汪 樂(lè)，李佳楠，楊 洋，曲姣蓉*，李曉驕陽(yáng)*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

膽汁淤積性肝損傷（cholestatic liver injury，CLI）是一種臨床常見(jiàn)的肝臟損傷，以原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）和原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）較為常見(jiàn)，其主要特征是由于膽汁的形成、分泌或排泄過(guò)程出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致膽汁不能正常流向腸道，而在肝臟或膽道系統(tǒng)內(nèi)積聚并引起臟器損傷和肝纖維化。這種疾病可以由多種原因引起，包括膽道梗阻、肝內(nèi)膽管損傷遺傳因素、肝膽系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常、藥物毒性、感染、肝自身免疫疾病等[1]。熊去氧膽酸是大多數(shù)CLI 的基礎(chǔ)治療藥物，但它仍無(wú)法阻止部分PBC 以及PSC 患者的疾病進(jìn)展，最終可能導(dǎo)致肝功能失代償，需要進(jìn)行肝移植治療。一些新型抗膽汁淤積劑如核受體激動(dòng)劑、利膽劑和膽汁酸合成抑制劑，可能會(huì)在一定程度上改善CLI 及其相關(guān)并發(fā)癥，但目前仍缺乏有效臨床證據(jù)[2-3]。因此，未來(lái)研究可致力于改變膽汁淤積、炎癥、細(xì)胞存活以及改善纖維化等多個(gè)途徑共同改善CLI[4]，尋找相關(guān)全新治療策略勢(shì)在必行。

中醫(yī)藥以其一方多藥、一藥多成分的特點(diǎn)或許能為CLI 更全面的治療提供新的研究方向。四物湯最早見(jiàn)于晚唐時(shí)期藺道人所著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》，被用于外傷引起的瘀血和疼痛。隨著研究的不斷深入，四物湯逐漸在中醫(yī)臨床中得到廣泛應(yīng)用，并被認(rèn)為是一種補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)的經(jīng)典方藥，其核心成分包括當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃4 味藥。作為補(bǔ)血調(diào)經(jīng)的基礎(chǔ)方劑，四物湯享有“婦科第一方”的美譽(yù)，有研究報(bào)道其通過(guò)提高抗氧化能力、調(diào)節(jié)血管生成來(lái)改善小鼠卵巢功能[5-6]。此外，還有研究報(bào)道四物湯通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的抑癌作用[7-8]。近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，四物湯可通過(guò)調(diào)控機(jī)體免疫微環(huán)境、修復(fù)膽酸代謝穩(wěn)態(tài)等途徑有效改善因手術(shù)介入或化學(xué)藥損傷導(dǎo)致的包括CLI在內(nèi)的多種慢性肝病[9-11]。四物湯以其補(bǔ)益氣血功效，或益于改善肝臟組織的養(yǎng)分供應(yīng)，從而改善CLI。方中川芎入肝、膽經(jīng)，具有活血化瘀、祛風(fēng)止痛的功效；白芍則能養(yǎng)血斂陰、揉肝止痛；熟地味厚滋膩、滋補(bǔ)營(yíng)血；當(dāng)歸補(bǔ)血和血，4 藥合用，血虛得補(bǔ)，血滯得散[12]。盡管大量文獻(xiàn)已報(bào)道四物湯及其中分離所得多種活性成分（如川芎嗪、阿魏酸、芍藥苷等）均可有效緩解CLI，然而目前尚未有研究對(duì)于4 種單味藥的藥效進(jìn)行對(duì)比評(píng)估，因此篩選單味藥及主要活性成分有助于進(jìn)一步探究四物湯改善慢性肝病的作用與機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用是一種整合計(jì)算機(jī)科學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)和藥理學(xué)的交叉學(xué)科研究方法。它主要通過(guò)大數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)分析和計(jì)算模型等技術(shù)手段，系統(tǒng)地研究中醫(yī)藥的藥理學(xué)特性、作用機(jī)制、多成分相互作用等方面。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以幫助揭示中醫(yī)藥中各成分的作用靶點(diǎn)，以及這些靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，從而更全面地理解中醫(yī)藥的藥理學(xué)特性[13]。前期有研究報(bào)道過(guò)四物湯復(fù)方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，但本研究采用單味藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)比四物湯中各單味藥的作用靶點(diǎn)。同時(shí)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)四物湯中的單味藥川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃治療CLI的藥效及靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，探討了四物湯治療CLI 的作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步解釋四物湯治療肝膽疾病的科學(xué)內(nèi)涵、臨床應(yīng)用以及挖掘四物湯中有效活性成分具有重要意義。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠，8 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量22～24 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在正常條件下飼養(yǎng)，周期為12 h 光照/12 h 黑暗，提供無(wú)限量飼料和純水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-20200730023160）。

