譚政委 ，郭水柱，蘇小雨 ，孫 瑤 ，余永亮 ，李 磊，張利超，許蘭杰 ，魯?shù)さ?，安素妨 ，李春明 ，梁慧珍 *，王子君

1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，河南 鄭州 450002

2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002

3.仲景宛西制藥股份有限公司，河南 南陽(yáng) 474550

4.承德市中藥材綠色生態(tài)種植技術(shù)服務(wù)中心，河北 承德 067000

5.駐馬店市種子服務(wù)站，河南 駐馬店 463000

TCP 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[1]，是以玉米中的Teosinte 分支1（Teosinte branched1，TB1）、金魚(yú)草中的CYC（Cycloidea）和水稻中的增殖細(xì)胞因子1（proliferating cell factors 1，PCF1）、增殖細(xì)胞因子2（proliferating cell factors 2，PCF2）4 個(gè)基因的首字母而得名[2-4]。TCP 蛋白家族都具有一個(gè)由59 個(gè)氨基酸組成的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic Helix-Loop-Helix，bHLH）保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與DNA 結(jié)合、蛋白互作和亞細(xì)胞定位。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域序列特征，TCP 家族又分為Class Ⅰ和Class Ⅱ，Class Ⅰ又稱PCF 類或TCP-P 類，Class Ⅱ又進(jìn)一步分為CYC/TB1 和CIN 亞類，其中Ⅰ類TCP 的堿性區(qū)比Ⅱ類TCP 少4 個(gè)氨基酸殘基[4-5]。TCP 蛋白可以直接或間接調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，不同類型的TCP 蛋白因其結(jié)構(gòu)域差異結(jié)合不同靶基因的順式作用元件，大量研究表明，Class I 類TCP 蛋白特異性結(jié)合含有GGNCCCAC 元件的基因，Class II 類TCP 則傾向于結(jié)合含有G(T/C)GGNCCC 元件的基因[3]。

TCP基因家族廣泛參與種子萌發(fā)及胚胎生長(zhǎng)[6]、側(cè)枝形成[7]、花器官形成[8]、生物和非生物脅迫[9]、次生代謝生物合成[10-11]、氮素利用[12]等植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。TCP 蛋白可以單獨(dú)或通過(guò)與其他蛋白形成復(fù)合體的形式調(diào)控下游基因的表達(dá)，并且不同TCP 對(duì)同一個(gè)基因的調(diào)控機(jī)制也有所不同。在擬南芥的研究中，AtTCP20 和AtTCP4 都可以調(diào)控靶基因脂氧合酶2（Lipoxygenase2，LOX2）的表達(dá)，其中AtTCP20 抑制LOX2基因的表達(dá)，而AtTCP4 激活LOX2基因的表達(dá)[13-14]。另外，AtTCP4還能結(jié)合到GIS（Glabrousinflor-escencestems）、葉綠素合成相關(guān)基因原茶堿還原酶（Protoch lorophyllidereductase，PORB）、二乙烯基還原酶（Divinylreductase，DVR）和過(guò)表達(dá)抑制劑（SuppressorofoverexpressionofCO1，SOC1CO1）啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達(dá)[15-16]。在蝴蝶蘭中，PePCF10 和PeCIN8 可各自形成同源二聚體，參與胚珠發(fā)育相關(guān)生理過(guò)程[17]，在擬南芥中，AtTCP3 可以通過(guò)與R2R3-MYBs-TT8 互作，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而正調(diào)控類黃酮生物合成[11]。AtTCP20與轉(zhuǎn)錄因子AtNLP6、AtNLP7 在細(xì)胞核內(nèi)形成異源二聚體，激活氮同化關(guān)鍵基因AtNIA1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而提高植株氮同化能力[18]。在水稻的最新研究中，OsTCP19 蛋白通過(guò)結(jié)合于水稻分蘗相關(guān)基因半矮化少分蘗突變體（dwarf and low-tillering，DLT）并抑制其必到從而決定水稻氮信號(hào)響應(yīng)及分蘗[12]。在毛楊樹(shù)的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn) PtoTCP20 與PtoWOX4a 相互作用，激活PtoWND6的轉(zhuǎn)錄，從而影響次生維管組織發(fā)育[19]。此外，大量研究表明，TCP 蛋白參與植物次生代謝調(diào)控及生物、非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程，在草莓中FvTCP9 與FaMYC1 相互作用促進(jìn)花青素的積累，促進(jìn)果實(shí)成熟[20]。番茄CRN12_997 與SlTCP14-2 結(jié)合，會(huì)增加植株對(duì)辣椒灰霉病的易感性[21]。

