肖駿琦，侯慶豐，江志強，羅會霖，謝洋，張雷英，曾祥泰

（1.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 血管外科，江西 贛州 341000；2.贛南醫(yī)學院，江西 贛州341000；3.贛州市甲狀腺腫瘤重點實驗室，江西 贛州 341000；4.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 甲狀腺外科，江西 贛州 341000）

動脈粥樣硬化性心血管疾病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q冠心病）、缺血性腦卒中、主動脈瘤和下肢缺血。最近研究表明環(huán)境污染在心血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化中起著重要作用[1]。環(huán)境污染通過氧化應激、炎癥、血小板活化及其他途徑導致動脈粥樣硬化。作為主要無機污染物的重金屬離子也會促進心血管疾病和動脈粥樣硬化[2]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘是動脈粥樣硬化發(fā)展的潛在因素之一[3]。鎘與金屬硫蛋白結合，釋放到循環(huán)血液中，然后輸送到靶細胞和組織，可導致線粒體損傷、細胞死亡、炎癥和纖維化[4]。此外，低劑量鎘暴露也會提高病死率[5]。因此，評估鎘暴露的總體毒理學影響，包括其在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用，這也是近年來研究的熱點。本研究通過復制動脈粥樣硬化斑馬魚模型，并用不同濃度的鎘進行處理，探索鎘在促動脈粥樣硬化中的作用及其相關作用機制，為后續(xù)動脈粥樣硬化鎘暴露的預防提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18 只Tg（kdrl：EGFP）系幼年斑馬魚（武漢國家斑馬魚資源中心），培育繁殖斑馬魚子代，用于復制動脈粥樣硬化斑馬魚模型。本研究主要在贛南醫(yī)學院實驗室和贛南師范大學斑馬魚實驗室進行。成年斑馬魚飼養(yǎng)條件按照標準實驗室條件飼養(yǎng)，本研究程序及動物使用方案已通過動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

脂多糖（美國Sigma 公司，貨號：L2880），阿托伐他汀（美國輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051408，規(guī)格：20 mg），實驗室用標準溶液鎘Cd單元素標準品（上海希言科學儀器有限公司，貨號：N9300176r），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色（上海滬震生物公司，貨號：HZ7070），免疫組織化學試劑盒（上海凱基生物公司，貨號：KGOS60），免疫組織化學CD31、CD68、HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF一抗（美國Abcam 公司產(chǎn)品）。

1.3 脂多糖及鎘溶液的配制

將1 mg 脂多糖重懸于1 mL 無菌平衡鹽溶液，輕輕旋渦振蕩直至粉末完全溶解得到1 mg/mL 儲存液，分裝后置于-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩①徺I的標準溶液鎘進行稀釋后備用[6-7]。

1.4 Tg（kdrl：EGFP）成年動脈粥樣硬化斑馬魚的復制

將18 只Tg（kdrl：EGFP）幼年斑馬魚（雄雌各半）在含有10 μg/mL 脂多糖的Egg water 中飼養(yǎng)，并用含8%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)45 d，少量多餐，復制Tg（kdrl：EGFP）]成年動脈粥樣硬化斑馬魚模型[8]。

1.5 實驗分組

將復制成功的成年動脈粥樣硬化斑馬魚分為3 組，每組6 只：A 組不做處理；B 組添加30 μmol/L 鎘，鎘濃度通過系統(tǒng)水達到此濃度；C 組添加30 μmol/L鎘+ 阿托伐他汀，阿托伐他汀通過浸泡給藥。

1.6 實驗方法

1.6.1 血清鎘濃度檢測鎘處理后，用5 號針頭在各組斑馬魚尾靜脈取血約200 μL，離心后收集血清，分裝標記后置于-20 ℃冰箱保存待測[9]。

1.6.2 熒光顯微鏡觀察斑馬魚血管中的膽固醇積累和血管內(nèi)皮厚度模型復制并鎘處理后，禁食24 h，使用Tg（kdrl：EGFP）動脈粥樣硬化斑馬魚模型，在飼料中添加10 μg/g 熒光膽固醇，C 組加入阿托伐他汀 200 μg/L，浸泡給藥。模型復制5 d 后，將斑馬魚浸入0.03% 3-氨基苯甲酸乙酯溶液中≤ 3 min 以誘導麻醉，在熒光顯微鏡下觀察，使用Imaris?軟件對圖像進行3D 分析，用于量化膽固醇積累和血管內(nèi)皮細胞[10]。

