肖湘芝 陳管雄 胡智文

長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院）急診科（長(zhǎng)沙 410000）

出血性轉(zhuǎn)化（hemorrhagic transformation，HT）是急性缺血性卒中（ischemic stroke， IS）最具破壞性的并發(fā)癥之一，其特征是腦血管破裂和實(shí)質(zhì)內(nèi)出血［1］。IS 后24 h 內(nèi)HT 的發(fā)生率為15.20%，在整個(gè)IS 期間達(dá)到30.15%，導(dǎo)致預(yù)后不良［2］。然而，臨床上尚無(wú)治療HT 的有效藥物。研究［3］發(fā)現(xiàn)，高血糖是IS 患者的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素，大約40%的IS 患者患有糖尿病和高血糖。腦卒中發(fā)病后24 h 內(nèi)血糖高于7 mmol 與腦損傷加重和病死率增加相關(guān)，嚴(yán)重影響腦卒中的臨床治療［4］。因此，研究高血糖引起HT 的機(jī)制，尋找新的靶點(diǎn)和治療藥物，對(duì)于改善腦卒中的治療和預(yù)后具有重要意義。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶的主要生物活性成分，目前已證實(shí)其對(duì)大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮潛在的治療作用，如阿爾茨海默病、朊病毒病、外傷性腦損傷和腦缺血［5-6］。研究［7-8］證實(shí)，EGCG 是一種多靶點(diǎn)藥物，因?yàn)樗c細(xì)胞內(nèi)區(qū)室（如線粒體、溶酶體和細(xì)胞核）相互作用以介導(dǎo)多種生物作用。然而，EGCG 對(duì)高血糖誘導(dǎo)HT 的保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究采用急性高血糖聯(lián)合電凝腦缺血模型評(píng)價(jià)EGCG 對(duì)HT 的保護(hù)作用。同時(shí)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)與HT 發(fā)生相關(guān)的潛在靶點(diǎn)和通路，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGCG 在高血糖誘導(dǎo)HT 中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物體質(zhì)量240 ～ 260 g 的雄性SD 大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào) SCXK（京）2018-0006］。研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（編號(hào)：E2020081.1）。

1.2 試劑和儀器EGCG（純度≥ 95%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；QuantiChrom Hemoglobin Assay Kit 購(gòu)自美國(guó)BioAssay Systems 公司；Nrf2、Keap1、TLR4一抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；NF-κB p65、phosphorylated-NF-κB p65、β-actin 一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；Alexa 594 偶聯(lián)的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；HRP 偶聯(lián)的兔或小鼠IgG 二抗購(gòu)自北京CWBIO 公司。YLS-14B 血栓形成測(cè)試儀購(gòu)自濟(jì)南一研科技發(fā)展有限公司；FreeStyle Optium Neo 血糖儀購(gòu)自美國(guó)Abbott Diabetes Care 公司；分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices 公司；Nikon Eclipse Ti-SR 購(gòu)自日本Nikon 公司；Tanon 5200 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光加檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上海Tanon 公司。

1.3 方法

1.3.1 制備高血糖誘導(dǎo)的HT 模型大鼠在手術(shù)前30 min 腹腔注射50%葡萄糖（6 mL/kg），并用10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉。參照文獻(xiàn)［9］方法建立電凝誘導(dǎo)的血栓性局灶性缺血大鼠模型。將大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）鈍性分離。將YLS-14B 血栓形成測(cè)試儀的電鉗放入頸總動(dòng)脈中并刺激（1.00 mA）4 min。血栓被壓碎并沖入ICA。再將CCA 夾住15 min，然后將動(dòng)物放回籠子。

1.3.2 動(dòng)物分組將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，n= 20）、模型組（n= 27）、高血糖模型組（HG，n= 43）、EGCG 組（n= 43）。在Sham 組中，僅分離出CCA。在模型組中，大鼠接受手術(shù)但未接受50%葡萄糖注射。在HG組和EGCG組中，大鼠接受手術(shù)并接受50%的葡萄糖。此外，EGCG 組在IS 前灌胃給藥5 d。在腦缺血模型中研究了各種劑量的EGCG，我們根據(jù)之前的研究［10］選擇50 mg/（kg·d）的劑量。本研究共使用143 只大鼠，排除10 只非卒中大鼠。