金銀花LoniceraJaponicaFlos是我國(guó)臨床常用大宗中藥材，金銀花中含有豐富的揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類和環(huán)烯醚萜類等化學(xué)成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老等功效而具有重要的臨床藥用價(jià)值[22-23]。不同種質(zhì)金銀花在株型、枝條和葉片形態(tài)及化學(xué)成分含量等方面均存在較大差異，目前關(guān)于金銀的研究多集中于資源評(píng)價(jià)、花色形成及藥理學(xué)方面，分子遺傳學(xué)方面報(bào)道相對(duì)較少，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)金銀花TCP基因家族轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究報(bào)道。隨著金銀花基因組測(cè)序完成，其基因組數(shù)據(jù)為遺傳育種和功能基因的鑒定提供了重要參考。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)金銀花基因組中的TCP基因家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定，并對(duì)序列特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式等進(jìn)行綜合分析，以期為進(jìn)一步探索研究金銀花TCPs基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究所用金銀花品種‘密銀花1 號(hào)’為團(tuán)隊(duì)2020 年河南省省級(jí)審定品種，經(jīng)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材所梁慧珍研究鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.。

1.2 儀器

QIAquant 96 熒光定量PCR 儀（德國(guó)QIAGEN公司）；5424R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon2500凝膠成像（上海天能生命科學(xué)有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的處理

將1 年生扦插苗盆栽，在自然條件下生長(zhǎng)，將盆栽苗置于低溫冰箱中做冷處理（4 ℃），在處理后6、12、24、36 和48 h 取樣，0 h 作為對(duì)照，3～5 株葉片收集并混合作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將樣品在液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 金銀花TCP 基因家族的鑒定

根參考金銀花基因組相關(guān)文獻(xiàn)，在國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（https://bigd.big.ac.cn/gwh）下載金銀花基因組序列、蛋白序列及基因組注釋文件（項(xiàng)目編號(hào)：PRJCA001719）。從pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCP 轉(zhuǎn)錄因子的隱馬爾科夫模型（hindden market model，HMM）文件（登陸號(hào)：PF03634），在國(guó)家超級(jí)計(jì)算鄭州中心服務(wù)器上通過(guò)HMMER 軟件檢索金銀花蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，E-value 設(shè)置為0.001，篩選出候選基因。利用 SMART （ http://smart.emblheidelberg.de/）、CD-Search Tool（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）檢測(cè)候選蛋白質(zhì)序列，剔除不含bHLH 基序的蛋白序列，最后得到金銀花中編碼LjTCP 蛋白的基因序列。

2.3 LjTCP 基因染色體定位、基因復(fù)制及共線性分析

根據(jù)基因注釋文件，利用TBtools 軟件將鑒定出的LjTCP基因錨定到染色體上，并根據(jù)LjTCP基因在染色上的位置進(jìn)行命名編號(hào)。通過(guò)TBtools[23]軟件中的One Step MCScanX 分析金銀花基因組內(nèi)LjTCP基因家族成員間復(fù)制關(guān)系，通過(guò)Advance Circos 模塊對(duì)復(fù)制關(guān)系進(jìn)行展示。

