劉 悅 ，丁曉彥，王 娜，高 燕，楊龍飛，呂 婧，韓利文，傅春升，趙渤年*

1.山東中醫(yī)藥大學 藥物研究院，黃河流域特色中藥生態(tài)保護和高質(zhì)量發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心 山東 濟南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，山東 濟南 250014

3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014

4.山東現(xiàn)代學院，山東 濟南 250104

5.山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院），藥學院（藥物研究所），山東 濟南 250024

6.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

血栓是引起缺血性疾病的主要原因，中醫(yī)認為，血栓的形成與患者氣血運行不暢、氣滯血瘀有關(guān)，因此，中醫(yī)臨床常用活血化瘀類中藥治療血栓性疾病[1-2]，代表藥味有丹參、三七、川芎、桃仁、紅花、赤芍等。該類藥物不僅可以抑制血小板活化和炎癥反應(yīng)，還可以改善纖溶系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)等，通過多種途徑共同發(fā)揮抗血栓作用[3]。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根或根莖，為中醫(yī)活血化瘀的要藥，主要成分包括脂溶性的丹參酮I、丹參酮IIA、水溶性的丹酚酸類與多酚酸類等，具有抗血小板聚集、抑制黏附因子表達、抗氧化、抗癌等作用[4]。關(guān)于丹參抗血小板聚集作用的研究早在1982 年就有報道，不少臨床資料也證實丹參制劑對血栓性疾病有較好的療效[5-7]。故本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱-高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）建立丹參指紋圖譜，采用花生四烯酸誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型，對不同產(chǎn)地丹參的抗血栓作用進行考察，并運用數(shù)理統(tǒng)計方法將指紋圖譜化學信息與藥效學信息進行相關(guān)性研究，以期表征丹參的抗血栓效應(yīng)組分，為丹參抗血栓作用譜-效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，為丹參臨床治療血栓性疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Hypersil GOLD 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS（美國賽默飛世爾科技公司）；SB4200DTS 型超聲波雙頻清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BP211D 型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KDM 型可調(diào)控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；FDY1002-UV-P 型低有機物型超純水機（青島富勒姆科技有限公司）；DLSC05 型微型渦旋混懸儀（北京東陵昌盛生物科技公司）；IX83＋DP8 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；6 孔板（美國Corning 公司）；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZSA0745 型連續(xù)變倍體式顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Research plus 移液槍（徳國Eppendorf 公司）；HPG-280BX 型恒溫光照培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（五層單排，上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

乙腈（批號219087）、甲酸（批號193497）購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；對照品隱丹參酮（批號110852-201807）、丹參酮I（批號110867-201607）、丹參酮IIA（批號110766-202022）、丹參素（批號110855-201915）、丹酚酸B（批號111562-201716）、咖啡酸（批號110885-201703）由中國食品藥品檢定研究院提供，質(zhì)量分數(shù)均＞98%；對照品丹酚酸A（批號Z23D10X106625）、原兒茶醛（批號TO1013FB14）、迷迭香酸（批號Y16A9K67403）和紫草酸（批號Y04J10H75487）由上海源葉生物科技有限公司提供，質(zhì)量分數(shù)均＞98%；二氫丹參酮I對照品（批號PRF7033101，質(zhì)量分數(shù)＞98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；牛蒡子苷對照品（批號PRF7033101，質(zhì)量分數(shù)＞98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；花生四烯酸（arachidonic acid，AA，批號D1827021）購自上海Aladdin 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號39075）購自上海Sangon 生物科技公司；玲聯(lián)茴香胺（批號MKCC7501）、阿司匹林（批號MKCD0957）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；4%多聚甲醛（批號B35F001200）購自武漢Servicebio 公司。