1.3.3 血糖檢查在注射50%葡萄糖前和術(shù)后0、1、2、3 h 通過(guò)尾靜脈穿刺采血。使用FreeStyle Optium Neo 血糖儀進(jìn)行測(cè)量血糖。

1.3.4 神經(jīng)功能評(píng)估缺血24 h 后，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)試。根據(jù)Longa 的五點(diǎn)量表，選擇評(píng)分為1 ～ 3 的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分（mNSS）方法包括運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（6 分）、感覺(jué)功能評(píng)分（2 分）、平衡木評(píng)分（6 分）和反射功能（4 分）。得分越高表明損傷的嚴(yán)重程度越高。得分≥ 8 分的大鼠用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 梗死體積檢查缺血24 h后，將大鼠麻醉并處死。大腦被迅速取出并在-80 ℃下冷凍15 min。將大腦切成2 mm 冠狀切片，并在1% TTC 溶液中保存15 min。然后，用4%多聚甲醛固定腦切片并拍照。通過(guò)Image J 軟件檢查梗死體積、對(duì)側(cè)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的體積和同側(cè)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的體積。以下公式用于校正水腫和萎縮的梗死體積：梗死體積百分比 =［總梗死體積-（同側(cè)半球體積-對(duì)側(cè)半球體積）］/對(duì)側(cè)半球體積× 100%［11］。

1.3.6 HT 發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計(jì)每組所用大鼠數(shù)、死亡數(shù)、有無(wú)出血大鼠數(shù)。HT發(fā)生率（%）=出血大鼠數(shù)/（出血大鼠數(shù)+無(wú)出血大鼠數(shù)）×100%。死亡率（%） = （死亡的大鼠數(shù)/使用的大鼠數(shù)） × 100%。

1.3.7 出血評(píng)分和血紅蛋白含量測(cè)量灌注后迅速取出大腦，冠狀切開(kāi)6 片進(jìn)行評(píng)分。出血的嚴(yán)重程度分為4 個(gè)等級(jí)：1 - 4 分：小點(diǎn)狀出血性梗塞（HI1，1 分）、融合性點(diǎn)狀出血性梗塞（HI2，2 分）、小實(shí)質(zhì)出血（PH1，＜ 梗塞區(qū)的30%，輕度占位效應(yīng)，3 分）和大量實(shí)質(zhì)出血（PH2，≥ 30%梗死區(qū)，顯著的占位效應(yīng)，4 分）［12］。評(píng)分后，快速稱重同側(cè)半球，用0.1 mol/L PBS（1∶1）進(jìn)行分離和勻漿。以13 000 ×g離心30 min 后，收集上清液。將50 μL上清液吸收到96 孔板中，加入200 μL 試劑（QuantiChrom Hemoglobin Assay Kit）并避光。在室溫下反應(yīng)15 min 后，用分光光度計(jì)在400 nm 處測(cè)量OD值。

1.3.8 蘇木精-伊紅（HE）染色用多聚甲醛固定大腦，然后脫水，石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片。將大鼠切片脫蠟、再水化并用HE 染色以進(jìn)行整體形態(tài)學(xué)評(píng)估。

1.3.9 免疫熒光測(cè)定將4%多聚甲醛固定的大腦切成25 μm 切片用于雙重免疫染色分析。將切片與大鼠抗 Nrf2（1∶100）或Keap1（1∶100）一起孵育，然后與Alexa 594 偶聯(lián)的二抗（1∶500）一起孵育。將蓋玻片固定在載玻片上并用4'，6-didiayl-2-phenylindole 染色。在熒光顯微鏡下測(cè)量切片。使用Nikon Eclipse Ti-SR 獲得熒光圖像，并通過(guò)Image J 軟件進(jìn)行分析。測(cè)量積分光密度和免疫反應(yīng)點(diǎn)的面積。