1.6.3 HE染色模型復制并鎘處理后，禁食24 h，將所有斑馬魚浸泡在過量的3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸（1.33 g/L）中安樂死，并用多聚甲醛完全固定，手術切取各組斑馬魚血管斑塊組織標本，切片后冷凍保存待測。依次將切片放入二甲苯、酒精中脫蠟后蒸餾水洗，放入Harris 蘇木精染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化5 s，自來水沖洗2 min，0.6%氨水返藍，流水沖洗2 min，伊紅染色2 min，酒精和二甲苯脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡鏡下觀察并收集圖像進行分析。

1.6.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA表達采用TRIzol 法提取各組斑馬魚血管斑塊組織總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，以其為模板，用qRT-PCR 試劑盒擴增，反應條件：94 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對表達量。qRTPCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blotting 檢測斑馬魚血管斑塊組織HIF-1a、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白表達取各組斑馬魚血管斑塊組織加入適量RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液，加入等量總蛋白上樣，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉至PVDF 膜上，置入含5%脫脂奶粉的封閉液內(nèi)封阻1 h，分別加入一抗（1∶500）后置于4 ℃中過夜，PBST 洗滌3 次，10 min/次，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵化2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次，加入ECL 試劑顯影，以β-actin 為內(nèi)參，使用Image J 軟件分析各蛋白相對表達量，實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組斑馬魚血清鎘濃度比較

A、B、C 組斑馬魚血清鎘濃度分別為（10.32±0.46）、（25.54±1.21）、（26.61±1.32）μmol/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=849.200，P=0.000）；B、C 組血清鎘濃度高于A 組（P＜0.05）；B 組與C 組血清鎘濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組斑馬魚血管內(nèi)皮厚度和血管中膽固醇積累情況

A、B、C 組斑馬魚血管內(nèi)皮厚度分別為（3.32±0.28）、（5.61±0.32）、（3.41±0.29）μm，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=114.300，P=0.000）；B 組斑馬魚血管內(nèi)皮層厚度較A、C 組增厚（P＜0.05），且血管中膽固醇積累明顯；A 組與C 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3組斑馬魚血管中膽固醇積累情況

2.3 各組斑馬魚血管斑塊組織的HE染色情況

與A、C 組比較，B 組炎癥細胞浸潤的脂肪變性更明顯，且細胞核懸掛在中心或擠壓到側面。見圖2。

圖2 3組斑馬魚血管斑塊組織（HE染色×400）

2.4 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對表達量比較

A、B、C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對表達量均高于A、C 組（P＜0.05）；A 組與C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對表達量比較（n=6，±s）

表2 3組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對表達量比較（n=6，±s）

注：? 與A、C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組F 值P 值VEGF mRNA 6.21±1.54 16.76±4.26?5.97±1.49 254.816 0.000 HIF-1α mRNA 8.43±1.41 15.26±2.54?8.61±1.67 265.320 0.000 p-Akt mRNA 5.21±1.13 13.36±3.21?5.47±1.29 287.612 0.000 p-P70 mRNA 3.22±0.61 7.62±1.11?3.37±0.68 143.165 0.000

2.5 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對表達量比較

A、B、C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白相對表達量均高于A、C 組（P＜0.05）；A 組與C 組斑馬魚血管斑塊組織差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3和圖3。

圖3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白的表達

表3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對表達量比較（n=6，±s）

表3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對表達量比較（n=6，±s）

注：? 與A、C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組F 值P 值VEGF蛋白0.25±0.05 0.41±0.07?0.27±0.06 12.472 0.029 HIF-1α蛋白0.32±0.06 0.51±0.08?0.31±0.06 17.652 0.021 p-Akt蛋白0.29±0.05 0.57±0.09?0.28±0.05 14.432 0.023 p-P70蛋白0.24±0.04 0.42±0.06?0.25±0.05 12.165 0.031