1.2 藥材

川芎、熟地黃、白芍、當(dāng)歸飲片均購(gòu)自北京同仁堂（集團(tuán)）有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理教研室劉閏平教授分別鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖、玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根的炮制加工品、毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根。

1.3 藥品與試劑

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)20231013）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)20230802）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號(hào)20230802）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（批號(hào)20230921）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（批號(hào)20231012）、總膽紅素（total bilirubin，T-BIL）試劑盒（批號(hào)20230817）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；異氟烷（批號(hào)20230502）購(gòu)自江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)20231018）、異丙醇（批號(hào)20220801315）均購(gòu)自北京正程生物科技有限公司。

1.4 儀器

R500 型麻醉機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；酶標(biāo)儀（賽爾福醫(yī)療科技北京有限公司）；C1000 Touch 型PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Centrisart?D-16C 型離心機(jī)（德國(guó)賽多利斯公司）；孵育箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；F6/10型勻漿儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；Nano-800+型超微量核酸蛋白測(cè)定儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

2 方法

2.1 四物湯單味藥活性成分及靶點(diǎn)基因的獲取

分別以川芎、白芍、熟地黃、當(dāng)歸為關(guān)鍵詞在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）進(jìn)行檢索，獲取各單味藥的相關(guān)活性成分及靶點(diǎn)。將檢索后得到的活性成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[14]為納入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物入血成分進(jìn)行篩選，得到其潛在活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息。將篩選后得到成分及靶點(diǎn)信息整合匯總并去掉重復(fù)靶點(diǎn)后，將靶點(diǎn)蛋白名依次輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到標(biāo)準(zhǔn)基因名稱并匯總。

2.2 CLI 靶點(diǎn)的獲取

以CLI 標(biāo)準(zhǔn)英文名稱“cholestatic liver injury”為檢索詞在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，得到CLI 相關(guān)疾病靶點(diǎn)。并剔除在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)對(duì)應(yīng)ID 號(hào)的靶點(diǎn)，保留有對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因名及ID 號(hào)的靶點(diǎn)并進(jìn)行匯總。

2.3 “藥物-成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用Cyctoscape 3.10.1 軟件將“2.1”項(xiàng)下收集得到的活性成分及其相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行可視化處理，分別構(gòu)建川芎、白芍、熟地黃、當(dāng)歸的“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。將上述所獲取的各單味中藥的作用靶點(diǎn)分別和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）網(wǎng)站中，即可得到川芎、白芍、熟地黃、當(dāng)歸與CLI 之間的交集靶點(diǎn)，并據(jù)此繪制韋恩圖。

2.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)韋恩圖的結(jié)果，將起主要治療作用的單味藥物靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/ ），將物種設(shè)置為“Mus musculus”，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，根據(jù)P值從小到大，篩選出藥物作用靶點(diǎn)的主要生物過(guò)程及信號(hào)通路，GO 分析取前10 位、KEGG 分析取前20 位結(jié)果。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，利用微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）在線繪制GO 分析條形圖及KEGG 富集分析氣泡圖，用于后續(xù)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.5 四物湯各單味藥水提物的制備