1.3.10 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析EGCG 的潛在靶點(diǎn)收集于瑞士靶點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站。與“缺血性卒中”、“高血糖”、“腦出血”、“出血性轉(zhuǎn)化”和“高血糖缺血性卒中”相關(guān)的靶點(diǎn)通過(guò)搜索OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。將化合物與疾病的相互作用靶基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析，選擇度數(shù)、介數(shù)中心性和接近中心性大于各自中位數(shù)的基因作為核心靶基因。STRING（https：//string-db.org/）網(wǎng)站用于執(zhí)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.3.11 蛋白質(zhì)印跡腦組織在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解和勻漿。然后將勻漿在冰上裂解20 min 并在4 ℃下以13 000 ×g離心15 min。蛋白質(zhì)濃度采用BCA 法測(cè)定。通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。在TBST 中用5% BSA 封閉1 h 后，將膜與Nrf2（1∶1 000）、Keap1（1∶1 000）、TLR4（1∶800）、NF-κB p65（p65，1∶1 000）、phosphorylated-NF-κB p65（pp65，1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。在室溫下加入針對(duì)HRP 偶聯(lián)的兔或小鼠IgG 二抗（稀釋度1∶5 000）2 h。使用Tanon 5200增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光加檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，并使用Image J 軟件分析條帶的光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用未配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析和Bonferroni 多重比較事后檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)以上組的統(tǒng)計(jì)分析。使用帶有Tukey 事后檢驗(yàn)的重復(fù)測(cè)量雙向ANOVA 分析血糖數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)分析出血發(fā)生率和死亡率。使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和事后Dunnett 多重比較檢驗(yàn)分析神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分。P＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射50%葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)的血糖水平如表1 所示，模型組卒中后3 h 內(nèi)血糖水平逐漸升高。注射50%葡萄糖的大鼠在注射后30 min 血糖水平最高，并維持3 h。然而，EGCG 不影響血糖升高。

表1 注射50%葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)的血糖水平Tab. 1 Blood sugar levels at different time points after 50% glucose injection ±s，mmol/dL

表1 注射50%葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)的血糖水平Tab. 1 Blood sugar levels at different time points after 50% glucose injection ±s，mmol/dL

注：與模型組相比，***P ＜ 0.001

時(shí)間0 h 30 min 1.5 h 2.5 h 3.5 h F值P值Sham組3.75 ± 0.20 4.55 ± 0.25 4.41 ± 0.28 5.02 ± 0.27 4.19 ± 0.30模型組4.04 ± 0.22 5.65 ± 0.73 6.74 ± 0.51 8.28 ± 0.79 9.29 ± 0.64 HG組4.63 ± 0.18 16.24 ± 1.95***16.37 ± 1.24***11.32 ± 0.62 7.70 ± 0.81 EGCG組4.78 ± 0.15 15.75 ± 2.14***14.32 ± 1.57***11.13 ± 0.58 8.72 ± 1.24 35.62＜ 0.001

2.2 EGCG 改善神經(jīng)功能并減少急性高血糖引起的梗死體積與模型組相比，HG 組大鼠死亡率顯著升高（P＜ 0.05）。EGCG 組大鼠死亡率較HG組顯著降低（P＜ 0.05）。其次，HG 組的Longa 評(píng)分明顯高于模型組（P＜ 0.05），EGCG 預(yù)處理顯著改善了神經(jīng)功能。通過(guò)TTC 染色測(cè)量梗死體積。如圖1 和表2 所示，NG 組有明顯的腦梗死，高血糖進(jìn)一步增加了梗死體積。與HG 組相比，EGCG 預(yù)處理顯著降低了梗死體積（P＜ 0.05）。

圖1 通過(guò)TTC 染色測(cè)量梗死體積（n = 6）Fig.1 Infarct volume was measured by TTC staining（n = 6）

表2 EGCG 對(duì)急性高血糖卒中大鼠神經(jīng)功能和梗死體積的影響Tab.2 Effects of EGCG on neurological function and infarct volume in rats with acute hyperglycemia ±s

表2 EGCG 對(duì)急性高血糖卒中大鼠神經(jīng)功能和梗死體積的影響Tab.2 Effects of EGCG on neurological function and infarct volume in rats with acute hyperglycemia ±s

注：與Sham組相比，***P ＜ 0.001；與模型組相比，&P ＜ 0.05；與HG組相比，#P ＜ 0.05、##P ＜ 0.01

組別Sham組模型組HG組EGCG組F/χ2值P值梗死體積（%）0 38.06 ± 3.17***42.14± 4.37***28.50 ±3.73#34.26＜ 0.001 n 20 27 43 43死亡［n（%）］0（0）6（21.2）***22（51.2）***&13（30.20）#7.11 0.029 mNSS評(píng)分（分）0 10.02 ± 0.38***11.27 ± 0.45***9.63 ± 0.29##28.62＜ 0.001 Longa評(píng)分（分）0 2.33 ± 0.42***3.57± 0.20***&1.93 ± 0.33#31.53＜ 0.001

