李光淳 李高峰 張兆琦 玄鋒學 杜彥輝 吳東輝 張揚

(吉林省人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,吉林 長春 130021)

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以持續(xù)性滑膜炎癥為主要特征的自身免疫性疾病,關節(jié)功能下降、腫脹、疼痛是其主要臨床表現(xiàn),我國RA患病率約為0.35%〔1〕。RA的持續(xù)進展可導致滑膜炎,使增生組織入侵骨骼或軟骨進而引起骨骼、軟骨損傷甚至殘疾,病程大于15年RA患者的致殘率高達61.3%,嚴重影響患者生活質(zhì)量〔2〕。氨甲蝶呤及地塞米松等是目前臨床治療RA的一線藥物,雖然可以在一定程度上緩解RA疼痛癥狀,并減輕炎癥反應,但長期使用會對骨髓、肝臟、腎臟等器官和組織產(chǎn)生嚴重的毒副作用〔3〕。因此,尋找安全有效、低毒副作用的抗RA成分的藥物具有重要意義。

枸杞是我國重要的藥食同源植物和經(jīng)濟作物,也是常用的滋補類藥材,主要種植于我國新疆、寧夏、甘肅、青海等西北地區(qū)〔4〕。現(xiàn)代營養(yǎng)學及植物化學研究發(fā)現(xiàn)〔5,6〕,多糖、多酚、花色苷、黃酮、類胡蘿卜素、脂肪酸、生物堿等是枸杞的主要活性成分,其中枸杞多糖含量最為豐富,枸杞多糖調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、緩解疲勞、減輕肝損傷、延緩衰老及治療腫瘤等多種功效被廣泛報道。趙飛等〔7〕研究發(fā)現(xiàn),在膝骨關節(jié)炎模型兔中,枸杞多糖可有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶3和CD151的高表達,進而發(fā)揮減緩骨性關節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的作用。蔡松濤等〔8〕研究證實,骨關節(jié)炎軟骨細胞經(jīng)枸杞多糖處理后,核因子(NF)-κB、白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平均降低,提示枸杞多糖具有抑制NF-κB信號通路改善骨關節(jié)炎炎癥損傷的作用。枸杞多糖對RA同樣具有改善作用,其機制主要與改變腸道菌群的組成、升高細菌代謝產(chǎn)物s-腺苷蛋氨酸、誘導宿主腸上皮組織中RA相關基因的DNA高甲基化等有關〔9,10〕。Toll樣受體(TLR)4/NF-κB信號通路是介導RA炎癥反應的關鍵點,與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關〔11,12〕。然而,關于枸杞多糖介導TLR4/NF-κB信號通路對RA相關研究未見報道。本研究通過Ⅱ型膠原聯(lián)合完全弗氏佐劑誘導建立關節(jié)炎大鼠模型,在進一步明確枸杞多糖改善大鼠RA作用基礎上,分析其對炎癥反應及TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 枸杞多糖購自山東正虹生物科技有限公司(批號20221104);氨甲蝶呤購自通化茂祥制藥有限公司(國藥準字H22022674);牛Ⅱ型膠原蛋白(貨號234183-M)、完全弗氏佐劑(貨號AR001)購自美國Sigma公司;蘇木素-伊紅(HE,貨號WH1145)染色試劑盒購自上海卓立生物科技有限公司;TNF-α(貨號ER1393)、IL-1β(貨號ER1094)、IL-6(貨號ER1105)檢測試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司;Trizol試劑(貨號abs60154)購自上海愛必信生物科技有限公司;SYBR Green qPCR Mix(貨號P2092)購自上海諾寧生物科技有限公司;TLR4(貨號CSB-PA080181)、髓樣分化因子(MyD)88(貨號CSB-PA003338)、磷酸化(p)-NF-κB(貨號CSB-PA000581)、NF-κB(貨號CSB-PA441503)、β-肌動蛋白(β-actin,貨號CSB-PA07675A0)多克隆抗體及IgG二抗(貨號CSB-NP005301)購自武漢華美生物工程有限公司。EL204型分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司;415D型低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司;Von Frey型纖維絲測痛儀購自青島佳鼎分析儀器有限公司;37370型熱刺痛儀購自上海玉研科學儀器有限公司;2H12003型顯微鏡購自日本Olympus公司;SpectraMax i3x型酶標分析儀購自美國Molecular Devices公司;Step One Plus型實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)儀購自美國Thermo公司;DYCZ-25D型蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自北京六一生物科技公司;Universal Hood Ⅱ 型成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2模型建立、分組及治療 雄性SD大鼠60只,SPF級,體質(zhì)量200～220 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司〔SCXK(遼)2020-0001〕。SD大鼠飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心〔SYXK(吉)2021-0030〕,自由采食、飲水,濕度30%,溫度23～25 ℃,正常晝夜節(jié)律,保持環(huán)境通風。本研究經(jīng)吉林省人民醫(yī)院倫理委員會審核批注(審批號：20221025-01)。SD大鼠適應環(huán)境1 w后,按體質(zhì)量隨機分為正常組(n=10)及建模組(n=50)。大鼠關節(jié)炎模型的建立參考文獻〔13〕,牛Ⅱ型膠原蛋白與相同體積的完全弗氏佐劑充分混合后(質(zhì)量濃度1 mg/ml)在4 ℃下過夜放置,待完全乳化,保存?zhèn)溆?。建模組大鼠右后足跖下區(qū)注射0.1 ml上述乳劑,7 d后相同劑量在尾根部再次注射進行免疫。正常組相同位置注射等體積生理鹽水,當四肢甚至尾部紅腫即為建模成功。選取建模成功的大鼠40只,分為模型組、枸杞多糖低、高劑量組及氨甲蝶呤組各10只。第2次免疫24 h后開始治療,枸杞多糖低、高劑量組灌胃200、400 mg/kg的枸杞多糖〔14〕,氨甲蝶呤組灌胃3.8 mg/kg氨甲蝶呤〔15〕,1次/d,持續(xù)28 d;正常組及模型組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3足趾腫脹度測定及關節(jié)炎評分 從第2次免疫(治療第0天)開始,每隔7 d采用水容積法〔16〕測量大鼠足趾腫脹度。通過5級評分法〔17〕每隔7 d計算關節(jié)炎評分,踝關節(jié)、小趾關節(jié)無紅腫和炎癥計為0分,小趾關節(jié)有輕微紅腫計為1分,足趾及小趾關節(jié)均有紅腫計為2分,足趾全部紅腫計為3分,全部足爪紅腫甚至變形計為4分。