1.3 動物

成年AB 系斑馬魚（山東第一醫(yī)科大學藥學院提供）培養(yǎng)于專業(yè)的養(yǎng)殖系統(tǒng)，保持恒溫（28.0±0.5）℃，14 h/10 h 光/暗循環(huán)。每天分別于9: 00 和16: 00 時投喂豐年蝦。需要用卵時，把成年雄雌斑馬魚按2∶1 的比例放在交配缸中分隔板的兩邊；次日早晨抽去隔板，斑馬魚受光照刺激自然交配產(chǎn)卵。在產(chǎn)卵后30 min 內(nèi)收集胚胎。收集的胚胎移入裝有養(yǎng)魚水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4）的培養(yǎng)皿中，28.5 ℃培養(yǎng)72 h，備用。

1.4 藥材

不同產(chǎn)地60 批丹參飲片（表1）購自安徽亳州中藥材交易中心，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院丁曉彥副研究員鑒定，均為丹參S.miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。粉碎過40 目篩，備用。

表1 丹參樣品信息Table 1 Information of S.miltiorrhiza samples

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，90%～85% B；5～10 min，85%～80% B；10～23 min，80%～75% B；23～26 min，75%～40% B；26～36 min，40% B；36～40 min，40%～5% B；40～41 min，5%～90% B。體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長285 nm；進樣量6 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electric spray ion source，ESI），正、負離子檢測模式；掃描范圍m/z100～1 500；鞘氣體積流量1 132.67 L/h；輔助氣體積流量283.17 L/h；毛細管溫度350 ℃；輔助氣溫度320 ℃；噴霧電壓為＋3.50 kV（正離子模式）和?3.00 kV（負離子模式）；掃描模式為FullMs/dd-Ms2，F(xiàn)ullMs 分辨率70 000，dd-Ms2分辨率17 500。

2.1.3 對照品溶液和內(nèi)標溶液的制備 精密稱定原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、二氫丹參酮I 對照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為1.200、1.730、1.450、1.260、1.150、0.950、0.020 4、0.108、0.100、1.200 mg/mL 的對照品溶液。精密稱定丹參素鈉對照品適量，加50%甲醇制備成質(zhì)量濃度為422.5 μg/mL 的對照品溶液。精密稱定牛蒡子苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為51.5 μg/mL的內(nèi)標溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備

（1）凍干粉I 的制備：精密稱定丹參粉末3 g，置圓底燒瓶中，加95%乙醇120 mL，回流提取1 h，放至室溫，稱定質(zhì)量，補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，制成凍干粉I，余濾液另器留存，殘渣晾干備用。

（2）凍干粉II 的制備：取“2.1.4（1）”項下的殘渣，置圓底燒瓶中，加50%乙醇90 mL，回流提取1.5 h，放至室溫，稱定質(zhì)量，補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液7.5 mL，制成凍干粉II，余濾液另器留存，殘渣晾干備用。

（3）凍干粉III 的制備：取“2.1.4（2）”項下的殘渣，置圓底燒瓶中，加水120 mL，回流提取0.5 h，放至室溫，稱定質(zhì)量，補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，制成凍干粉III，余濾液另器留存。

（4）UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測用供試品溶液的制備：凍干粉I 用甲醇轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，定容、混勻得溶液a；凍干粉II 以50%甲醇為溶劑，同法操作得溶液b；凍干粉III 以水為溶劑，同法操作得溶液c；取a、b、c 3 種溶液等體積混合均勻后，與內(nèi)標溶液等體積混勻，10 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜后作為供試品溶液。

（5）藥效實驗用樣品溶液的制備：分別取“2.1.4（1）（2）（3）”項下的余濾液30、22.5、30 mL 合并凍干；用5 mL DMSO 將凍干粉轉(zhuǎn)移至EP 管中，加養(yǎng)魚水20 mL，超聲處理3 min，配成30 mg/mL 的母液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；藥效試驗前用養(yǎng)魚水稀釋為所需質(zhì)量濃度。

2.1.5 方法學考察

（1）精密度考察：取丹參樣品（批號200601），按照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項下分析條件，連續(xù)進樣6 次，采集圖譜并處理，計算各共有峰與內(nèi)標峰的相對峰面積及相對保留時間RSD 值。

（2）重復(fù)性考察：取同一批丹參樣品，按照“2.1.4”項下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項下分析條件，分別測定，采集圖譜并處理，計算各共有峰與內(nèi)標峰的相對峰面積及相對保留時間RSD 值。

