李玉巍

(青海省藥品檢驗檢測院,青海 西寧 810000)

肝臟是一個具有廣泛功能的重要器官,其功能包括葡萄糖、蛋白質和脂質代謝的穩(wěn)態(tài)、膽汁的產生、關鍵血清蛋白的合成及內源性和外源性毒素的代謝〔1,2〕。急性肝損傷經常由酒精、藥物和其他因素引起,導致細胞損傷或死亡〔3〕。急性肝損傷發(fā)生率逐年上升〔4〕。垂盆草在中國傳統(tǒng)上用于治療各種炎癥性疾病,尤其對急性肝損傷有保護作用〔5,6〕,但其主要活性成分及作用的分子機制研究甚少。中醫(yī)藥網(wǎng)絡藥理學是一種新的跨學科中藥研究方法,可用于發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥的活性成分,設想中醫(yī)藥的作用靶點,并探索中醫(yī)藥作為疾病治療的機制,這種研究方法將中醫(yī)藥從經驗醫(yī)學轉變?yōu)檠C醫(yī)學〔7,8〕。通過網(wǎng)絡藥理學,可更直觀掌握垂盆草與急性肝損傷之間的相互作用。本研究基于網(wǎng)絡藥理學,探究垂盆草保護肝細胞損傷的主要作用靶點,為垂盆草的臨床推廣提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料 異鼠李素(批號110860-202012,純度≥98%)購自國藥品生物制品檢定所;白細胞介素(IL)-17信號通路激活劑SR0987購自上海碧云天;胎牛血清購自杭州四季青;人正常肝細胞HepaRG購自美國菌種保藏中心;DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO;四氯化碳(CCl4,分析純)購自上海聯(lián)化化工;人乳酸脫氫酶(LDH)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海古朵生物;人谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒、人谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒、蘋果酸脫氫酶(MDH)檢測試劑盒均購自上海江萊生物;CCK8試劑盒購自日本同仁;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自日本Takera;RT-q聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自北京康為世紀。

1.2構建中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡藥理圖 首先在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID,http：//bidd.group/TCMID/)數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“垂盆草”,下載活性成分。篩選口服生物利用度(OB)在30%以上,藥物相似性(DL)在0.18以上的有效成分。下載垂盆草對應的靶點,篩選有效成分對應的靶基因,刪除重復基因。UniProt(https：//www.uniprot.org)去除非人源基因。疾病相關的基礎與突變位點數(shù)據(jù)庫(DisGeNET,http：//www.disgenet.org/)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM,https：//omim.org/)搜索關鍵詞“肝損傷”的靶點,去重后與垂盆草有效成分靶點取交集。使用Cytoscape3.7.1繪制中藥-有效成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3京都基因組百科全書(KEGG)富集分析和基因本體論(GO)富集分析 通過KOBAS(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn)、DAVID2021(https：//david-d.ncifcrf.gov/)軟件分析KEGG、GO富集。篩選條件為P<0.001,以P值為準降序排列,選取前16個KEGG通路分析;P<0.001,以P值為準降序排列,各選取前5個生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)分析。使用R4.0.2,安裝bioconductor中的clusterProfiler、enrichplot、ggplot2、DOSE包繪制KEGG氣泡圖、GO柱狀圖。

1.4HepaRG細胞培養(yǎng)、分組 使用含有10%胎牛血清+1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepaRG細胞,條件為37 ℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)液。將正常培養(yǎng)的HepaRG細胞設為空白組;模型組、模型+0 μmol/L組使用800 μl的CCl4溶液(100 mmol/L)培養(yǎng)2 h;模型+0 μmol/L組、模型+10 μmol/L+二甲基亞砜(DMSO)組、模型+10 μmol/L+SR0987組分別使用0 μmol/L異鼠李素、10 μmol/L異鼠李素+0.1%DMSO、10 μmol/L異鼠李素+SR0987(10 nmol/L)培養(yǎng)24 h,再加入800 μl的CCl4溶液處理2 h。