分別稱取川芎、白芍、熟地黃、當(dāng)歸飲片各20 g，打碎成粉末狀后裝入藥包，加入200 mL 水，在圓底燒瓶中浸泡1 h，之后的操作根據(jù)各藥物性質(zhì)的不同時(shí)間長(zhǎng)短有所不同，其中川芎加熱回流1.5 h，濾過(guò)，藥渣以同樣的方法再煮1.5 h 并濾過(guò)[15]；白芍加熱回流2 h，濾過(guò)，藥渣以同樣的方法再煮1.5 h并濾過(guò)[16]；熟地黃、當(dāng)歸加熱回流30 min，濾過(guò)，藥渣以同樣的方法再煮20 min 并濾過(guò)[17-18]。將2 次濾過(guò)后藥液混合后進(jìn)行抽濾，所得液體通過(guò)旋蒸儀濃縮至50～100 mL，收集濃縮藥液，取部分應(yīng)用HPLC 測(cè)定并采取外標(biāo)法測(cè)定熟地黃水提物中5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為5.07 mg/mL、白芍水提物中氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為4.09 mg/mL、當(dāng)歸水提物中阿魏酸質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL、川芎水提物中洋川芎內(nèi)酯A 質(zhì)量濃度為2.2 mg/mL。其余藥液室溫冷卻后放置?80 ℃冷凍過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)，直至凍干至粉末狀，收集水提物粉末待用。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.6.1 分組、造模與給藥 采用隨機(jī)分組法將C57BL/6J 小鼠分成假手術(shù)組、模型組、川芎水提物組、白芍水提物組、熟地黃水提物組和當(dāng)歸水提物組，每組8 只（雌雄各4 只）。除假手術(shù)組外，其余各組均進(jìn)行膽總管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）手術(shù)。小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)，持續(xù)異氟烷氣體麻醉，將小鼠腹部毛發(fā)剔除，用醫(yī)用碘伏和75%乙醇交替消毒，在會(huì)陰上1 cm 處剪開(kāi)皮膚，開(kāi)口至劍突下1 cm 左右，逐層分離皮下筋膜及肌肉層，暴露腹腔臟器，并使用撐開(kāi)器將兩側(cè)組織持續(xù)撐開(kāi)，用沾有PBS 溶液的無(wú)菌棉簽將小鼠的肝臟和胃腸朝上下不同方向撥開(kāi)，分離膽總管，用5-0 手術(shù)縫合線結(jié)扎膽總管，結(jié)束后由內(nèi)向外逐層縫合各層組織。假手術(shù)組同樣進(jìn)行腹部組織切開(kāi)及縫合，但不對(duì)膽總管進(jìn)行結(jié)扎。參考文獻(xiàn)報(bào)道[19]選擇最佳的水提物治療劑量（50 mg/kg），各給藥組ig 相應(yīng)藥物，術(shù)前3 d 開(kāi)始預(yù)給藥，術(shù)后恢復(fù)2 d 后繼續(xù)給藥4 d。

2.6.2 血清樣品的采集與處理 使用烏拉坦（1.4 g/kg）ip 麻醉成功后，從小鼠下腔靜脈采集血樣，常溫放置30 min，待其凝固后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取上清，置于1.5 mL EP 管中，即為血清樣品。取部分血清稀釋5 倍，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)，其余放置于?80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

2.6.3 肝臟組織病理變化觀察 取血后，小鼠脫頸椎處死，解剖分離肝臟。取部分肝臟組織經(jīng)福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在超分辨顯微組織成像系統(tǒng)下觀察病理學(xué)變化。

2.6.4 肝損傷指標(biāo)檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL 含量，同時(shí)檢測(cè)肝組織中HYP 水平。

2.6.5 肝組織基因表達(dá)檢測(cè) 各組取部分肝臟組織，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。肌動(dòng)蛋白2（actin alpha 2，Acta2）、I 型膠原α 1 鏈（collagen type I alpha 1 chain，Col1a1）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，Timp1）、基質(zhì)金屬肽酶12（matrix metallopeptidase 12，Mmp12）、Mmp13、Mmp14、核受體亞家族3C 組成員2（nuclear receptor subfamily 3 group C member 2，Nr3c2）、類視黃醇X受體（retinoid X receptor alpha，Rxra）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2）、血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule 1，Vcam1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf）、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 8，Mapk8）、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT serine/threonine kinase 1，Akt1）、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體（kinase insert domain receptor，Kdr）、Mapk14、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，Hprt1）引物序列見(jiàn)表1，以Hprt1作為內(nèi)參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，結(jié)果以±s表示，組間采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。

3 結(jié)果

3.1 四物湯各單味藥活性成分及靶點(diǎn)的獲取、CLI相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃活性成分的檢索，以及根據(jù)設(shè)定好的納入標(biāo)準(zhǔn)OB≥30%及DL≥0.18 進(jìn)行篩查，共得到川芎的6 個(gè)活性成分和30 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，白芍共獲取7個(gè)活性成分以及90 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，熟地黃僅獲取2 個(gè)活性成分和31 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，當(dāng)歸僅獲取2 個(gè)活性成分但包含52 個(gè)藥物靶點(diǎn)（活性成分見(jiàn)表2）。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)使用Cyctoscape 3.10.1 軟件分別繪制川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃的“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1）。通過(guò)對(duì)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，共獲得CLI 的843 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，剔除在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)對(duì)應(yīng)ID 號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)基因名的靶點(diǎn)，最終得到753 個(gè)疾病靶點(diǎn)。結(jié)果顯示川芎與白芍活性成分較多，白芍與當(dāng)歸的作用靶點(diǎn)較多，熟地黃的活性成分及作用靶點(diǎn)均較少。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度分析，川芎、白芍、當(dāng)歸的藥理作用相對(duì)廣泛，而熟地黃的藥理作用相對(duì)局限。