2.4 LjTCP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員理化性狀及結(jié)構(gòu)特性分析

通過(guò)在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org /protparam/）分析蛋白理化性質(zhì)，使用PlantmPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)LjTCPs 蛋白亞細(xì)胞定位，利用在線工具ExPASY（https://www.expasy.org/tools）預(yù)測(cè)LjTCPs 氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)，通過(guò)Expasy（https://web.expasy.org/protscale/）軟件分析蛋白的親疏水性。通過(guò)TBtools 軟件對(duì)LjTCP 基因家族成員的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分析展示。

2.5 LjTCP 基因蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

采用MEGA 7.0 軟件中ClusterW 對(duì)金銀花、擬南芥和水稻中TCP基因進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，Bootstrap 設(shè)置為1 000，根據(jù)擬南芥和水稻中TCP基因?qū)疸y花TCP進(jìn)行分組，通過(guò)Evolview 在線軟件和Adobe Illustrator軟件對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化；通過(guò)ClusterW 對(duì)不同分組中LjTCP保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)GeneDoc 軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行美化展示。

2.6 保守基序及啟動(dòng)子分析

通過(guò)本地MEME（v5.4.1）軟件對(duì)LjTCP基因家族成員進(jìn)行基序分析，參數(shù)：maximum number of Motifs＝10，minimum width≥6，maximum width ≤50。為了解析LjTCPs啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件，提取LjTCPs基因ATG 上游2 000 bp 序列，利用Plant CARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be /webtools/plantcare/html/）軟件進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析，并通過(guò)TBtool 和R version 4.3.1 軟件對(duì)啟動(dòng)子分析結(jié)果進(jìn)行展示。

2.7 LjTCP 基因家族表達(dá)模式分析

在國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（https://bigd.big.ac.cn/gwh）中下載金銀花不同發(fā)育時(shí)期（S1～S8）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（項(xiàng)目編號(hào)：PRJCA001719）[23]，從NCBI 的Short Read Arshive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載‘封金1 號(hào)’（F_5，低花青素含量品種）和‘豫金2 號(hào)’（Y_5，高花青素含量品種）花期為S5 期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（項(xiàng)目編號(hào)：PRJNA861870）[24]，在國(guó)家超級(jí)計(jì)算鄭州中心服務(wù)器通過(guò)fastp 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭，得到clean reads，利用HISAT2 將clean Reads 與金銀花參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，利用featuresCounts 軟件，對(duì)reads 進(jìn)行精確的計(jì)數(shù)，并計(jì)算FPKM 值，LjTCP基因家族成員的相對(duì)表達(dá)豐度用log2(FPKM＋1)值表示，通過(guò)R軟件中的Pheatmap 包對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行熱圖展示。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）

通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)LjTCP基因家族基因在冷脅迫處理后基因表達(dá)變化。利用RNA 提取試劑盒提取各組織樣品的RNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA 的質(zhì)量和完整性，測(cè)定RNA 的濃度及純度，并將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。使用PrimerPremier5 軟件設(shè)計(jì)定量引物（表1），每個(gè)熒光定量PCR 反應(yīng)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)通過(guò)2?ΔΔCt相對(duì)定量法對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)水平分析，結(jié)果以3 個(gè)生物重復(fù)的±s值表示，用Student’st-test 對(duì)處理后6、12、24、36、48 h 與0 h 樣品表達(dá)量進(jìn)行顯著性分析，P＜0.01 表示差異具有顯著性，通過(guò)GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行繪圖。

表1 qRT-PCR 分析所用引物序列信息Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

3 結(jié)果與分析

3.1 LjTCP 基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

利用pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中TCP家族轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域bHLH（登陸號(hào)PF03634），通過(guò)檢索金銀花基因組，共鑒定出17 個(gè)LjTCPs，利用Pfam 和NCBI的Conserved Domain Search 在線分析軟件對(duì)LjTCP蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。結(jié)果表明，17 個(gè)LjTCPs 蛋白均含有非典型的bHLH 特征結(jié)構(gòu)域，分別命名為L(zhǎng)jTCP01～LjTCP17（表2）。使用ExPASy 工具對(duì)LjTCP 家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，LjTCP01 蛋白最長(zhǎng)，編碼379 個(gè)氨基酸，LjTCP04蛋白最短，編碼202 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量分布區(qū)域?yàn)?2 119.09～42 098.05，等電點(diǎn)范圍是6.06（LjTCP14）～9.74（LjTCP04），大多數(shù)蛋白為堿性蛋白，且具有良好的親水性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LjTCPs 均定位在細(xì)胞核中（表2）。