（3）穩(wěn)定性考察：取同一批丹參樣品，按照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項下分析條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，采集圖譜并處理，計算各共有峰與內(nèi)標峰的相對峰面積及相對保留時間RSD 值。

2.1.6 指紋圖譜的建立 取60 批丹參樣品，按照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”“2.1.2”項下分析條件進樣檢測，記錄色譜圖。選取峰純度較高、分離較好的色譜峰為共有峰。根據(jù)國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫Pubchem Compound 以及丹參化學成分、質(zhì)譜研究相關(guān)文獻，收集丹參中各種化學成分信息，導(dǎo)入Xcalibur 軟件，根據(jù)相對分子質(zhì)量誤差＜1×10?5，并結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息、保留時間、對照品的信息以及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)，對共有峰進行定性、相對定量分析。

2.2 丹參抗血栓藥效學研究

2.2.1 AA 對斑馬魚心臟紅細胞染色面積的影響選用受精后72 h（72 h post fertilization，72 hpf）的AB 系斑馬魚，脫膜后在熒光顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚于6 孔板中，設(shè)置對照組（0.1% DMSO）、模型組（AA 質(zhì)量濃度分別為20、24、28 μg/mL），每組1 孔，每孔15 條斑馬魚，給藥后放入28.5 ℃的恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h[8]造成血栓，之后用玲聯(lián)茴香胺染液避光染色15 min，移除染色液，用養(yǎng)魚水清洗2 次，4%多聚甲醛于4 ℃固定過夜。每組隨機選取8 條斑馬魚在熒光顯微鏡下采集圖像，利用Image Pro Plus 6.0 軟件測量斑馬魚心臟紅細胞染色面積，GraphPad Prism 8.0 軟件進行單因素方差分析，各組結(jié)果均以±s表示，以確定最佳建模濃度。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對斑馬魚尾靜脈血栓的影響 取72 hpf AB 系斑馬魚于培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚于6 孔板中，每孔15 條。設(shè)置對照組（0.1% DMSO）、模型組（0.1%DMSO 培養(yǎng)6 h 后加入24 μg/mL AA）、陽性對照組（25 μg/mL 阿司匹林培養(yǎng)6 h 后加入24 μg/mL AA）和丹參給藥組（分別給予50、100、150 μg/mL 的丹參提取物預(yù)處理6 h 后加入24 μg/mL AA），置28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，之后用玲聯(lián)茴香胺染液避光染色15 min，移除染色液，用養(yǎng)魚水清洗2 次，4%多聚甲醛于4 ℃固定過夜。每組隨機選取8 條斑馬魚拍攝心臟和尾部位，利用Image Pro Plus 6.0 軟件測量心臟紅細胞染色面積，GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2.2.3 60 批不同產(chǎn)地丹參提取物抗血栓藥效學研究 設(shè)置空白對照組、模型組、陽性對照組和60 批丹參提取物組（質(zhì)量濃度均為150 μg/mL），各組均按“2.2.2”項下方法處理。

2.3 多元統(tǒng)計分析

將不同產(chǎn)地丹參提取物指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中進行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘-判別分析（ orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）。

2.4 譜效關(guān)系研究

采用在線數(shù)據(jù)分析平臺SPSSPRO，以不同產(chǎn)地丹參提取物共有峰相對峰面積為自變量（X），斑馬魚心臟相對紅細胞染色面積為因變量（Y），進行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學考察

在重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性考察中，以牛蒡子苷為參照峰，各共有峰的相對峰面積值RSD 為0.16%～4.99%，相對保留時間RSD 為0.02%～2.45%，說明該法重復(fù)性良好，儀器的精密度良好，樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于建立丹參提取物的指紋圖譜。

3.2 指紋圖譜解析

3.2.1 指紋圖譜檢測結(jié)果 丹參提取物總離子流圖見圖1，根據(jù)總離子流圖中的保留時間，把一級質(zhì)譜提供的準分子離子峰及二級質(zhì)譜提供的碎片離子信息與對照品及文獻數(shù)據(jù)[9-19]比對，共識別39 個化合物，見表2。以牛蒡子苷為內(nèi)標峰（峰40），計算39 個共有峰的相對峰面積值。

