陳爽 楊娜 黃禹?xiàng)?孔祥豐 李錦濤 唐以眾 馬克雄 張陽陽 張?jiān)憾?任承德

青海大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科 （西寧 810000）

腎細(xì)胞癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)癌癥，死亡率超過30%，根據(jù)組織學(xué)和分子亞型，透明細(xì)胞癌在腎細(xì)胞癌中的發(fā)病率最高且預(yù)后生存較差，嚴(yán)重威脅患者的生命安全［1-2］。近些年，隨著細(xì)胞減滅性腎切除術(shù)及各類生物靶向制劑的快速發(fā)展，腎透明細(xì)胞癌的治療選擇范圍越來越廣，抗腫瘤效果不斷提升，但現(xiàn)階段死亡率仍居較高水平，因此篩查腎透明細(xì)胞癌病理相關(guān)生物學(xué)因子并及時(shí)評(píng)估病理進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系，更有利于進(jìn)一步完善腎透明細(xì)胞癌的臨床診療方案，進(jìn)而改善患者預(yù)后［3-4］。微小RNA（mircoRNA，miR）是廣泛存在于病毒、人類等各類生物中的非編碼調(diào)控基因，可與對(duì)應(yīng)靶細(xì)胞的mRNA 結(jié)合并阻斷蛋白編碼基因合成，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等生物學(xué)過程［5-6］。miR-21、miR-27b 均是癌癥相關(guān)基因，目前miR-21 在結(jié)腸癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中的病理機(jī)制已被證實(shí)［7-9］；楊旺盛等［10］、宋殿芳等［11］在研究后分別報(bào)道了miR-27b 基因在肺癌、宮頸癌中的抑癌作用；趙碩等［12］研究發(fā)現(xiàn)miR-27b 在腎癌患者的血清中表達(dá)量更高。然而miR-21 和miR-27b 基因表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌病理進(jìn)展、預(yù)后的相關(guān)性尚待證實(shí)。本研究篩選我院收治的118 例腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行前瞻性研究，初步淺析miR-21和miR-27b基因表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)性，為后續(xù)臨床實(shí)踐制定個(gè)體化治療策略、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)及評(píng)估預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料篩選2019 年2 月至2021 年4 月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的118 例腎透明細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象，其中女48 例，男70 例；年齡35 ～67 歲，平均（49.15 ± 4.02）歲；Fuhrman 分級(jí)：Ⅰ級(jí)36 例、Ⅱ級(jí)41 例、Ⅲ級(jí)41 例；病理分期Ⅰ期18 例、Ⅱ期30 例、Ⅲ期58 例、Ⅳ期12 例；腫瘤最大徑2.51 ～ 11.04 cm，平均（5.03 ± 1.16）cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60 例，未轉(zhuǎn)移58 例；其中病理分期Ⅰ期、Ⅱ期48 例患者均行細(xì)胞減滅性腎切除術(shù)切除腫瘤病灶。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《腎細(xì)胞癌指南》［13］中腎透明細(xì)胞癌的臨床診斷，經(jīng)手術(shù)或病理穿刺活檢確診；（2）年齡＞ 18 歲；（3）Fuhrman 分級(jí)Ⅰ-Ⅲ級(jí)；（4）病理分期Ⅰ-Ⅳ期；（5）Karnofsky 功能評(píng)分＞ 60 分；（6）患者簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他腫瘤；（2）非原發(fā)病灶；（3）合并全身嚴(yán)重感染或多器官衰竭；（4）免疫功能缺陷；（5）腎結(jié)石；（6）妊娠、哺乳期女性；（7）精神病。另選取院內(nèi)同期健康體檢患者118 例作為對(duì)照組，女50 例，男68 例；年齡39 ～ 65 歲，平均（49.03 ± 3.97）歲，年齡、性別與腎透明細(xì)胞癌組患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。該研究通過院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核。

1.2 血清miR-21 及miR-27b 檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法［14］檢測(cè)所有受試者血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)：患者入組24 h內(nèi)（術(shù)前），采集受試者肘靜脈血2 ～ 4 mL，加入離心機(jī)3 000 r/min 高速離心12 min 后（離心半徑R = 13.5 cm），吸取上清液，待檢。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）提取總RNA，使用Hifair?V Reverse Transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）逆轉(zhuǎn)錄后行PCR 擴(kuò)增。PCR 儀選用寰熙醫(yī)療器械有限公司ViiA 7 Dx 定量熒光PCR擴(kuò)增儀。以CT 值為基礎(chǔ)，2-△△CT法計(jì)算miR-21 及miR-27b 表達(dá)水平。miR-21 及miR-27b 以U6（正向引物：5′-CTAGCTAGATGACCTCTGCTGAC-3′， 反向引物：5′-TCAGCTATCACTGTGTATGCTCA-3′）作為內(nèi)參對(duì)照，miR-21 正向引物序列：5′-CACATCACACCGTATGCAGTGAG-3′，反向引物：5′-CACTATGTCTCGTCACGTCGATC-3′；miR-27b 正向引物序列：5′-TGCATCGATTCCGATGATGCCAG-3′，反向引物：5′-GTCACTTACTGATGCTATCCGTA-3′。