表2 金銀花LjTCP 基因家族氨基酸序列特征分析Table 2 Analysis of amino acid sequence characteristics of LjTCP gene family in L.japonica

3.2 LjTCP 基因家族成員染色體定位及共線性分析

共有17 個(gè)金銀花LjTCP基因被映射到9 條染色體上（圖1），其中LjTCP17是唯一未組裝在染色體上的基因。LjTCP基因在所有染色體上都有分布，但總體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第1 條（LjTCP01、LjTCP02、LjTCP03）和6 條染色體（LjTCP09、LjTCP10、LjTCP11）上有3 個(gè)LjTCP基因，第2 條（LjTCP04、LjTCP05）、第7 條（LjTCP12、LjTCP13）和9 條染色體（LjTCP15、LjTCP16）上有2 個(gè)LjTCP，其余染色體上只有一個(gè)LjTCP。

圖1 LjTCP 基因家族的染色體定位Fig.1 Chromosomal location of LjTCP gene family

基因復(fù)制被認(rèn)為是基因組和遺傳系統(tǒng)進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力之一，重復(fù)基因?yàn)樾禄虻漠a(chǎn)生提供了原材料，而新基因則促進(jìn)了新功能的產(chǎn)生。為了了解LjTCP基因家族的擴(kuò)增機(jī)制，對(duì)金銀花基因組的復(fù)制事件進(jìn)行了全面分析，結(jié)果表明（圖2），金銀花LjTCP基因家族中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)事件，但有 11 個(gè)基因（LjTCP01/LjTCP14、LjTCP03/LjTCP14、LjTCP06/LjTCP09、LjTCP06/LjTCP10、LjTCP07/LjTCP12、LjTCP08/LjTCP11、LjTCP08/LjTCP15、LjTCP09/LjTCP10、LjTCP11/LjTCP15）共9 對(duì)基因間存在共線性關(guān)系，另外，通過(guò)基因復(fù)制事件分析顯示，除LjTCP04和LjTCP17，其余15 個(gè)LjTCP基因中檢測(cè)到了全基因組復(fù)制和片段性復(fù)制事件，其中LjTCP17未檢測(cè)到復(fù)制事件可能主要是由于該基因未定位到染色體上。

圖2 LjTCP 基因家族的共線性分析Fig.2 Collinearity analysis of TCP gene family from L.japonica

3.3 LjTCP 基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

利用LjTCP 蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，LjTCP 蛋白成員可以分成2 個(gè)亞群（圖3-A）。為了深入了解LjTCP 家族成員蛋白保守基序組成，通過(guò)MEME 軟件對(duì)其保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖3-B 顯示，所有LjTCP 家族成員均具有保守的TCP 結(jié)構(gòu)域（Motif1）。第Ⅰ亞群的9 個(gè)成員都含Motif2，并且該亞群中所含的保守基序種類較多，Motif4、Motif5只存在于第Ⅱ亞群中，并且同一亞群中具有相似的保守基序，而不同亞群中保存基序種類差異較大，這暗示同一亞群中成員可能具有相似的功能，而不同亞群中功能可能有所差異。另外，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，LjTCP家族成員基因結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，其中LjTCP02和LjTCP05含有2 個(gè)內(nèi)含子，LjTCP01、LjTCP07、LjTCP08、LjTCP09、LjTCP10、LjTCP12和LjTCP13只含有1 個(gè)內(nèi)含子，其余LjTCP不含內(nèi)含子（圖3-C）。

圖3 LjTCP 基因家族進(jìn)化樹(shù) (A)、保守結(jié)構(gòu)域 (B) 和基因結(jié)構(gòu) (C) 分析Fig.3 Phylogenetic tree (A), conserve motif (B) and gene structure (C) analysis of LjTCP genes family