2.3 EGCG 減輕急性高血糖引起的HTHG 組的HT發(fā)生率高于模型組（59.3%vs. 90.7%）。EGCG顯著降低高血糖誘導(dǎo)的HT 發(fā)病率至69.8%（表3）。出血評(píng)分結(jié)果顯示，模型組有輕微出血，HG 組出血評(píng)分明顯升高。與HG 組相比，EGCG 組顯著降低了出血評(píng)分（圖2A 和表3）。HG 組的血紅蛋白含量明顯高于模型組。與HG 組相比，EGCG 使血紅蛋白含量分別從（53.42 ± 5.11） mg/dL 降低到（37.04 ± 2.39） mg/dL（表3）。HE 染色顯示了急性高血糖導(dǎo)致腦出血增加，EGCG 可緩解（圖2B）。

圖2 EGCG 對(duì)高血糖引起的腦出血的影響Fig.2 Effect of EGCG on cerebral hemorrhage caused by hyperglycemia

表3 EGCG 對(duì)急性高血糖卒中大鼠HT 的影響Tab. 3 Effect of EGCG on HT in Rats with Acute Hyperglycemia Stroke ±s

表3 EGCG 對(duì)急性高血糖卒中大鼠HT 的影響Tab. 3 Effect of EGCG on HT in Rats with Acute Hyperglycemia Stroke ±s

注：與Sham組相比，***P ＜ 0.001；與模型組相比，&P ＜ 0.05；與HG組相比，#P ＜ 0.05

組別Sham組模型組HG組EGCG組F/χ2值P值血紅蛋白含量 （mg/dL）36.02 ± 1.86 38.72 ± 4.37 53.42 ± 5.11**&37.04 ± 2.39#21.03＜ 0.001 n 20 27 43 43 HT發(fā)病［n（%）］0 16（59.3）***39（90.7）***&30（69.8）#9.90 0.007腦出血評(píng)分0 1.12 ± 0.34***3.76 ± 0.25***&&&2.32 ± 0.29#38.52＜ 0.001

2.4 EGCG 可通過(guò)Nrf2-Keap1 通路預(yù)防急性高血糖誘導(dǎo)的HT采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析EGCG 在HT 中的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果表明，EGCG 與高血糖卒中之間有366 個(gè)交叉目標(biāo)，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析產(chǎn)生了139 個(gè)EGCG 的核心靶基因，這些基因作用于高血糖誘導(dǎo)的HT（圖3A）。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，Nrf2-Keap1 通路富集35 個(gè)核心靶基因，HIF-1通路富集26 個(gè)基因，PI3K-Akt 通路富集35 個(gè)核心靶基因，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性途徑中富集23 個(gè)基因（圖3B）。

圖3 EGCG 治療高血糖誘導(dǎo)的HT 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)Fig.3 Network pharmacological prediction of EGCG in the treatment of hyperglycemia-induced HT

2.5 EGCG 促進(jìn)急性高血糖后Nrf2-Keap1 通路的激活缺血后Nrf2 和Keap1 的表達(dá)水平明顯降低，HG 進(jìn)一步降低。與HG 組相比，EGCG 組Nrf2和Keap1 的表達(dá)水平顯著增加（P＜ 0.05）（圖4A）。同樣，HG 組Nrf2 和Keap1 的表達(dá)顯著降低和TLR4的表達(dá)、NF-κB 的磷酸化顯著增加，但EGCG 逆轉(zhuǎn)了這一過(guò)程（圖4B）。

圖4 EGCG 對(duì)急性高血糖后Nrf2-Keap1 信號(hào)通路激活的影響Fig.4 Effect of EGCG on activation of Nrf2-Keap1 signal pathway after acute hyperglycemia

3 討論

作為腦卒中的嚴(yán)重并發(fā)癥，高血糖誘發(fā)的HT越來(lái)越受到關(guān)注。由于病理機(jī)制復(fù)雜，臨床上仍缺乏治療藥物。有必要尋找新的治療藥物改善腦卒中的預(yù)后。本研究結(jié)果表明，EGCG 預(yù)處理顯著改善了IS 后急性高血糖引起的神經(jīng)功能缺損和腦出血。它的影響可能與激活Nrf2-Keap1 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