圖1 川芎 (A)、白芍 (B)、熟地黃 (C)、當(dāng)歸 (D) 活性成分及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of active ingredients and targets of Chuanxiong Rhizoma (A), Paeoniae Radix Alba (B), Rehmanniae Radix Praeparata (C) and Angelicae Sinensis Radix (D)

表2 納入網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)4 種單味藥中的活性成分Table 2 Active ingredients included in four individual herbs in network pharmacology

3.2 川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃與CLI 交集靶點(diǎn)的獲取

將各單味藥獲取的靶點(diǎn)基因與CLI 靶點(diǎn)基因分別導(dǎo)入生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)站，得到川芎與CLI 的14 個(gè)交集靶點(diǎn)、白芍與CLI 的37 個(gè)交集靶點(diǎn)、當(dāng)歸與CLI 的15 個(gè)交集靶點(diǎn)、熟地黃與CLI的5 個(gè)交集靶點(diǎn)。并據(jù)此結(jié)果分別繪制韋恩圖（圖2）。結(jié)果顯示，川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃分別有46.7%、41.1%、28.8%、16.1%的靶點(diǎn)基因可作用于CLI。因此，推測(cè)4 味藥均能作用于CLI，但川芎、白芍對(duì)CLI 療效的特異性明顯高于當(dāng)歸、熟地黃。

3.3 基于體內(nèi)CLI 模型驗(yàn)證4 種單味藥藥效及其中關(guān)鍵單味藥的藥效機(jī)制

上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃與CLI 之間均存在靶點(diǎn)交集，故均存在改善CLI 的可能，CLI 伴隨著膽汁淤積、肝損傷以及肝纖維化等異常改變，進(jìn)一步通過(guò)BDL 手術(shù)模型模擬CLI 并評(píng)估單味藥藥效。

3.3.1 白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃對(duì)CLI 的改善作用 如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 活性顯著升高（P＜0.01、0.001），經(jīng)治療后除熟地黃組外，白芍、川芎、當(dāng)歸組對(duì)該指標(biāo)均存在不同程度的改善（P＜0.05、0.001），但各單味藥治療組之間差異并不顯著，表明四物湯各單味藥均能改善CLI，其中白芍組的改善最為顯著。同時(shí)，對(duì)血清中ALP 活性及TBA、TBIL 含量檢測(cè)結(jié)果表明，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃均能改善BDL誘導(dǎo)的膽管損傷和膽汁淤積情況。熟地黃對(duì)ALP 和TBIL 改善不顯著，當(dāng)歸對(duì)TBIL 改善不顯著，但仍呈現(xiàn)改善病理狀態(tài)的趨勢(shì)。白芍、川芎總體療效略優(yōu)于當(dāng)歸、熟地黃。進(jìn)一步檢測(cè)了肝組織中HYP 的含量，結(jié)果顯示BDL 術(shù)后小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯纖維化改變（P＜0.001），經(jīng)治療后白芍組、川芎組、當(dāng)歸組、熟地黃組小鼠CLI 癥狀均明顯減輕（P＜0.001），組間差異并不顯著。據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，白芍、川芎可能具有更顯著的抗CLI 療效。

圖3 各組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性及TBA、TBIL 水平和肝臟HYP 含量 (±s , n = 8)Fig.3 ALT, AST, ALP activities, TBA, TBIL levels in serum and HYP content in liver tissue of mice in each group(±s , n = 8)

肝臟HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖4，與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)明顯肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積，經(jīng)白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃水提物治療后上述病理改變均出現(xiàn)了不同程度的好轉(zhuǎn)，其中白芍組與川芎組的改善最為明顯。

圖4 各組小鼠肝臟病理變化 (HE，×20)Fig.4 Pathological changes in liver of mice in each group (HE, × 20)