圖1 正 (A)、負 (B) 離子模式下丹參提取物總離子流圖Fig.1 Total ion flow chromatograms of S.miltiorrhiza extracts in positive (A) and negative (B) modes

表2 丹參提取物指紋圖譜共有峰解析結(jié)果Table 2 Results of common peak analysis in fingerprint of S.miltiorrhiza extracts

3.2.2 HCA 結(jié)果 將39 個共有峰的相對峰面積值作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 數(shù)據(jù)分析軟件，采用HCA，60 批丹樣品聚為2 類（距離＝100，除去異常點），山西、河北、安徽、江蘇產(chǎn)地的聚為一類，山東、四川的聚為一類（圖2）。

圖2 60 批丹參樣品的HCA 結(jié)果圖Fig.2 HCA result graph of 60 batches of S.miltiorrhiza samples

圖3 丹參樣品OPLS-DA 模型圖Fig.3 OPLS-DA of S.miltiorrhiza samples

3.2.3 OPLS-DA 結(jié)果 為分析引起不同產(chǎn)地丹參樣品差異的色譜峰，對安徽、江蘇、河北、山東、山西和四川6 個產(chǎn)地的丹參樣品進行OPLS-DA。OPLS-DA 模型可以使樣本之間的差異最大化，以確定樣本之間的差異成分[17]。由圖3-A 可見，剔除異常值后安徽、河北、江蘇和山西產(chǎn)地的丹參（A 組）分布在圖的右側(cè)，山東、四川產(chǎn)地（B 組）的丹參分布在左側(cè)，表明A 組和B 組產(chǎn)地的丹參化學成分存在一定的差異，與聚類分析結(jié)果相一致。變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）較大的成分即VIP 值＞1 的變量，通常與樣本分類更相關(guān)。所有成分的VIP 值見圖3-B，VIP 值大于1 的變量有15 個，分別為峰9（15,16-二氫丹參二醇B）、峰18（4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體）、峰8（迷迭香酸）、峰15（丹酚酸B 同分異構(gòu)體）、峰17（丹酚酸B）、峰14（丹酚酸A 異構(gòu)體）、峰16（丹酚酸A）、峰4（丹參素）、峰3（咖啡酸）、峰2（L-苯丙氨酸）、峰7（saprionide）、峰6（丹酚酸F）、峰38（丹參酮IIA）、峰13（丹參酚醌I 及其同分異構(gòu)體）和峰5（原兒茶醛），它們是區(qū)分A 組和B 組最為相關(guān)的變量，可初步推測為引起2 組丹參樣品差異的物質(zhì)。

3.3 丹參提取物抗血栓藥效學研究

3.3.1 AA 對斑馬魚心臟紅細胞染色面積的影響由圖4 可知，與對照組比較，不同質(zhì)量濃度的AA處理后斑馬魚心臟紅細胞染色面積均顯著減?。≒＜0.001），故本實驗選取24 μg/mL AA 作為建模條件。

圖4 AA 對斑馬魚心臟紅細胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.4 Effect of AA on staining area of red blood cells of zebrafish hearts (±s , n = 8)

3.3.2 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對斑馬魚尾靜脈血栓的影響 由圖5 可知，AA 可導(dǎo)致斑馬魚尾部血栓形成，表現(xiàn)為與對照組比較，AA 處理后心臟紅細胞染色面積顯著減小（P＜0.001）；陽性對照藥阿司匹林干預(yù)后，心臟紅細胞染色面積顯著增大（P＜0.001），尾部靜脈血栓明顯改善，表明阿司匹林對于AA 誘導(dǎo)的血栓具有改善作用；丹參提取物（50、100、150 μg/mL）組心臟紅細胞染色面積與模型組相比均顯著增大（P＜0.05），且150 μg/mL 丹參提取物對尾靜脈血栓的改善作用最佳，故選擇150 μg/mL 丹參提取物進行后續(xù)的抗血栓作用實驗。

