趙健 劉松杰 張觀朝 沈裕厚 李鳳臣 徐兵

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院/新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院 1普通外科，2普瘤科 （河南新鄉(xiāng) 453000）

胃癌，也稱為胃腺癌，是全球第五大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第三大原因［1］。盡管在外科手術、放化療、靶向及免疫治療等治療方法方面取得了許多進展，但近年來中晚期胃癌患者的總體生存狀況仍然在很大程度上不令人滿意［2］。中晚期胃癌根治性切除后，近一半的患者會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)［3］。遠處轉(zhuǎn)移和局部復發(fā)是中晚期胃癌患者死亡的主要原因［4］。因此，需要做出巨大的努力來更好地評估預后，以進行針對性治療，改善預后狀況。著絲粒蛋白F（CENPF）是一種與細胞周期相關的核抗原［5］。CENPF 將絲狀體-線粒體復合體復合物關聯(lián)起來，對癌癥進展有影響，在各種人類惡性腫瘤中觀察到高表達的CENPF，例如胃癌、前列腺癌、乳腺癌和肝細胞癌等［6］。微小核糖核酸（miRNA）通常通過介導下游靶基因來促進或抑制癌細胞進展，人類癌癥中經(jīng)常失調(diào)的miRNA 提示了其作為關鍵調(diào)節(jié)因子的功能［7］。研究表明微小核糖核酸-1-3p（miR-1-3p）的過表達抑制了細胞有氧糖酵解和胃癌細胞的增殖［8］。在前人研究中未對CENPF、miR-1-3p 在中晚期胃癌患者中表達進行探究，因此本次研究通過檢測中晚期胃癌患者血清中CENPF、miR-1-3p的水平情況，探討其與預后的相關性，以期為中晚期胃癌的預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019 年3 月至2020 年3 月我院收治的60 例中晚期胃癌患者即為研究組（已經(jīng)過病理檢測確診），男32 例，女28 例，年齡52 ～70 歲，平均（62.30 ± 6.48）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（22.15 ± 2.36）kg/m2，按照TNM 分期來分，Ⅱb 期19 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期17 例，發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的有18 例。同期在我院體檢中心體檢健康的志愿者60 例為對照組，男33 例，女27 例，年齡50 ～ 70 歲，平均（62.20 ± 6.54）歲，BMI 為（22.17 ± 2.42）kg/m2。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），有可比性，見表1。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學倫理委員會審核批準（2019-136-01K），患者或家屬知情并同意。納入標準：（1）經(jīng)過CT、MRI、病理學檢查診斷為胃癌［9］；（2）TNM 分期為Ⅱb-Ⅳ期；（3）資料完整。排除標準：（1）患有其他惡性腫瘤的患者；（2）患有免疫性疾病的患者；（3）患有傳染性疾病的患者；（4）合并心臟、肝臟、腎臟嚴重功能異常的患者；（5）患有精神異常的患者。

表1 一般資料比較Tab.1 Comparison of general information ±s

表1 一般資料比較Tab.1 Comparison of general information ±s

組別例數(shù)年齡（歲）BMI（kg/m2）TNM分期（例）性別（男/女，例）33/27 32/28 0.034 0.855淋巴結轉(zhuǎn)移（例）對照組研究組χ2/t值P值60 60 62.20 ± 6.54 62.30 ± 6.48 0.084 0.933 22.17 ± 2.42 22.15 ± 2.36 0.046 0.964Ⅱb-19Ⅲ期-24Ⅳ期-17-18

1.2 方法

1.2.1 血清CENPF、miR-1-3p水平檢測抽取所有研究組患者住院次日和志愿者體檢當天的空腹靜脈血10 mL，以4 500 r/min 的速度離心15 min，離心半徑為20 cm，取其上清液放置于-80 ℃冰箱內(nèi)待用。取所有血清樣本，利用TRIzol（貨號：15596-026，購自于賽默飛世爾科技有限公司）分離所有血清中的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度以及完整性。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：K1622，購自于上海玉博生物科技有限公司）試劑盒使用說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在實時熒光定量PCR 儀（型號：M381409，購自于上海艾研生物科技有限公司）上進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應。使用2×SYBR Green qPCR Master Mix （貨號：A0001-R2，北京百奧創(chuàng)新科技有限公司）進行qPCR。20 μL 反應體系：cDNA 1 μL，上下引物（10 pmol/μL）各1 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為95 ℃，3 min；95 ℃，20 s；58 ℃，35 s；45 個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算CENPF、miR-1-3p 表達水平。見表2。