3.4 LjTCP 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建及多重比對(duì)分析

為了闡明LjTCP 蛋白質(zhì)的序列特征，對(duì)所有LjTCP 進(jìn)行了多序列比對(duì)，結(jié)果表明在59 個(gè)殘基的TCP 結(jié)構(gòu)域中，BASIC 區(qū)域保守性最強(qiáng)，Helix區(qū)域保守性較差，Loop 區(qū)域變化較大。確定17 個(gè)bHLH 結(jié)構(gòu)域中相同的19 個(gè)殘基：10 個(gè)在Basic 區(qū)域（KDRHXKVXXRXRRXR），2 個(gè)螺旋中的7 個(gè)疏水性殘基以及1 個(gè)斷裂螺旋的甘氨酸（圖4）。

圖4 LjTCPs 結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of LjTCPs domain

基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和TCP 結(jié)構(gòu)域的特征，LjTCP蛋白質(zhì)被分為2 類（圖5）：第1 類為PCF 組，包含9 個(gè)LjTCP 蛋白質(zhì)；第2 類包含2 個(gè)亞組，即CIN和CYC/TB1。CIN組有6個(gè)LjTCP蛋白質(zhì)，CYC/TB1組有2 個(gè)LjTCP 蛋白質(zhì)。每個(gè)組都具有獨(dú)特的序列和結(jié)構(gòu)特征。例如，在Basic 區(qū)域，PCF 組比CIN和CYC/TB1 組少了4 個(gè)氨基酸殘基（圖4），這使得這2 種類型的TCP 蛋白質(zhì)具有不同但相似的DNA 結(jié)合位點(diǎn)（第1 類為GGNCCAC，第2 類為GTGGNCCC）。在Helix 和Loop 區(qū)域方面，每種類型TCP 都具有獨(dú)特的氨基序列特征，如在Helix I區(qū)域的最后3 個(gè)殘基中，PCF 組成員為T(mén)RE，CIN組為QDR，CYC/TB1 組為QDL 和QDM（圖4）。

圖5 金銀花、擬南芥和水稻TCP 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析。Fig.5 Phylogeny analysis of TCP gene family among L.japonica, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa.

3.5 LjTCP 基因家族成員啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步了解金銀花中TCP轉(zhuǎn)錄因子的潛在功能和調(diào)控機(jī)制，使用PlantCARE 對(duì)翻譯起始位點(diǎn)上游近2.0 kb 的序列區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果幾乎所有的LjTCP基因在啟動(dòng)子區(qū)域都有至少7 個(gè)以上順式作用元件（圖6）。這些順式作用元件進(jìn)一步被分為4 類：生理響應(yīng)、光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)和脅迫（圖7）。第1 類是與植物生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的生理響應(yīng)元件，包括O2-site、CAT-box、circadian、MSA-like 等。第2 類是含光響應(yīng)元件，包括GATA-motif、G-box、BoxII、GT1-motif、Sp1等。其中GT1-motif 元件是在LjTCP基因家族成員啟動(dòng)子中最豐富的順式作用元件。第3 類是植物激素響應(yīng)元件，由TGACG-motif、TCA-element、ABRE、P-box、GARE-motif 等組成。例如，LjTCP03的啟動(dòng)子區(qū)域具有CGTCA-motif、TGACG-motif、ABRE、P-box、GARE-motif 和TATC-box 順式作用元件，這些順式作用元件與茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長(zhǎng)素、赤霉素（gibberellic acid，GA）響應(yīng)應(yīng)有關(guān)，據(jù)推測(cè)LjTCP03可能參與多種激素響應(yīng)。第4 類是非生物與生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，包括抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response elements，ARE）、低溫應(yīng)答（low temperature resonsive Element，LTR）元件、干旱誘導(dǎo)元件（MYB binding site，MBS）、創(chuàng)傷應(yīng)答元件（Wun-motif）和TC-rich repeats。LTR元件在6 個(gè)LjTCPs啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)，其中LjTCP16啟動(dòng)子區(qū)域含有2 個(gè)LTR 元件。值得注意的是，LjTCP10基因中不包含任何與非生物或生物脅迫相關(guān)的元件。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明LjTCP基因家族可能與生長(zhǎng)發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)有關(guān)。