為進(jìn)一步檢測(cè)各組小鼠CLI 程度的變化，檢測(cè)了肝組織中CLI 相關(guān)基因表達(dá)。如圖5 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肝臟中Acta2、Col1a1、Timp1、Mmp12、Mmp13、Mmp14基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；經(jīng)白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃水提物治療后均出現(xiàn)了不同程度的逆轉(zhuǎn)，其中當(dāng)歸、熟地黃對(duì)部分基因表達(dá)改善不顯著，白芍、川芎對(duì)以上基因表達(dá)均有顯著改善（P＜0.05、0.01、0.001），但各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，川芎組與白芍組對(duì)CLI 的改善作用最為明顯。

圖5 各組小鼠肝臟中Acta2、Col1a1、Timp1、Mmp12、Mmp13、Mmp14 基因表達(dá) (±s , n = 8)Fig.5 Acta2, Col1a1, Timp1, Mmp12, Mmp13 and Mmp14 gene expressions in liver of mice in each group (±s , n = 8)

3.3.2 白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃與CLI 之間共同與獨(dú)立交集靶點(diǎn)的獲取 上述結(jié)果顯示，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃均能改善CLI，推測(cè)各單味藥與CLI 之間可能存在共同的交集靶點(diǎn)；白芍與川芎對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善顯著優(yōu)于當(dāng)歸組與熟地黃組，推測(cè)白芍、川芎可能存在不同于熟地黃、當(dāng)歸的特異性靶向CLI 的靶點(diǎn)。將各單味藥與CLI 的作用靶點(diǎn)共同輸入生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)站，并繪制韋恩圖。結(jié)果顯示，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃與CLI共同交集靶點(diǎn)為3 個(gè)。白芍與CLI 獨(dú)立的交集靶點(diǎn)有18 個(gè)，川芎與CLI 獨(dú)立的交集靶點(diǎn)有4 個(gè)，當(dāng)歸、熟地黃與CLI 之間不存在獨(dú)立于其他藥物的交集靶點(diǎn)（圖6）。

圖6 各單味藥與CLI 的共同與獨(dú)立交集靶點(diǎn)Fig.6 Intersection of shared and unique targets between each individual herb and CLI

3.3.3 白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃通過(guò)3 個(gè)共同靶點(diǎn)改善CLI 上述結(jié)果顯示，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃與CLI 共同交集靶點(diǎn)為3 個(gè)，分別為Nr3c2、Rxra、Ptgs2，使用qRT-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證了以上3 個(gè)靶點(diǎn)基因在各組小鼠肝臟中的表達(dá)。如圖7 所示，與假手術(shù)組比較，模型組中Nr3c2、Rxra、Ptgs2表達(dá)顯著升高（P＜0.05、0.001）；經(jīng)白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃治療后以上基因表達(dá)均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。表明白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃可通過(guò)降低Nr3c2、Rxra、Ptgs2的表達(dá)共同改善CLI。

圖7 各組小鼠肝臟中Nr3c2、Ptgs2、Rxra 基因表達(dá) (±s, n = 8)Fig.7 Nr3c2, Ptgs2 and Rxra gene expressions in liver of mice in each group (±s, n = 8)

3.3.4 白芍通過(guò)TNF 通路改善CLI 韋恩圖結(jié)果顯示，白芍與CLI 之間有18 個(gè)獨(dú)立交集靶點(diǎn)，這與推測(cè)相符合。為進(jìn)一步證實(shí)白芍是否通過(guò)這些交集靶點(diǎn)特異性改善了CLI，將白芍對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 與KEGG 分析，GO 分析選取10 條主要結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)白芍作用靶點(diǎn)富集于細(xì)胞凋亡、一氧化氮生物合成、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生、血管生成、一氧化氮合酶活性、肝再生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附等生物過(guò)程。KEGG 分析結(jié)果選取20 條主要信號(hào)通路，選擇了既往有大量研究報(bào)道與肝損傷相關(guān)[20-22]的TNF 信號(hào)通路，并推測(cè)白芍可能通過(guò)TNF 通路改善CLI（圖8）。

圖8 白芍GO 分析柱狀圖 (A) 和KEGG 分析氣泡圖 (B)Fig.8 Bar graph of GO analysis (A) and bubble graph of KEGG analysis (B) for Paeoniae Radix Alba