1.3 評(píng)估指標(biāo)（1）血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細(xì)胞癌患者及健康對(duì)照中的表達(dá)；（2）不同病理分期、Fuhrman 分級(jí)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)及相關(guān)性；（3）血清miR-21及miR-27b 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存預(yù)后分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 軟件v.19 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以（±s）表示正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)行兩兩比較，采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)性分析法分析血清miR-21及miR-27b 表達(dá)水平與病理分期、Fuhrman 分級(jí)的相關(guān)性。Kaplan-Meier 分析與對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)用于生存分析，行Log-rank χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細(xì)胞癌患者及健康對(duì)照中的表達(dá)腎透明細(xì)胞癌組患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)量均高于健康對(duì)照組（P＜ 0.05）。見表1。

表1 血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細(xì)胞癌患者及健康對(duì)照中的表達(dá)分析Tab.1 Expression analysis of serum miR-21 and miR-27b in renal clear cell carcinoma patients and healthy controls x ±s

2.2 不同病理分期腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)及相關(guān)性

2.2.1 不同病理分期腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)Ⅲ期患者的血清miR-21表達(dá)量高于Ⅰ期（P＜ 0.05），Ⅳ期患者的血清miR-21 表達(dá)量高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期（P＜ 0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的血清miR-27b 表達(dá)量逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同病理分期腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

表2 不同病理分期腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

注：與Ⅰ期比較，aP ＜ 0.05；與Ⅱ期比較，bP ＜ 0.05；與Ⅲ期比較，cP ＜ 0.05

血清miR-27b相對(duì)表達(dá)量2.31 ± 0.36 2.89 ± 0.39a 3.11 ± 0.41ab 5.32 ± 0.59abc 135.345 0.001病理分期Ⅰ期（n = 18）Ⅱ期（n = 30）Ⅲ期（n = 58）Ⅳ期（n = 12）F值P值血清miR-21相對(duì)表達(dá)量7.09 ± 1.31 7.81 ± 1.69 8.49 ± 1.46a 12.06 ± 2.91abc 23.502 0.001

2.2.2 病理分期與血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)的相關(guān)性病理分期與血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)均呈正相關(guān)（r= 0.546、0.684，P＜ 0.001）。

2.3 不同F(xiàn)uhrman 分級(jí)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)及相關(guān)性

2.3.1 不同F(xiàn)uhrman 分級(jí)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)Fuhrman 分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)患者的血清miR-21、miR-27b 表達(dá)量逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 不同F(xiàn)uhrman 分級(jí)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達(dá)分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

表3 不同F(xiàn)uhrman 分級(jí)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達(dá)分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

注：與Ⅰ級(jí)比較，aP ＜ 0.05；與Ⅱ級(jí)比較，bP ＜ 0.05

Fuhrman分級(jí)Ⅰ級(jí)（n = 36）Ⅱ級(jí)（n = 41）Ⅲ級(jí)（n = 41）F值P值血清miR-27b相對(duì)表達(dá)量2.64 ± 0.38 2.97 ± 0.37a 3.81 ± 0.46ab 81.198 0.001血清miR-21相對(duì)表達(dá)量7.31 ± 1.38 7.74 ± 1.50a 10.39 ± 2.51ab 31.098 0.001

2.3.2 Fuhrman 分級(jí)與血清miR-21 及miR-27b表達(dá)的相關(guān)性Fuhrman 分級(jí)與血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)均呈正相關(guān)（r= 0.550、0.769，P＜0.001）。

2.4 血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存預(yù)后分析根據(jù)患者的血清miR-21 及miR-27b 中位表達(dá)分為miR-21 高表達(dá)組（n= 59）和低表達(dá)組（n= 59），miR-27b 高表達(dá)組（n= 59）和低表達(dá)組（n= 59）。隨訪結(jié)束均未失訪，隨訪時(shí)間6 ～ 24 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為18 個(gè)月，miR-21 高表達(dá)組死亡13 例，低表達(dá)組死亡4 例，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank χ2= 5.926，P= 0.015）；miR-27b 高表達(dá)組死亡12 例，低表達(dá)組死亡5 例，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank χ2= 3.695，P= 0.045）。見圖1-2。

圖1 血清miR-21 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存預(yù)后分析Fig.1 Analysis of serum miR-21 expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

圖2 血清miR-27b 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存預(yù)后分析Fig.2 Analysis of serum miR-27b expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