圖6 LjTCP 基因家族啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析Fig.6 Analysis of promoter cis-acting elements of LjTCP gene family

圖7 LjTCP 基因家族啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析Fig.7 Statistical analysis of number of cis-acting elements in promoter region of LjTCP gene family

3.6 LjTCP 基因家族成員表達(dá)模式分析

為了探究LjTCP基因家族在花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式，利用金銀花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)花發(fā)育的8 個(gè)時(shí)期（S1～S8）的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，大部分基因在S1～S3 期中表達(dá)量較高，隨著發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖8-A）。在其他植物的研究中發(fā)現(xiàn)，TCP基因調(diào)控花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響植物花青素和花色的形成，為了探究LjTCP基因是否可能參與金銀花花青素合成調(diào)控過(guò)程，對(duì)2 個(gè)金銀花花青素含量差異明顯的品種的LjTCP基因表達(dá)量進(jìn)行FPKM 分析，結(jié)果表明LjTCP05、LjTCP13、LjTCP14、LjTCP16和LjTCP17在 2 個(gè)品種中表達(dá)量具有明顯的差異，其中LjTCP05、LjTCP13、LjTCP14和LjTCP17在花青素含量較少的品種封金1 號(hào)中表達(dá)量較高，LjTCP16在花青素含量較高的品種豫金2 號(hào)中表達(dá)量較高（圖8-B）。

圖8 LjTCP 基因家族在不同發(fā)育階段 (A) 和2 個(gè)品種的金銀花 (B) 中的表達(dá)模式Fig.8 Expression heatmap of LjTCP gene family in different developmental stages (A) and two varieties (B) of L.japonica

3.7 冷處理下LjTCP 基因家族成員表達(dá)模式分析

為了研究LjTCP基因家族在應(yīng)對(duì)低溫反應(yīng)中的表達(dá)模式，選擇了6 個(gè)含有LTR 順式作用元件的LjTCP基因，并調(diào)查其在誘導(dǎo)低溫脅迫（4 ℃）的不同階段（0、6、12、24、48 h）的表達(dá)水平。結(jié)果如圖9 所示，根據(jù)表達(dá)模式，可以將這6 個(gè)基因分為3 類，第1 類LjTCP8和LjTCP14隨著冷處理的進(jìn)行其表達(dá)量持續(xù)升高，在冷處理48 h 后，表達(dá)量達(dá)到最高；第2 類LjTCP13和LjTCP16在處理后表達(dá)量先降低，隨后升高，但LjTCP13和LjTCP16表達(dá)模式略有不同，LjTCP13在處理后先降低隨后升高，在冷處理36 h 后表達(dá)量達(dá)到最高，而LjTCP16則是表達(dá)量先降低，隨后升高，在24 h 后達(dá)到表達(dá)量最高峰，隨后表達(dá)量降低至處理前水平；第3 類LjTCP15和LjTCP17表達(dá)量先升高后降低至基礎(chǔ)表達(dá)水平。

圖9 LjTCP 基因家族冷處理后表達(dá)模式分析Fig.9 Expression profiles analysis of LjTCP gene family under cold stress