1.5肝細胞損傷生化指標的檢測 收集細胞,取上清液,按照ALT、AST、LDH、MDH檢測試劑盒的說明書要求操作,分析樣品中ALT、AST、LDH、MDH含量。

1.6肝細胞增殖、凋亡的檢測 收集細胞,取200 μl 1×104～2×104個細胞置于96孔板,再加入10 μl的細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)溶液,37 ℃避光孵育20 min。使用光密度(OD)490 nm波長檢測細胞吸光度(OD490)。細胞增殖率(%)=OD490目標組/OD490對照組×100%。將收集的細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5次,再用500 μl結合緩沖液懸浮細胞。依次加入5 μl的Annexin Ⅴ/FITC、PI,先后避光孵育10 min。結束后,過300目篩,上流式細胞儀檢測分析細胞凋亡。細胞總凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.7肝細胞IL-17信號通路活性的檢測 收集細胞,Trizol液提取總RNA,并將其逆轉錄為cDNA,使用qPCR實驗檢測其中IL-17相對表達量。IL-17上游引物AGATTACTACAACCGATCCACCT,下游GGGGACAGAGTTCATGTGGTA;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物ACAACTTTGGTATCGTGGA AGG,下游GCCATCACGCCACAGTTTC。反應設置為：95 ℃,15 min,95 ℃,20 s,58.5 ℃,30 s,41個循環(huán)。使用RIPA裂解液,冰上裂解30 min,提取總蛋白,并對其定量、變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結束后,將蛋白濕轉至NC膜。轉膜過程中裝置維持0 ℃。封閉NC膜,滴加1 000被稀釋的兔抗IL-17多抗,4 ℃冰箱孵育過夜。取出膜,清洗后滴加500被稀釋的二抗,37 ℃孵育2 h。清洗膜,滴加電化學發(fā)光(ECL)顯色液,顯影曝光。ImagJ分析蛋白的灰度值。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件分析處理,Graphpad Prism8.0繪制圖片。實驗重復3次,每次做3個平行復孔。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1垂盆草有效成分 通過TCMSP、TCMID得到垂盆草的有效成分47個,其中OB≥30%且DL≥0.18的有5個,見表1。

表1 垂盆草化合物基本信息

2.2垂盆草有效成分-靶點網(wǎng)絡 TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫得到垂盆草有效成分異鼠李素、槲皮素、β谷甾醇、木犀草素、DFV,共302個靶點。DisGeNET、 OMIM搜索到急性肝損傷的398個靶點,與有效成分靶點交集部分共有177個靶點。通過Cytoscape3.8.0繪制成分靶點圖,見圖1。

圖1 中藥-有效成分-基因靶點-疾病網(wǎng)絡

2.3GO和KEGG富集分析 GO有2 069個,符合P值小于0.001的有250個。篩選BP、CC、MF前10個繪制柱狀圖,見圖2。KEGG富集通路240條,篩選出P值小于0.001的通路155個,選前16個繪制KEGG富集通路氣泡圖,見圖3。IL-17信號通路為富集率最高,差異最顯著的通路。

圖2 基因的GO富集分析

2.4異鼠李素對CCl4誘導HepaRG細胞存活的作用 與空白組相比,模型組細胞增殖率顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型+0 μmol/L組相比,模型+10 μmol/L組細胞增殖率顯著升高,凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4、表2。

圖4 各組HepaRG細胞凋亡

表2 各組細胞損傷生化指標、增殖、凋亡、IL-17 mRNA及蛋白表達比較

2.5異鼠李素對CCl4誘導HepaRG細胞損傷生化指標的影響 通過CCl4構建HepaRG細胞損傷模型,檢測異鼠李素處理后細胞損傷標志物的變化。與空白組相比,模型組細胞ALT、AST、LDH、MDH含量均顯著升高(P<0.05);與模型+0 μmol/L組相比,模型+10 μmol/L組細胞ALT、AST、LDH、MDH含量均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.6異鼠李素對CCl4誘導HepaRG細胞IL-17表達的影響 與空白組相比,模型組細胞IL-17 mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05);與模型+0 μmol/L組相比,模型+10 μmol/L組細胞IL-17 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見表2、圖5。

1～6：空白組、模型組、模型+0 μmol/L組、模型+10 μmol/L組、模型+10 μmol/L+DMSO組、模型+10 μmol/L+SR0987組圖5 Western印跡檢測各組IL-17蛋白表達

2.7激活IL-17信號通路對異鼠李素抗CCl4誘導HepaRG細胞損傷作用的影響 與模型+10 μmol/L+DMSO組相比,模型+10 μmol/L+SR0987組細胞IL-17 mRNA和蛋白表達均顯著升高,ALT、AST、LDH、MDH含量也顯著升高,細胞增殖率顯著降低,凋亡率顯著升高(均P<0.05)。可見,IL-17信號通路激活劑SR0987可部分逆轉異鼠李素對受損肝細胞的保護作用。見圖4、圖5、表3。