1.4機械性痛閾及熱刺激縮足反射潛伏期檢測 通過纖維絲測痛儀檢測各組機械性痛閾;通過熱刺痛儀檢測熱刺激縮足反射潛伏期。

1.5足關節(jié)滑膜組織病理觀察 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血后分離血清,分裝后保存于-80 ℃冰箱中。剖取足關節(jié)滑膜組織,固定后制成5 μm石蠟組織切片,常規(guī)HE染色〔18〕,用顯微鏡觀察足關節(jié)滑膜組織病理形態(tài)。

1.6血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量檢測 取凍存的血清,按照試劑盒說明書中的操作步驟采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.7足關節(jié)滑膜組織mRNA表達檢測 采用RT-qPCR檢測足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達〔19〕。足關節(jié)滑膜組織mRNA通過Trizol試劑提取,并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,引物序列為：TNF-α上游：5′-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3′,下游：5′-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3′;IL-1β上游：5′-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3′,下游：5′-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3′;IL-6上游：5′-CAGACTCGCGCCTCTAAGGAGT-3′,下游：5′-GATAGCCGATCCGTCGAA-3′;β-actin上游：5′-CCTTCCTTCTTGGGTATGG-3′,下游：5′-TGTTGGCATAGA GGTCTTTAC-3′。擴增條件：94 ℃、5 min,94 ℃、40 s,60 ℃、40 s,72 ℃、60 s,共40個循環(huán);72 ℃、10 min。擴增體系總體積20 μl,其中ddH2O 8 μl,cDNA 1 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,SYBR Green qPCR Mix 10 μl。通過2-ΔΔCt方法計算足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達,其中內(nèi)參基因為β-actin。

1.8足關節(jié)滑膜組織蛋白表達檢測 采用Western印跡檢測足關節(jié)滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達〔20〕。提取各組足關節(jié)滑膜組織總蛋白,定量后取等量蛋白,加入5×蛋白上樣緩沖液,沸水中放置10 min將蛋白變性。取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳完成后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,常溫封閉2 h。洗膜,分別與TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB及β-actin抗體在4 ℃下孵育過夜,β-actin抗體為1∶2 000倍稀釋,其余抗體為1∶1 000倍稀釋。洗膜,加入相應的IgG二抗后在常溫下孵育1 h,顯影、拍照后計算蛋白相對表達水平。

1.9統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism7.0軟件進行Tukey法及單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組足趾腫脹度比較 注射牛Ⅱ型膠原蛋白與完全弗氏佐劑后,大鼠四肢甚至尾部出現(xiàn)紅腫、腫脹,提示建模成功。模型組足趾腫脹度均顯著高于正常組(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)低、高劑量枸杞多糖及氨甲蝶呤治療后,各組足趾腫脹度均明顯下降(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 各組不同時間點足趾腫脹度及血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

2.2各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 與正常組比較,模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著增加(P<0.01);與模型組比較,枸杞多糖低、高劑量組及氨甲蝶呤組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯下降(P<0.01),見表1。

2.3各組關節(jié)炎評分比較 模型組關節(jié)炎評分均顯著高于正常組(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)低、高劑量枸杞多糖及氨甲蝶呤治療后,各組關節(jié)炎評分均明顯下降(P<0.01),見表2。

表2 各組不同時間點關節(jié)炎評分、機械性痛閾及熱刺激縮足反射潛伏期比較

2.4各組機械性痛閾及熱刺激縮足反射潛伏期比較 模型組機械性痛閾及熱刺激縮足反射潛伏期均顯著低于正常組(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)低、高劑量的枸杞多糖及氨甲蝶呤治療后,各組機械性痛閾及熱刺激縮足反射潛伏期均明顯升高(P<0.01),見表2。