圖5 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對斑馬魚心臟紅細胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.5 Effects of different concentrations of S.miltiorrhiza extracts on staining area of red blood cells of zebrafish hearts(±s , n = 8)

3.3.3 60 批丹參提取物的抗血栓藥效學研究 如表3 所示，與對照組比較，模型組斑馬魚心臟紅細胞染色面積明顯減?。≒＜0.001），表明建模成功；與模型組比較，阿司匹林組和60 批丹參提取物組斑馬魚心臟紅細胞染色面積顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），均表現(xiàn)出不同程度的抑制斑馬魚尾靜脈血栓形成的作用。丹參提取物由于產(chǎn)地及批次不同，抑制斑馬魚尾靜脈血栓形成的作用不同，各產(chǎn)地10 批丹參平均相對紅細胞染色面積排序為山東＞江蘇＞山西＞安徽＞河北＞四川（圖6），相對紅細胞染色面積越大表明抗尾靜脈血栓形成的能力越強。OPLSDA 發(fā)現(xiàn)山東四川產(chǎn)地的丹參化學成分差異較小，但藥效學研究發(fā)現(xiàn)2 產(chǎn)地丹參抗血栓作用存在顯著性差異（P＜0.001），由此可見OPLS-DA 僅能分析不同產(chǎn)地丹參樣品的成分信息，若要評價丹參的抗血栓效果，須將成分信息與藥效指標相結(jié)合。

圖6 不同產(chǎn)地丹參對斑馬魚心臟相對紅細胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.6 Effects of S.miltiorrhiza from different origins on relative staining area of red blood cell of zebrafish hearts(±s, n = 8)

表3 60 批丹參提取物的抗血栓作用 (±s, n = 8)Table 3 Antithrombotic activity of 60 batches of S.miltiorrhiza extracts (±s , n = 8)

表3 60 批丹參提取物的抗血栓作用 (±s, n = 8)Table 3 Antithrombotic activity of 60 batches of S.miltiorrhiza extracts (±s , n = 8)

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group.

組別 藥材編號心臟紅細胞染色面積/μm2相對心臟紅細胞染色面積 組別 藥材編號心臟紅細胞染色面積/μm2相對心臟紅細胞染色面積對照 — 4 338.88±87.34 1.000 0 丹參提取物 JS-9 3 014.57±201.61*** 0.694 8模型 — 717.10±39.96### 0.165 3 SD-0 3 549.07±187.12*** 0.818 0阿司匹林 — 3 306.85±172.30*** 0.762 1 SD-1 3 828.32±314.54*** 0.882 3丹參提取物 AH-0 2 710.79±119.92*** 0.624 8 SD-2 3 639.63±177.87*** 0.838 8 AH-1 2 940.07±179.98*** 0.677 6 SD-3 3 256.00±129.43*** 0.750 4 AH-2 2 784.14±212.85*** 0.641 7 SD-4 3 392.38±195.74*** 0.781 9 AH-3 3 339.16±158.65*** 0.769 6 SD-5 3 727.68±170.17*** 0.859 1 AH-4 2 828.29±172.20*** 0.651 8 SD-6 3 106.85±190.25*** 0.716 0 AH-5 2 775.94±145.75*** 0.639 8 SD-7 3 517.59±212.81*** 0.810 7 AH-6 3 009.59±381.51*** 0.693 6 SD-8 3 420.88±185.40*** 0.788 4 AH-7 2 969.93±293.77*** 0.684 5 SD-9 3 517.62±96.50*** 0.810 7 AH-8 3 106.43±175.71*** 0.716 0 SX-0 3 047.15±245.61*** 0.702 3 AH-9 3 038.36±121.45*** 0.700 3 SX-1 2 851.14±204.25*** 0.657 1 HB-0 1 377.56±92.51* 0.317 5 SX-2 3 645.60±249.24*** 0.840 2 HB-1 1 642.74±125.77* 0.378 6 SX-3 3 070.68±207.62*** 0.707 7 HB-2 1 968.66±166.84*** 0.453 7 SX-4 3 128.37±265.48*** 0.721 0 HB-3 2 452.30±42.80*** 0.565 2 SX-5 2 997.77±163.36*** 0.690 9 HB-4 1 746.36±73.57** 0.402 5 SX-6 3 298.86±180.13*** 0.760 3 HB-5 1 627.55±71.58* 0.375 1 SX-7 2 646.34±131.61*** 0.609 9 HB-6 1 660.55±146.28* 0.382 7 SX-8 2 968.64±208.73*** 0.684 2 HB-7 2 796.96±166.09*** 0.644 6 SX-9 3 330.19±137.65*** 0.767 5 HB-8 1 703.48±102.88** 0.392 6 SC-0 1 791.65±103.90** 0.412 9 HB-9 2 265.96±69.39*** 0.522 2 SC-1 1 889.98±97.99*** 0.435 6 JS-0 3 288.80±211.57*** 0.758 0 SC-2 1 646.60±48.18* 0.379 5 JS-1 3 314.98±219.50*** 0.764 0 SC-3 1 930.13±104.80*** 0.444 8 JS-2 3 191.34±217.94*** 0.735 5 SC-4 1 868.08±38.43*** 0.430 5 JS-3 2 685.77±260.61*** 0.619 0 SC-5 1 691.94±62.10** 0.389 9 JS-4 2 712.32±251.85*** 0.625 1 SC-6 1 971.07±140.27*** 0.454 3 JS-5 3 501.32±200.67*** 0.807 0 SC-7 1 750.99±62.31** 0.403 6 JS-6 3 291.41±178.45*** 0.758 6 SC-8 1 653.62±56.56* 0.381 1 JS-7 3 538.82±422.36*** 0.815 6 SC-9 1 865.83±91.92*** 0.430 0 JS-8 3 285.78±273.40*** 0.757 3