通過(guò)qRT-PCR 評(píng)估了白芍與CLI 的18 個(gè)獨(dú)立交集靶點(diǎn)并富集于TNF 通路中的Vcam1、Tnf、Mapk8、Akt1的表達(dá)水平，如圖9 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肝臟中以上基因表達(dá)均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，白芍治療后能顯著降低BDL 術(shù)后以上基因的高表達(dá)（P＜0.05、0.01），表明白芍可能通過(guò)TNF 通路改善CLI。

圖9 各組小鼠肝臟中Akt1、Mapk8、Tnf、Vcam1 基因表達(dá) (±s, n = 8)Fig.9 Akt1, Mapk8, Tnf and Vcam1 gene expressions in liver of mice in each group (±s, n = 8)

3.3.5 川芎通過(guò)VEGF 通路改善CLI 根據(jù)韋恩圖結(jié)果，發(fā)現(xiàn)川芎與CLI 之間有4 個(gè)獨(dú)立交集靶點(diǎn)。將川芎的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 分析，GO 分析選取10 條主要結(jié)果顯示，川芎作用靶點(diǎn)富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一氧化氮合成、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞增殖、缺氧反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成等生物過(guò)程。KEGG 分析結(jié)果選取前20 條主要信號(hào)通路，考慮到既往大量研究結(jié)果顯示VEGF 通路與肝損傷過(guò)程密切相關(guān)[23-25]，推測(cè)川芎可能通過(guò)VEGF 通路改善CLI，選擇VEGF通路進(jìn)行后續(xù)研究（圖10）。

圖10 川芎GO 分析柱狀圖 (A) 和KEGG 分析氣泡圖 (B)Fig.10 Bar graph of GO analysis (A) and bubble graph of KEGG analysis (B) for Chuanxiong Rhizoma

通過(guò)qRT-PCR 評(píng)估了川芎與CLI 的4 個(gè)交集靶點(diǎn)并富集于VEGF 通路中的Kdr、Mapk14的表達(dá)水平，如圖11 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肝臟中以上基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，經(jīng)川芎治療后以上基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明川芎可能通過(guò)VEGF 通路改善CLI。

圖11 各組小鼠肝臟中Kdr、Mapk14 基因表達(dá) (±s , n = 8)Fig.11 Kdr and Mapk14 gene expressions in liver of mice in each group (±s , n = 8)

4 討論

膽汁淤積可能由多種原因引起，除了肝膽相關(guān)疾病、膽道結(jié)構(gòu)異常、藥物、感染等因素外，近年來(lái)有研究報(bào)道了食物添加劑、膳食補(bǔ)充劑和腸外營(yíng)養(yǎng)等所含的成分也可引發(fā)CLI[26]。CLI 可以導(dǎo)致黃疸、膽絞痛、消化不良、惡心、嘔吐、皮膚瘙癢、腹脹等各種癥狀和并發(fā)癥。CLI 涉及的病理機(jī)制復(fù)雜，病理過(guò)程較多，單一藥物成分或靶點(diǎn)往往只能改善部分病理指標(biāo)，且難以阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展。而中醫(yī)藥具有一方多藥、一藥多成分，以及多通路、多靶點(diǎn)共同作用的特點(diǎn)，可從多方面協(xié)同改善膽汁淤積引起的肝損傷及肝纖維化。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩查，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了“四物湯單味藥-治療靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藥效，探討四物湯治療CLI 的主要作用靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制。

以往已有大量研究報(bào)道了四物湯治療肝膽相關(guān)疾病的研究。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)報(bào)道了四物湯對(duì)肝臟具有的保護(hù)作用[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)四物湯不僅通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸穩(wěn)態(tài)，還通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境以減少炎癥反應(yīng)、改善CLI[10-11]。但目前尚無(wú)報(bào)道四物湯中4 味單藥改善肝損傷的療效對(duì)比研究，因此本研究對(duì)川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃改善CLI 進(jìn)行了療效比較。結(jié)果顯示，川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃4 個(gè)單味藥均能改善CLI。將4 個(gè)單味藥與CLI 靶點(diǎn)取交集后發(fā)現(xiàn)它們通過(guò)3 個(gè)共同靶點(diǎn)（Nr3c2、Rxra、Ptgs2）作用于CLI。因此推測(cè)白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃可通過(guò)以上3 個(gè)靶點(diǎn)共同改善肝損傷，qRT-PCR 結(jié)果顯示，白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃可能均能下調(diào)肝臟中Nr3c2、Rxra、Ptgs2的表達(dá)。既往研究報(bào)道了這3 個(gè)靶點(diǎn)均與肝膽疾病密切相關(guān)，NR3C2、PTGS2 參與調(diào)控小鼠肝缺血再灌注損傷[27-28]，RXRA 在HSC 激活以及促進(jìn)CLI 中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。表明川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地黃可能通過(guò)調(diào)節(jié)Nr3c2、Rxra、Ptgs2共同改善了CLI。

