX2細(xì)胞中,SOX9基因出現(xiàn)了明顯的上升。因此我們推測(cè)SOX9基因可能參與了肝纖維化的進(jìn)展。隨后我們?cè)诨罨腖X2細(xì)胞中敲減了SOX9基因的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)膠原合成的相關(guān)基因α-SMA、Col1的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯下降,這表明肝星狀細(xì)胞的活化受到了顯著的抑制。此外細(xì)胞增殖的相關(guān)基因包括PCNA、CyclinD1的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯下降,這表明肝星狀細(xì)胞的增殖也被明顯抑制。肝星狀細(xì)胞細(xì)胞的活化與增殖是肝纖維化進(jìn)展中最主要的標(biāo)志事件。結(jié)果表明敲減SOX9基因可以顯著抑制這一過(guò)程。

SOX9基因是SOX基因家族的重要成員之一。SOX基因家族是一類與胚胎發(fā)育相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,由于這個(gè)基因家族與男性Y染色體上的SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因同源而得名[12]。SOX9基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了在心肌纖維化和肺纖維化中都發(fā)揮了重要的作用。Gu等[13]的研究發(fā)現(xiàn)敲低SOX9可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕氣管纖維化,Raza等人[14]的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9基因可以通過(guò)激活NAV3驅(qū)動(dòng)腎臟成纖維細(xì)胞的激活,導(dǎo)致腎纖維化。Scharf等[15]的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9基因在心肌纖維化的進(jìn)程中同樣發(fā)揮了重要的作用,高表達(dá)的SOX9基因可以顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的的炎癥反應(yīng),促進(jìn)纖維化的進(jìn)展。

目前SOX9基因在肝纖維化中的作用尚不明確,因此我們的研究證明了SOX9基因在肝纖維化的進(jìn)程中表達(dá)明顯提升,敲減SOX9基因后肝星狀細(xì)胞的活化與增殖受到了顯著的抑制,肝纖維化可以得以緩解,這些結(jié)果提示SOX9基因可能成為治療肝纖維化重要的治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。