3.4 PLSR 分析結(jié)果

中藥指紋圖譜與藥效的譜效關(guān)系需要通過一定的數(shù)據(jù)處理才能實現(xiàn)，故選擇適合的數(shù)據(jù)處理方法至關(guān)重要。PLSR 集相關(guān)分析、主成分分析、多元回歸分析優(yōu)勢于一體，具有無須剔除樣本、預(yù)測精度高、計算量小等特點，已逐漸成為中藥譜效關(guān)系構(gòu)建的主要數(shù)據(jù)處理方法[20-22]。本研究利用SPSSPRO在線數(shù)據(jù)分析軟件，把丹參指紋圖譜共有峰的相對峰面積作為自變量，斑馬魚相對心臟紅細胞染色面積作為因變量，進行PLSR 分析。根據(jù)PLSR 原理，VIP 值越大表示其對因變量的解釋能力越強。由分析結(jié)果可知，當主成分個數(shù)為t[5]時，累計的X方差為100%，代表對自變量信息的提??；累計的Y方差為60.2%，代表對因變量信息的提取；39 個共有峰中有18 個峰與抗血栓活性呈正相關(guān)，18 個峰中VIP＞1 的成分有8 個，分別為峰1（二糖）、峰31（新隱丹參酮）、峰26（丹參醛）、峰34（隱丹參酮）、峰39（二氫隱丹參酮）、峰8（迷迭香酸）、峰18（4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體）和峰17（丹酚酸B），計算得到的模型系數(shù)和VIP 值，見圖7。據(jù)此推測與丹參抗血栓活性最相關(guān)的化合物可能為二糖、新隱丹參酮、丹參醛、隱丹參酮、二氫隱丹參酮、迷迭香酸、4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體和丹酚酸B。先前的研究也報道了相關(guān)化合物的抗血栓作用，與本研究結(jié)論相一致。唐惠蘭[23]通過分子對接技術(shù)篩選出了丹參中可能具有抗血栓效應(yīng)的活性成分，包括丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸等，并發(fā)現(xiàn)它們可能都是通過多靶點發(fā)揮抗血栓效應(yīng)；李丹丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)西洋參、丹參組方中有16 個活性成分作用于血小板活化通路，包括隱丹參酮、新隱丹參酮等。