3 討論

腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最普遍和最具侵襲性的亞型，約占所有腎細(xì)胞癌的70%，臨床上大約1/3 的腎透明細(xì)胞癌患者在初次診斷時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而四分之一的局部疾病患者在根治性手術(shù)切除后會(huì)同樣出現(xiàn)復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移后腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生總是與高死亡率密切相關(guān)［15-17］。此外盡管抗血管生成治療和免疫療法顯著改善了腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后，但許多患者不可避免地會(huì)產(chǎn)生耐藥性，因而導(dǎo)致治療失敗，生存預(yù)后較差［18］。因此，鑒于腎透明細(xì)胞癌的高發(fā)病率和死亡率，篩選高敏性生物學(xué)指標(biāo)評(píng)估患者病理預(yù)后，進(jìn)而嘗試調(diào)整臨床治療干預(yù)方案，成為近些年腎透明細(xì)胞癌研究中的重要方向之一。

miR 作為內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA 分子，具有阻斷蛋白編碼基因、調(diào)節(jié)缺氧和血管生成的功能，與腫瘤細(xì)胞增殖及血管新生關(guān)聯(lián)密切［19］，且近幾年國(guó)內(nèi)研究中針對(duì)各類miR 及其上下游特定基因在消化道腫瘤、呼吸道腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤等領(lǐng)域的研究逐漸增多，針對(duì)miR 的水平檢測(cè)已然相對(duì)成熟。筆者以此為切入點(diǎn)，選取現(xiàn)階段研究中已證實(shí)在多種實(shí)體瘤中表達(dá)異常的癌癥因子miR-21 及miR-27b，分析并嘗試建立其與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)性，為臨床實(shí)踐中腎透明細(xì)胞癌的診療及預(yù)后評(píng)估提供指導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，腎透明細(xì)胞癌組患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，提示血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細(xì)胞癌中出現(xiàn)高表達(dá)，可能在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)揮促癌作用。WOLF 等［20］在針對(duì)腎透明細(xì)胞癌的建模及治療的研究中提出，腎透明細(xì)胞癌的特征是控制缺氧信號(hào)通路發(fā)生基因突變，導(dǎo)致代謝失調(diào)、血管生成增強(qiáng)、瘤內(nèi)異質(zhì)性和有害的腫瘤微環(huán)境串?dāng)_，特定基因表達(dá)的抑制或激活可能有助于攻克長(zhǎng)期治療失敗的障礙，進(jìn)而提高腎透明細(xì)胞癌患者的生存率。YAO 等［21］研究表明miR-27b 可通過抑制PPARγ 基因通路，加重缺氧誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能障礙。此外，SITU 等［22］在一項(xiàng)關(guān)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與腎細(xì)胞癌的表達(dá)、預(yù)后、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控靶點(diǎn)的研究中提出，腎細(xì)胞癌中相關(guān)靶標(biāo)miR-21 的表達(dá)與腫瘤血管生成增強(qiáng)有關(guān)，且與CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。因此，本研究分析，腎透明細(xì)胞癌患者的病理進(jìn)展與miR-21 及miR-27b 表達(dá)量升高有關(guān)，與miR-27b 介導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺軸信號(hào)通路與miR-21 調(diào)節(jié)的腫瘤血管生成有關(guān)。

本研究預(yù)后生存分析得出，不同血清miR-21及miR-27b 水平的腎透明細(xì)胞癌患者的生存預(yù)后差異顯著，可以看出血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)量越高則總生存預(yù)后期越短，研究分析可能與血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的增殖、遷移有關(guān)。MEN 等［23］在對(duì)磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機(jī)焦磷酸磷酸酶基因靶向共表達(dá)microRNA 在RCC 機(jī)制中的探究中發(fā)現(xiàn)，miR-21 可促進(jìn)腎細(xì)胞癌增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲，且可能是腎透明細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物。PUE 等［24］在分析舒尼替尼治療腎透明細(xì)胞患者的治療反應(yīng)性及生存預(yù)后的報(bào)告中顯示，miR-27b 表達(dá)在長(zhǎng)期緩解者與原發(fā)性難治性患者中差異顯著。因此通過對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 的研究，有助于進(jìn)一步指導(dǎo)后續(xù)microRNA 的臨床抗腫瘤治療及評(píng)估預(yù)后。病理分期和Fuhrman 分級(jí)分別作為評(píng)估腎透明細(xì)胞癌病理進(jìn)展及預(yù)后的客觀指標(biāo)，對(duì)提示患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要的參考價(jià)值。本研究進(jìn)一步對(duì)不同病理分期及Fuhrman 分級(jí)的腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病理分期及Fuhrman 分級(jí)的升高，患者的血清miR-21 及miR-27b 水平整體上呈升高趨勢(shì)，且表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，研究分析腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達(dá)可提示患者的病情進(jìn)展及預(yù)后生存狀況，但具體病理機(jī)制仍需后續(xù)研究中不斷完善證實(shí)。

綜上所述，腎透明細(xì)胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達(dá)水平可反映患者的病情進(jìn)展及預(yù)后生存情況。但本研究為單中心樣本對(duì)照研究，納入樣本量有限，且對(duì)miR-21、miR-27b 與腎透明細(xì)胞癌病理進(jìn)展的機(jī)制分析尚待深入，且后續(xù)研究中仍需完善多中心、大樣本隨機(jī)對(duì)照組研究，進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。