表3 SR0987減弱異鼠李素對CCl4誘導HepaRG細胞損傷的保護作用

3 討 論

從古至今,垂盆草在肝臟疾病的治療功效一直得到普遍認可。但是,其發(fā)揮作用的機制仍需繼續(xù)研究。Hao等〔9〕報道,垂盆草提取物治療脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(GalN)誘導的小鼠急性肝損傷后,小鼠血清肝損傷標志物ALT、AST顯著降低,存活率明顯提高,其機制為上調肝組織中miR-124,進而抑制下游靶基因Hedgehog表達、高遷移率族蛋白(HMGB)1信號通路的活性,減少肝臟的炎性損傷。Wang等〔10〕發(fā)現(xiàn),垂盆草對肝損傷后血清ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉移酶(GGT/γ-GT)、膽紅素(DBiL)、總膽紅素(TBiL)、血清白蛋白(ALB)和三磷酸腺苷(ATP)水平的升高及α-萘異硫氰酸酯(ANIT)引起的膽汁抑制均有明顯的治療作用,并且其還可減輕ANIT誘導的肝臟病理損傷,其機制與促進核因子E2相關因子(Nrf)2抗氧化防御和抑制核轉錄因子(NF)-κB炎癥反應有關。Jiang等〔11〕基于網(wǎng)絡藥理學研究垂盆草的藥物性肝損傷作用發(fā)現(xiàn),IL-β、MARK14、SSP1和基質金屬蛋白酶(MMP)9基因是垂盆草與藥物性肝損傷之間相互作用的主要調節(jié)者,通過體內和體外的實驗研究驗證垂盆草抑制藥物性肝損傷小鼠炎性因子的分泌及Nrf2/抗氧化反應元件(ARE)信號通路的活性,保護乙酰氨基酚(APAP)誘導的正常肝細胞的增殖,抑制其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),異鼠李素是垂盆草的主要活性成分,其直接作用34個靶基因;通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),IL-17信號通路可能是垂盆草發(fā)揮藥理作用的關鍵信號通路,且異鼠李素對肝細胞的損傷確實具有保護作用。這與蔣志濤等〔12〕的研究結果相吻合。本研究結果顯示,IL-17信號通路在異鼠李素保肝功能中可能具有重要作用。

IL-17A也稱IL-17,其在人類多種疾病中的促炎癥作用得到了廣泛關注〔13〕。Zhang等〔14〕發(fā)現(xiàn),IL-17A拮抗劑具有在體內抑制膽管結扎或硫代乙酰胺誘導的小鼠肝臟纖維化、炎癥作用,這與IL-17A激活肝細胞中信號轉導和轉錄激活因子(STAT)3的活性,抑制自噬相關,揭示IL-17A/STAT3信號通路通過抑制肝細胞的自噬在肝纖維化過程中起關鍵作用,阻斷該通路可能為肝纖維化治療的有效途徑。Xu等〔15〕發(fā)現(xiàn),基因消融IL-17A或阻斷IL-17信號通路不僅可抑制酒精依賴小鼠的自愿飲酒,還可減輕酒精誘導的肝細胞和神經損傷,說明IL-17A是過量飲酒和酒精誘導的肝/腦損傷的常見介質,靶向抑制IL-17A可能為治療酒精誘導的病理損傷的一種新策略。Wree等〔16〕研究報道,在Nod樣受體蛋白(NLRP)聯(lián)合IL-17A或腫瘤壞死因子(TNF)敲除的小鼠中,僅NLRP敲除的小鼠表現(xiàn)嚴重的肝臟炎性損傷,而IL-17A或TNF突變體敲除的小鼠表現(xiàn)出相對較少的炎性損傷;另外,NLRP相關的肝臟炎癥反應可通過IL-17A或TNF的敲除得到顯著的抑制,且IL-17A敲減的小鼠肝纖維化得到明顯改善,而TNF敲減的小鼠并未發(fā)生肝纖維化的改善。這些研究揭示IL-17為髓系細胞中激活NLRP3炎性小體誘導肝臟炎癥和纖維化的重要媒介。本研究結果說明,IL-17信號通路的激活在肝細胞的損傷過程中起關鍵作用,提示IL-17信號通路抑制劑的潛在藥用價值。

綜上,垂盆草主要活性成分異鼠李素可減少肝細胞的損傷,促進肝細胞的增殖,抑制凋亡,其機制與抑制IL-17信號通路的活性相關,為異鼠李素用于急性肝損傷的臨床治療奠定實驗基礎。