表2 qRT-PCR 引物序列Tab.2 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 預后對所有研究對象進行出院后3 年的隨訪，每3 個月進行1 次，隨訪截止于2023 年3 月或患者死亡。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 25.0 軟件對本研究數(shù)據(jù)進行處理。將符合正態(tài)分布且方差齊的計量數(shù)據(jù)用均值±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗分析兩組之間的差異；三組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料用例表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 法分析血清中CENPF、miR-1-3p 水平的相關性；采用Kaplan-Meier 法分析CENPF、miR-1-3p 表達與中晚期胃癌患者預后的關系；COX 回歸分析影響中晚期胃癌患者預后的危險因素。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清CENPF、miR-1-3p 水平比較與對照組比較，研究組患者CENPF 水平明顯升高，miR-1-3p 水平明顯降低（P＜ 0.05），見表3。

表3 兩組血清CENPF、miR-1-3p 水平比較Tab.3 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels between the two groups ±s

表3 兩組血清CENPF、miR-1-3p 水平比較Tab.3 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels between the two groups ±s

組別對照組研究組t值P值例數(shù)60 60 CENPF/GAPDH 1.02 ± 0.11 1.35 ± 0.21 10.783＜ 0.001 miR-1-3p/U6 1.01 ± 0.12 0.75 ± 0.14 10.922＜ 0.001

2.2 中晚期胃癌患者血清中CENPF、miR-1-3p 水平的相關性分析通過生物信息學StarBase 網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）發(fā)現(xiàn)CENPF、miR-1-3p存在結合位點，相關性分析結果顯示，中晚期胃癌患者血清中CENPF 和miR-1-3p 水平呈負相關（r=-0.650，P＜ 0.001）。見圖1、圖2。

圖1 CENPF 與miR-1-3p 結合位點圖Fig.1 Binding sites of CENPF and miR-1-3p

圖2 CENPF、miR-1-3p 水平的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of CENPF and miR-1-3p levels

2.3 不同臨床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p水平比較不同年齡、性別、BMI、腫瘤直徑下CENPF、miR-1-3p 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），不同TNM 分期和淋巴結轉(zhuǎn)移狀況下CENPF、miR-1-3p 水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 不同臨床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p 水平比較Tab.4 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels under different clinicopathological characteristics±s

表4 不同臨床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p 水平比較Tab.4 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels under different clinicopathological characteristics±s

注：與Ⅱb期相比，*P ＜ 0.05；與Ⅲ期相比，#P ＜ 0.05

病理特征年齡＞ 60歲≤ 60歲性別男女BMI例數(shù)CENPF t值P值miR-1-3p t值P值33 27 1.34 ± 0.22 1.36 ± 0.20 0.365 0.717 0.76 ± 0.13 0.74 ± 0.15 0.553 0.582 32 28 1.35 ± 0.22 1.36 ± 0.20 0.183 0.855 0.75 ± 0.15 0.74 ± 0.13 0.274 0.785＞ 22 kg/m2≤ 22 kg/m2腫瘤最大徑＞ 4 cm＜ 4 cm TNM分期Ⅱb期Ⅲ期Ⅳ期淋巴結轉(zhuǎn)移是否33 27 1.36 ± 0.21 1.34 ± 0.22 0.359 0.721 0.76 ± 0.13 0.74 ± 0.15 0.553 0.582 35 25 1.37 ± 0.21 1.33 ± 0.22 0.713 0.479 0.74 ± 0.14 0.76 ± 0.13 0.562 0.576 19 24 17 1.20 ± 0.20 1.36 ± 0.21*1.52 ± 0.22*#10.45＜ 0.001 0.87 ± 0.15 0.74 ± 0.14*0.62 ± 0.13*#14.243＜ 0.001 18 42 1.48 ± 0.20 1.30 ± 0.21 3.085 0.003 0.60 ± 0.13 0.82 ± 0.14 5.694＜ 0.001

2.4 CENPF、miR-1-3p 表達與中晚期胃癌患者預后的關系對中晚期胃癌患者進行3 年時間的隨訪，以中晚期胃癌患者血清CENPF、miR-1-3p 相對表達量中位數(shù)1.35、0.72 為界，CENPF ＞ 1.35 與 ≤1.35 分別為CENPF 高表達組和低表達組，miR-1-3p ＞ 0.72 與≤ 0.72 分別為miR-1-3p 高表達組和低表達組，CENPF 高表達組患者3 年生存率63.33%（19/30）顯著低于低表達組93.33%（28/30）（χ2=7.954，P＜ 0.001）；miR-1-3p 高表達組患者3 年生存率96.67%（29/30）顯著高于低表達組60.00%（18/30）（χ2= 11.882，P= 0.001）。見圖3、4。

圖3 CENPF 表達與中晚期胃癌患者預后的關系Fig.3 Relationship between CENPF expression and prognosis in patients with advanced gastric cancer

圖4 miR-1-3p 表達與中晚期胃癌患者預后的關系Fig.4 Relationship between miR-1-3p expression and prognosis in patients with advanced gastric cancer