考慮到白芍、川芎、當(dāng)歸、熟地黃與CLI 之間交集靶點(diǎn)的差異性，以及川芎、白芍對(duì)CLI 的改善明顯優(yōu)于當(dāng)歸、熟地黃，推測(cè)川芎、白芍與CLI 之間是否存在相對(duì)獨(dú)立的特異性作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，白芍存在18 個(gè)獨(dú)立靶點(diǎn)作用于CLI，川芎存在4 個(gè)獨(dú)立靶點(diǎn)作用與CLI，而當(dāng)歸、熟地黃不存在獨(dú)立作用靶點(diǎn)。對(duì)白芍的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)富集于炎癥、肝再生、血管生成等與肝損傷和纖維化密切相關(guān)的生物過(guò)程[30-32]，同時(shí)KEGG 分析顯示白芍靶點(diǎn)富集于TNF 信號(hào)通路。進(jìn)一步評(píng)估了白芍與CLI 的獨(dú)立交集靶點(diǎn)基因，發(fā)現(xiàn)Vcam1、Tnf、Mapk8、Akt1等基因均富集于TNF通路，且在模型組明顯上調(diào)，而給予白芍治療后明顯下調(diào)，由此推測(cè)白芍可能通過(guò)TNF 通路相關(guān)基因改善了CLI。既往研究報(bào)道了VCAM1 促進(jìn)LSEC毛細(xì)血管化和肝纖維化[33]；抑制TNF-α 可改善小鼠BDL 后的肝星狀細(xì)胞活化以及肝纖維化[34]；MAPK8 的表達(dá)與藥物性肝損傷相關(guān)[35]；Akt 在肝損傷伴隨的炎癥、細(xì)胞增殖、遷移和纖維形成中有著重要的作用[36]，這些基因均顯示出與肝損傷與肝纖維化的緊密相關(guān)性。此外，TNF 可作為上游基因誘導(dǎo)VCAM1 表達(dá)[37-38]，而VCAM1 可通過(guò)激活下游的Akt 和MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移[39]。綜上，推測(cè)白芍可能通過(guò)TNF/VCAM1/Akt/MAPK 相關(guān)通路改善了CLI，其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究，以確定其上下游及相互作用關(guān)系。此外，GO 富集分析顯示川芎的作用靶點(diǎn)富集于與CLI密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管生成等生物過(guò)程；KEGG 分析顯示川芎靶點(diǎn)富集于VEGF 信號(hào)通路，這可能與其特異性改善CLI 有關(guān)。進(jìn)一步評(píng)估了川芎與CLI 的獨(dú)立交集靶點(diǎn)基因，發(fā)現(xiàn)Kdr、Mapk14富集于VEGF 通路，二者在模型組明顯上調(diào)，而給予川芎治療后明顯下調(diào)，因此推測(cè)川芎通過(guò)VEGF 通路改善CLI。Kdr（VEGFR2）作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，與血管生成以及肝纖維化顯著相關(guān)[40-41]，此外，抑制MAPK14 可緩解酒精引起的肝損傷[42]，同時(shí)MAPK14 為VEGFA 的上游調(diào)節(jié)因子[43]。因此，推測(cè)川芎可能通過(guò)MAPK14/VEGF/VEGFR2 相關(guān)通路改善CLI。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)分析、體內(nèi)動(dòng)物模型和分子生物學(xué)手段，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了四物湯防治CLI 的關(guān)鍵單味藥及其作用靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)四物湯中各單味藥均能改善膽汁淤積引起的肝損傷及纖維化，4 個(gè)單味藥共同通過(guò)靶向Nr3c2、Rxra、Ptgs2發(fā)揮療效。此外，川芎、白芍顯示出更優(yōu)藥效，白芍通過(guò)調(diào)控TNF 通路基因改善CLI，而川芎改善CLI 則與調(diào)控VEGF 通路相關(guān)。本研究為傳統(tǒng)方藥四物湯及其組成的臨床應(yīng)用與機(jī)制研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為病理機(jī)制復(fù)雜的CLI 治療方案提供了理論指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突