2.5各組足關節(jié)滑膜組織病理形態(tài)比較 正常組足關節(jié)滑膜組織未見炎性細胞浸潤和軟骨損傷,關節(jié)面完整光滑;模型組可見炎性細胞大量浸潤,且出現(xiàn)軟骨損傷,關節(jié)面粗糙;枸杞多糖低、高劑量組及氨甲蝶呤組細胞浸潤減少,軟骨損傷減輕,關節(jié)面較光滑,尤其是枸杞多糖高劑量組及氨甲蝶呤組病理形態(tài)改善最為明顯,見圖1。

圖1 各組足關節(jié)滑膜組織病理形態(tài)(HE染色,×100)

2.6各組足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達比較 與正常組比較,模型組足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達均顯著增加(P<0.01);與模型組比較,枸杞多糖低、高劑量組及氨甲蝶呤組足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達均明顯下降(P<0.05,P<0.01),見表3。

表3 各組足關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA及TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達比較

2.7各組足關節(jié)滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達比較 與正常組比較,模型組足關節(jié)滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達均顯著增加(P<0.01),而NF-κB蛋白表達無明顯變化(P>0.05);與模型組比較,枸杞多糖低、高劑量組及氨甲蝶呤組足關節(jié)滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達均明顯下降(P<0.05,P<0.01),而NF-κB蛋白表達無明顯變化(P>0.05),見表3、圖2。

1～5：正常組、模型組、枸杞多糖低、高劑量組、氨甲蝶呤組圖2 Western印跡檢測各組足關節(jié)滑膜組織蛋白表達

3 討 論

疼痛是RA的主要臨床表現(xiàn)之一〔21,22〕,RA基本病理改變?yōu)檠仔约毎?滑膜細胞增生,侵蝕骨骼與軟骨組織而引起關節(jié)損傷、結(jié)構(gòu)畸形和功能喪失,滑膜組織是其病變的核心部位〔23〕。Ⅱ型膠原蛋白聯(lián)合完全弗氏佐劑誘導CIA大鼠模型,具有死亡率低、成模率高等優(yōu)點,是最貼近RA的動物模型,應用廣泛〔24〕。本研究結(jié)果表明,枸杞多糖具有改善RA癥狀的作用。杜軍霞等〔25〕通過原代培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞、小鼠甲醛溶液炎癥疼痛模型、小鼠熱板實驗等證實,枸杞多糖具有良好的鎮(zhèn)痛作用,與本研究結(jié)果相符。

RA發(fā)病的確切機制尚未闡明,但炎癥反應學說目前得到了較為普遍的認可。機體微環(huán)境炎癥因子分泌紊亂所引起的炎癥反應,是RA發(fā)病的重要機制,其中TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子起著關鍵性作用〔26〕。TNF-α可由滑膜巨噬細胞產(chǎn)生,能促進c-Jun氨基末端激酶信號通路的活化,進而誘導RA炎癥反應的發(fā)生;IL-1β是巨噬細胞和單核細胞所分泌,能增加破骨細胞活化因子的表達,刺激骨吸收〔27〕。TNF-α能夠與IL-1β發(fā)生協(xié)同作用,共同刺激滑膜巨噬細胞分化,增強破骨細胞活性,最終導致RA滑膜、軟骨的局部侵蝕和破壞〔28〕。IL-6主要參與破骨細胞分化和成纖維細胞的激活、增殖等過程,能通過Wnt和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子3信號通路抑制成骨細胞生成及促進破骨細胞分化,引起或加重RA骨損傷〔29〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),枸杞多糖可有效降低血清及足關節(jié)滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的含量或mRNA表達,具有抑制炎癥反應的作用。枸杞多糖的抗炎作用多見報道〔30〕。枸杞多糖對脂多糖誘導的BV2小膠質(zhì)細胞具有明顯的保護作用,該作用與降低細胞上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放有關〔31〕。枸杞多糖也能夠抑制脂多糖誘導的RAW364.7細胞的炎癥反應,減少NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放〔32,33〕。

枸杞多糖抑制炎癥反應的機制多涉及TLR4/NF-κB信號通路〔34～36〕。TLR4/NF-κB信號通路是介導炎癥反應的重要通路,與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關〔37〕。在RA患者中TLR4蛋白表達異常升高,進而增加MyD88蛋白表達,使NF-κB蛋白發(fā)生磷酸化,升高促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的積累,誘導滑膜組織炎癥反應,加重RA相關癥狀〔38〕。因此,抑制TLR4/NF-κB信號介導的炎癥反應,是改善RA癥狀的有效手段〔39〕。曲芳萱等〔40〕發(fā)現(xiàn),在糖尿病腎病大鼠模型中,枸杞多糖可以下調(diào)腎臟組織中TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達,降低血清TNF-α、IL-6、IL-10含量,通過抑制TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應發(fā)揮保護腎功能作用。枸杞多糖抑制脂多糖誘導的BV2小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型極化,也與阻斷TLR4/NF-κB信號通路的活化有關〔41〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),枸杞多糖能夠抑制TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應,最終發(fā)揮改善RA癥狀的作用。