2.5 COX 回歸分析影響中晚期胃癌患者預后的危險因素以中晚期胃癌患者3 年生存情況為自變量（死亡=1，存活=0），以TNM 分期（Ⅱb 期=0，III～IV 期=1）、淋巴結轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、CENPF（高表達=1，低表達=0）、miR-1-3p（高表達=0，低表達=1）為自變量進行COX 回歸分析。單因素COX分析表明，TNM 分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、CENPF、miR-1-3p 是影響中晚期胃癌患者預后的危險因素（P＜0.05）；多因素COX 回歸分析顯示，TNM 分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、CENPF、miR-1-3p 表達是影響中晚期胃癌患者預后的危險因素（P＜ 0.05）。見表5。

表5 COX 回歸分析影響中晚期胃癌患者預后的危險因素Tab.5 COX regression analysis of risk factors affecting prognosis in patients with advanced gastric cancer

3 討論

胃癌腫瘤起源于胃黏膜上皮，由于飲食改變、工作壓力增加和幽門螺桿菌感染，胃癌的發(fā)病率呈年輕化趨勢［10-11］。臨床上，缺乏特殊癥狀是患者早期診斷的痛點，隨著早期患者的診斷和治療水平提高，其長期生存率有所提高，但中晚期胃癌患者的預后效果仍然不佳［12-13］。因此，尋找與中晚期胃癌患者預后相關的生物學標志物具有重要的意義。

研究表明，CENPF 在乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、食管鱗狀細胞癌、胃腸道間質(zhì)瘤中上調(diào)，其與侵襲性腫瘤表型和低生存率有關［14］。CENPF 表達呈細胞周期依賴性，在細胞周期過程中逐漸積累，然后在G2/M 期達到峰值水平，最終在有絲分裂完成后降解，CENPF 的表達變化已被證明與各種癌癥的預后相關［15］。從功能上講，已知細胞增殖和凋亡受CENPF 影響，CENPF 過表達與轉(zhuǎn)移、TNM 分期和預后不良的相關性已在膀胱癌和乳腺癌中得到證實［16-17］。CENPF 促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，例如，miRNA-COUP-TFII-FOXM1-CENPF 軸的失調(diào)有助于前列腺癌的轉(zhuǎn)移，下調(diào)CENPF 重塑前列腺癌并改變細胞代謝［18］。本次研究表明，與對照組比較，研究組患者CENPF 水平明顯升高，表明CENPF 水平與中晚期胃癌的發(fā)生有關，CENPF 高表達組患者3 年生存率顯著低于低表達組，表明CENPF 水平的上調(diào)能夠影響患者的生存狀況，與預后密切相關。不同TNM 分期和淋巴結轉(zhuǎn)移狀況下CENPF水平比較差異有統(tǒng)計學意義，提示CENPF 水平的變化能夠監(jiān)控臨床病理特征情況。

在非小細胞肺癌中，miR-1-3p 水平較低，其過表達通過靶向Mpl 基因抑制腫瘤生長和血管生成［19］。在分子機制方面，LINC00242 競爭性調(diào)控miR-1-3p，從而抵消了miR-1-3p 介導的對G6PD 的抑制，表明LINC00242 通過miR-1-3p/G6PD 信號傳導調(diào)節(jié)胃癌細胞有氧糖酵解和增殖［20-22］。前列腺癌研究中，miR-1-3p 表現(xiàn)出下調(diào)，其過表達通過靶向兩個關鍵細胞周期基因E3F2 和PFTK5 的3′-UTR 區(qū)在體外和體內(nèi)抑制細胞生長和細胞周期進程［23-24］。本次研究表明，對照組比較，研究組患者miR-1-3p 水平明顯降低，提示在患者血清中miR-1-3p 低表達促進中晚期胃癌的發(fā)生。miR-1-3p 高表達組患者3 年生存率顯著高于低表達組，提示miR-1-3p 水平下調(diào)與預后相關，可以作為評估預后狀況的潛在生物學指標。不同TNM 分期和淋巴結轉(zhuǎn)移狀況下miR-1-3p 水平比較具有顯著差異性，提示miR-1-3p 水平與臨床病理特征相關。

在肝癌患者組織中，miRNA 可以通過靶向CENPF 來抑制腫瘤生長［25］。miR-1-3p 通過CENPF調(diào)節(jié)介導胃癌發(fā)育，低表達的miR-1-3p 與胃癌腫瘤增殖、侵襲和遷移相關［8］。相關性分析結果顯示，中晚期胃癌患者血清中CENPF 和miR-1-3p 水平呈負相關，表明CENPF 和miR-1-3p 均參與中晚期胃癌的發(fā)生，miR-1-3p 可靶向調(diào)節(jié)CENPF 來參與中晚期胃癌的發(fā)生。多因素COX 回歸分析顯示，TNM 分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、CENPF、miR-1-3p 表達是影響中晚期胃癌患者預后的危險因素，進一步提示CENPF、miR-1-3p 水平與預后具有相關性。

綜上所述，中晚期胃癌患者血清中CENPF 水平顯著升高，miR-1-3p 水平顯著降低，二者與預后具有相關性。但本次研究樣本數(shù)量有限，后期將擴大樣本數(shù)量深入探究。