4 討論

金銀花是一種兼具藥用、觀賞作用的經(jīng)濟(jì)作物，但關(guān)于金銀花發(fā)育的生物學(xué)機(jī)制相關(guān)研究較少，TCP 作為植物的特異轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程的多個(gè)方面起至關(guān)重要的作用。隨著越來(lái)越多的植物基因組測(cè)序完成，大量植物中的TCP基因家族在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行了鑒定，不同物種中鑒定的TCP 數(shù)目也不盡相同，如在擬南芥[25]、水稻[26]、茶樹(shù)[27]中分別鑒定出24、22 和37 個(gè)TCP基因家族成員。本研究從全基因組水平，對(duì)金銀花TCP基因家族進(jìn)行了鑒定，共鑒定出17 個(gè)TCP基因，其基因總數(shù)與其他物種中TCP數(shù)目有所差異，說(shuō)明不同物種間該家族的基因數(shù)量也存在一定差異，這可能與不同物種間基因組大小、基因擴(kuò)張程度不同有關(guān)。其中LjTCP01～LjTCP16不均勻的分布于金銀花基因組9 條染色體上，受限于金銀花基因組測(cè)序質(zhì)量問(wèn)題，LjTCP17定位于contig 上，而未能定位到染色體上。在植物基因組中，基因復(fù)制和分化是基因家族擴(kuò)張和新功能演化的必要步驟。為了評(píng)估復(fù)制對(duì)LjTCP基因家族的影響?；蚪M內(nèi)共線性分結(jié)果表明LjTCP復(fù)制類型主要為全基因組復(fù)制和片段性復(fù)制，有15 個(gè)LjTCPs參與了片段復(fù)制事件，有9 對(duì)基因間存在共線性關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)，這與葡萄[28]、玉米[29]、棉花[30]的研究結(jié)果一致，這說(shuō)明全基因組復(fù)制合片段性復(fù)制在LjTCP基因家族擴(kuò)張中起了至關(guān)重要的作用。

序列同源分析表明，金銀花TCP家族基因在分子特性和保守結(jié)構(gòu)域等特征上與其他物種TCP家族基因相似，金銀花TCP家族成員可以分為2 大類、3 個(gè)亞家族，PCF 亞家族包含9 個(gè)LjTCP 蛋白，CYC/TB1 亞家族含有2 個(gè)，6 個(gè)LjTCP 蛋白屬于CIN 亞家族。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，所有金銀花TCP家族成員的N 末端都具有非典型的Basic-Helixloop-Helix 結(jié)構(gòu)域，根據(jù)Basic 區(qū)域氨基酸不同，又可以將TCP 分為2 大類，其中ClassⅠ亞家族比ClassⅡ亞家族TCP 結(jié)構(gòu)域少4 個(gè)氨基酸，這與前人的研究結(jié)果一致。金銀花TCP motif 種類在不同亞家族中的保守基序也具有一定的差異性，Class Ⅰ中多數(shù)成員保守基序要多于Class Ⅱ。在前人的研究中，Class Ⅰ和Class Ⅱ在調(diào)控植物不同方面生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。Class Ⅰ的蛋白成員可能與果實(shí)的發(fā)育、花色有關(guān)[31]，而Clas sⅡ成員在植物花瓣發(fā)育[32]、分枝[7]等過(guò)程中發(fā)揮作用，如在玉米TB1 突變體中，TB1 的表達(dá)降低，導(dǎo)致頂端優(yōu)勢(shì)缺失，植株分枝數(shù)量增多[33]。在擬南芥中，AtTCP18（BRC1、TB1直系同源基因）主要在腋芽中表達(dá)，其活性缺失可誘導(dǎo)腋芽發(fā)育成側(cè)枝[34]。在金魚(yú)草中，CYC基因在花發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中都有表達(dá)，與dish基因共同調(diào)控花的對(duì)稱性發(fā)育[35]。本研究中共鑒定了2 個(gè)CYC/TB1 亞家族成員LjTCP07和LjTCP12，通過(guò)表達(dá)譜分析表明，這2 個(gè)基因的表達(dá)模式非常相似，都是在金銀花花發(fā)育初期（S1、S2、S3）表達(dá)量較高，在發(fā)育后期表達(dá)量降低，推測(cè)這2 個(gè)基因可能參與調(diào)控金銀花花發(fā)育過(guò)程，有待于進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