圖7 PLSR 分析結(jié)果Fig.7 Results of PLSR analysis

4 討論

4.1 斑馬魚血栓模型的特色優(yōu)勢

斑馬魚作為一種體外發(fā)育、胚胎透明的新型模式生物，具有給藥方便、實驗周期短、用藥量少、可實現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于人類疾病模型的構(gòu)建及中藥活性成分的研究[25-27]等領(lǐng)域。人類與血栓形成相關(guān)的基因在斑馬魚中均存在，斑馬魚的血栓形成及凝血機制與人類相似[28-29]，可以模擬人類血栓形成的過程，這為斑馬魚血栓模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。史永平[30]利用AA 構(gòu)建的斑馬魚血栓模型，發(fā)現(xiàn)了梔子中的3 個抗血栓關(guān)鍵化合物，其中包括以前未報道的新化合物。樊嬌嬌[31]選用鹽酸腎上腺素構(gòu)建的斑馬魚在體血栓模型，操作簡便，結(jié)果準確，有利于中藥抗血栓活性成分的篩選與研究。本課題利用AA 作為誘導(dǎo)劑構(gòu)建的斑馬魚血栓模型，實驗周期短，操作簡便，檢測指標客觀可靠。

4.2 中藥譜效學在丹參質(zhì)量評價中的應(yīng)用

丹參臨床應(yīng)用廣泛，是常用的大宗藥材。四川是丹參的道地產(chǎn)區(qū)，但山東的丹參產(chǎn)量最大，占全國丹參產(chǎn)量的50%以上[32]。此外河南、陜西、湖北、河北、安徽、山西、江蘇、云南和貴州等地也在栽培，由于各產(chǎn)地的地理、氣候、環(huán)境等因素，不同產(chǎn)地的丹參質(zhì)量差異大[33]，臨床療效不穩(wěn)定，如何科學地評價丹參藥材的質(zhì)量一直是一個難題。2002年李戎等[34]首次提出了中藥譜效學，該理論能較好地體現(xiàn)中醫(yī)藥整體觀的理念[35]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制和評價的研究中。中藥譜效學中的指紋圖譜與藥效需要通過一定的數(shù)據(jù)處理才能構(gòu)建真正意義上的譜效關(guān)系，目前常用的數(shù)據(jù)處理方法有相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、多元回歸分析、PLSR 法、典型相關(guān)分析等[36]。王雅莉[37]采用典型相關(guān)分析將藥效數(shù)據(jù)與丹參-紅花藥對液相圖譜進行譜效相關(guān)分析，可快速、有效地篩選出丹參-紅花藥對中主要的活血成分，并利用斑馬魚血栓模型驗證了藥對中的抗血栓活性成分及譜效篩選的可行性。彭麗穎等[38]采用PLSR 法將丹參醇提物指紋圖譜與抗氧化活性進行譜效相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)丹參中13 個共有成分對總抗氧化能力均有影響，符合中藥多通路、多靶點的特點。

本研究為了更加全面地了解不同產(chǎn)地丹參樣品的成分以及抗血栓療效的差異，采用譜效學相關(guān)研究思路，結(jié)合HPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS 技術(shù)的優(yōu)勢，借助OPLS-DA，尋找不同產(chǎn)地丹參樣品的差異化學成分；為了進一步探討丹參指紋圖譜與抗血栓作用之間的關(guān)系，將丹參指紋圖譜與抗血栓藥效指標相關(guān)聯(lián)，采用PLSR 分析，較大程度地反映了各成分對藥效的貢獻作用。接下來將整合譜效相關(guān)研究與分子對接技術(shù)，旨在進一步縮小物質(zhì)基礎(chǔ)范圍，從構(gòu)效關(guān)系層面揭示活性成分可能發(fā)揮藥效的作用機制，對整合研究獲得的藥效物質(zhì)進行抗血栓活性驗證，進一步挖掘丹參抗血栓活性的質(zhì)量標志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突