在這項(xiàng)研究中，我們使用了電凝誘導(dǎo)的血栓性卒中大鼠模型。CCA 中形成的血栓引起的MCA閉塞與人類血栓栓塞性卒中相似，適用于評(píng)估溶栓藥物［13］。與傳統(tǒng)的栓塞卒中模型相比，該模型還開(kāi)發(fā)了可重復(fù)和可預(yù)測(cè)的梗死體積。基于該模型，通過(guò)誘導(dǎo)缺血性卒中后急性高血糖來(lái)評(píng)估EGCG 對(duì)HT 的影響。先前的一項(xiàng)研究［14］報(bào)道，MCAO 后急性高血糖大鼠的HT 發(fā)生率高于95%。本研究中HT 發(fā)生率為90.7%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

EGCG 作為綠茶的主要活性成分。近期研究［15-16］發(fā)現(xiàn)，EGCG 通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能和脂質(zhì)代謝以及減少線粒體自噬和細(xì)胞凋亡來(lái)改善腦缺血，但EGCG 對(duì)HT 的影響尚不清楚。本研究結(jié)果表明，EGCG 改善了神經(jīng)功能缺損和梗死體積，這與之前的研究［16］一致。值得注意的是，我們觀察到EGCG 可以減輕高血糖誘導(dǎo)的HT 并降低HT的發(fā)病率和死亡率。先前的研究表明，高血糖通過(guò)IS 后的多種病理機(jī)制促進(jìn)HT，例如促進(jìn)能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥［17］。此外，高血糖會(huì)刺激HIF-1α 和VEGF 過(guò)表達(dá)以及PAI-1 的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管功能異常，并通過(guò)刺激AIF-Caspase-3 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。這些病理機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)的破壞。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)EGCG 預(yù)防HT 的靶點(diǎn)和途徑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究側(cè)重于成分、靶點(diǎn)和疾病之間的相互關(guān)系，有助于闡明天然產(chǎn)物的作用機(jī)制和靶點(diǎn)［19］。結(jié)果表明，EGCG 的作用靶點(diǎn)復(fù)雜，與高血糖誘導(dǎo)的HT 信號(hào)通路相關(guān)，如Nrf2-Keap1 通路、HIF-1 通路、PI3K-Akt 通路和EGFR 通路。因此，這些通路可能是EGCG 減輕高血糖誘導(dǎo)的HT 的潛在途徑。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的這些信號(hào)通路中，一些研究［20］表明Nrf2-Keap1 抑制了高血糖誘導(dǎo)的炎癥損傷，被認(rèn)為是減輕糖尿病血管疾病和血管功能障礙的保護(hù)因素。Nrf2 是生物防御系統(tǒng)抵高血糖刺激的關(guān)鍵介質(zhì)，增加Nrf2 活性可能會(huì)抵消華法林的促出血作用［21］。在靜止條件下，Nrf2 與Keap1結(jié)合，通過(guò)泛素化促進(jìn)Nrf2 的快速蛋白酶體降解。然而，在急性高血糖應(yīng)激期間，Nrf2 從Keap1 解離并促進(jìn)Toll 樣受體2 和4（TLR2，TLR4）的表達(dá)以及NF-κB 的核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥［22］。此外，高血糖會(huì)抑制Nrf2-Keap1 的產(chǎn)生和促進(jìn)TLR4 的表達(dá)，從而激活NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥［23］。因此，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，我們進(jìn)一步研究了Nrf2-Keap1 通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在高血糖誘導(dǎo)的HT 中的作用，結(jié)果證實(shí)了TLR4 和p-p65 的表達(dá)因高血糖而顯著上調(diào)，而在EGCG 給藥后受到抑制，表明EGCG 逆轉(zhuǎn)了高血糖對(duì)Nrf2-Keap1 信號(hào)通路的抑制作用。

總之，急性高血糖通過(guò)抑制Nrf2-Keap1 信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)缺血性卒中后HT 的發(fā)生。EGCG 預(yù)處理防止了HT 的發(fā)生，這可能與激活Nrf2-Keap1 信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。但結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，EGCG 對(duì)高血糖增強(qiáng)HT 的保護(hù)作用可能還與血管功能和氧化應(yīng)激有關(guān)，本研究并未對(duì)此進(jìn)行分析。因此，EGCG 在HT 中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。