大量研究發(fā)現(xiàn)，TCP轉(zhuǎn)錄因子參與植物花青素合成調(diào)控，如在擬南芥中Class Ⅰ中AtTCP15 負(fù)調(diào)控花青素的積累，并且在高光條件下，TCP 對(duì)花青素的負(fù)調(diào)控作用喪失[36]。在垂絲海棠MalushallianaL.中，來(lái)自于Class Ⅱ CIN 亞家族中的MhTCP4 通過(guò)直接結(jié)合于花青素合成結(jié)構(gòu)基因MhCHI和MhF3’H啟動(dòng)子，激活其表達(dá)，正調(diào)控花青素的生物合成[37]。本研究以花青素含量較少的金銀花品種封金1 號(hào)花青素含量較高的品種豫金2 號(hào)為研究對(duì)象，對(duì)LjTCP基因家族成員的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明來(lái)自CIN 亞家族的LjTCP05、LjTCP13和LjTCP17在封金1 號(hào)中表達(dá)量較高，來(lái)自Class ILjTCP16在豫金2 號(hào)中表達(dá)量較高，這暗示著這些LjTCP基因可能參與花青素合成調(diào)控，有待于通過(guò)轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。這些結(jié)果表明，LjTCP在不同組織中表現(xiàn)出不同表達(dá)模式，暗示LjTCP家族成員參與了多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育及生物代謝過(guò)程。

啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)LjTCP含有大量有關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫與非生物脅迫相關(guān)元件，表明LjTCP基因家族可能參與相關(guān)調(diào)控途徑從而影響金銀花的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明TCP基因家族參與抗寒、抗旱脅迫響應(yīng)過(guò)程，在木薯中[38]有20%以上的TCP家族成員響應(yīng)干旱和冷脅迫處理過(guò)程。在菊花腦中，miR319 和其預(yù)測(cè)目標(biāo)基因CnTCP2/4/14能夠?qū)涮幚碜鞒隹焖俚谋磉_(dá)響應(yīng)，并且在擬南芥中過(guò)表達(dá)CnTCP4則導(dǎo)致植株對(duì)冷過(guò)度敏感，這說(shuō)明CnTCP4可能在菊花腦對(duì)冷脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[39]。對(duì)6 個(gè)在啟動(dòng)子區(qū)含有LTR 順式作用元件的LjTCP基因?qū)Φ蜏孛{迫的反應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，這6 個(gè)LjTCP基因?qū)Φ蜏靥幚矶加胁煌潭鹊捻憫?yīng)，其中LjTCP08和LjTCP14在低溫處理48 h 后表達(dá)量最大，LjTCP16和LjTCP17在低溫處理24 h 后表達(dá)量最大，這與苦蕎中TCP 基因家族研究結(jié)果相一致[40]，LjTCP15在低溫處理6 h 后表達(dá)量最大，表明這些LjTCP 轉(zhuǎn)錄因子可能在冷脅迫反應(yīng)的不同時(shí)期發(fā)揮不同的作用。盡管已經(jīng)觀察到TCP 在許多植物中對(duì)低溫的反應(yīng)，但TCP 如何對(duì)冷信號(hào)做出反應(yīng)并調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的機(jī)制在很大程度上仍然未知。需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明這些基因在低溫下的功能及其與冷信號(hào)通路的關(guān)系。

綜上所述，本研究對(duì)金銀花TCP轉(zhuǎn)錄因子家族從全基因組層面進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，共鑒定出17 個(gè)LjTCPs，分為Class I 與Class II 2 大類，進(jìn)一步劃分3 個(gè)亞家族（PCF、CYC/TB1 和CIN）。理化性質(zhì)分析顯示，LjTCPs編碼202～379個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)分布于6.06～9.74，相對(duì)分子質(zhì)量分布區(qū)域?yàn)?2 119.09～42 098.05，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中，均含非典型bHLH 保守結(jié)構(gòu)域。表達(dá)模式分析顯示LjTCP基因家族在金銀花花發(fā)育中和花青素含量不同的金銀花品種中具有不同的表達(dá)模式，推測(cè)LjTCP基因家族金銀花花發(fā)育和花青素合成中起著重要的調(diào)控做，本研究為深入探索LjTCPs基因功能奠定理論基礎(chǔ)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突