3 討論

鎘是一種持久性的非必需有毒金屬，在職業(yè)和環(huán)境暴露水平上都會對健康產(chǎn)生不利影響，最顯著的毒性作用是腎臟損傷和骨質(zhì)疏松/骨軟化。此外，鎘具有致癌作用，在職業(yè)暴露時會導致肺氣腫[11]。人類對鎘的接觸普遍存在，主要的接觸來源是食物和煙草煙霧。鎘存在于農(nóng)業(yè)土壤中，既作為自然背景，也因磷肥而增加。對非吸煙者，水稻、小麥、蔬菜和土豆通常等農(nóng)產(chǎn)品占攝入量的主要部分。在歐洲和北美，鎘攝入量為10～20 μg/d[12]，鎘主要積聚在腎臟（約50%）、肝臟和肌肉中。紅細胞中也發(fā)現(xiàn)有高濃度鎘，而其在血漿中的濃度非常低。鎘沒有有效的排泄機制，只有少量的鎘通過尿液排泄，因此消除非常緩慢，半衰期為10～40年。

在對普通人群的鎘和心血管疾病綜述中，有9 項研究報告了鎘暴露與冠心病的關系。先前的綜述和薈萃分析還包括對動脈粥樣硬化性心血管疾病這一更廣泛疾病概念的研究，包括高血壓、心力衰竭或心律失常[13-16]。3 項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，血液或尿液鎘與動脈粥樣硬化性心血管疾病呈正相關[17-19]，這與最近的研究一致[20-22]，但其相關分子機制目前尚不明確。本研究通過復制斑馬魚動脈粥樣硬化模型，從組織、分子水平研究相關可能的作用機制。組織水平上通過對斑馬魚血管斑塊中膽固醇的積累情況進行分析，證實鎘可促進膽固醇積累，這與既往鎘能夠促進動脈粥樣硬化形成的研究結果一致，同時HE 染色證實鎘可促進氣球樣變等動脈粥樣硬化病理過程的發(fā)生。阿托伐他汀作為甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑，可顯著降低血清低密度脂蛋白膽固醇，中度降低甘油三酯，輕度升高高密度脂蛋白膽固醇，臨床上常用于治療高膽固醇血癥。本研究中在鎘處理的基礎上增加阿托伐他汀，斑馬魚斑塊組織中的膽固醇積累及氣球樣變明顯改善，再次證實其降膽固醇的作用。

PERSON 等[23]報道鎘可使肺癌細胞HIF-1α 水平升高，從而增強肺癌細胞的增殖、侵襲能力，因此認為鎘與HIF-1a 呈正相關。WANG 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活可促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，p-Akt 是PI3K/Akt/mTOR 信號活化的關鍵步驟，由此可見p-Akt 在動脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮重要作用。同時，CHEN 等[25]發(fā)現(xiàn)鎘可促進Akt 和P70的磷酸化水平，介導神經(jīng)細胞凋亡；此外，WEI 等[26]發(fā)現(xiàn)低濃度鎘可通過對內(nèi)皮細胞的氧化應激，介導血管增生。以上研究均認為鎘與HIF-1α、p-Akt、p-P70 與VEGF 密切相關。本研究結果顯示，鎘可促進HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 和蛋白表達，與上述研究結果相符。在鎘的基礎上增加阿托伐他汀后，HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 和蛋白相對表達量明顯降低，再次證實阿托伐他汀的降脂作用。

綜上所述，低濃度鎘可促進kdrl：EGFP轉基因斑馬魚的動脈粥樣硬化進程，相關分子機制與HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 有關，阿托伐他汀可逆轉鎘的促動脈粥樣硬化進程。考慮到本研究目前僅在斑馬魚中進行，可能存在一定的局限性，后續(xù)還需要進一步研究是否涉及其他相關分子機制。