李晨羽,賈蕓菁,甘玨方,廉春容,李莎莎,凌雁武

(右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000)

鋁已經(jīng)成為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療和日常生活等多個(gè)領(lǐng)域中極其重要且廣泛使用材料[1],但環(huán)境中的鋁正日益明顯地影響著人類的健康。以往研究[2]指出,鋁能夠穿過血腦屏障進(jìn)入大腦,并在多個(gè)神經(jīng)元區(qū)域(如內(nèi)嗅皮層、海馬和下丘腦)中積聚。有研究[3]顯示,鋁與阿爾茨海默病(AD)密切相關(guān),認(rèn)知障礙患者腦中的鋁含量明顯高于正常對照組,表明鋁是認(rèn)知障礙的重要危險(xiǎn)因子之一。CACNA1E基因編碼鈣離子通道蛋白的α1E亞基,具有重要的生物學(xué)功能,能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的運(yùn)輸,影響細(xì)胞的生長和生理功能[4]。鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CALM)是CACNA1E的下游蛋白[5],與AD、癲癇、帕金森病和抑郁癥等疾病有關(guān)[6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種重要的神經(jīng)生長因子,AD患者海馬區(qū)域的BDNF表達(dá)顯著降低[7]。

本課題組的前期研究[8]通過第二代高通量測序技術(shù)對高鋁認(rèn)知障礙人群的血清樣本進(jìn)行了分析,篩選出CACNA1E下調(diào)血清外泌體表達(dá)與高鋁認(rèn)知障礙之間的關(guān)聯(lián)。本研究將利用鋁致認(rèn)知障礙大鼠模型驗(yàn)證這一關(guān)聯(lián),并探究究CACNA1E、CALM和BDNF在鋁致認(rèn)知障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[SCXK(湘)2022-0014]提供,總數(shù)為48只,每只體重約為(200±20)g,飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。對實(shí)驗(yàn)動物的操作處理符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和動物3R原則,本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

三氯化鋁(AlCl3)購自廣東光華化學(xué)廠有限公司;CACNA1E、CALM、BDNF抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司;PCR引物委托上海生工生物股份工程有限公司合成;Morris水迷宮分析系統(tǒng)購自成都泰盟公司;ECLIPSEE100正置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組與給藥方法

將大鼠隨機(jī)劃分成對照組和低、中、高劑量組各12只,建立慢性鋁中毒模型。用配置好的AlCl3溶液對低、中、高劑量組進(jìn)行灌胃,劑量分別為25、50、100 mg·kg-1,同時(shí)予以對照組等體積的生理鹽水灌胃。4組均每天給藥1次,連續(xù)90 d。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

造模完成后進(jìn)行為期5 d的水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。自第1天起,將大鼠放進(jìn)水迷宮池,在相同的時(shí)間范圍內(nèi),觀察和記錄其逃避潛伏期(從入水到找到安全平臺所需的時(shí)間),如果大鼠1 min內(nèi)未找到平臺,則記錄潛伏期為60 s。連續(xù)測試4 d,以評估各組大鼠的學(xué)習(xí)能力。

第5天,拆除水池中的安全平臺,觀察和記錄大鼠在原平臺所在象限停留的時(shí)長和穿過原平臺位置的次數(shù),以此評估其記憶能力。

1.3.3 蘇木素伊紅和尼氏染色

麻醉大鼠后,將其斷頭處死,完整取出腦組織,用4%的多聚甲醛溶液處理。制成5 μm的石蠟切片,烘干,二甲苯脫蠟,最終用酒精進(jìn)行脫水。蘇木素伊紅染色切片經(jīng)過蘇木素、氨水和伊紅的處理,用蒸餾水沖洗;尼氏染色切片加1%甲苯胺藍(lán)溶液后,置于溫箱內(nèi),浸染30 min,沖洗后用無水乙醇浸泡5 min;全部切片迅速脫水后封片,干燥后置于顯微鏡下觀察。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR

從腦組織中分離出海馬,使用眼科剪刀將海馬組織剪碎,并使用Monzol TM試劑提取總RNA,通過分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度。按試劑盒說明書,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR的操作。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CACNA1E、CALM、BDNF mRNA的相對表達(dá)水平(內(nèi)參為GADPH)。引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.3.5 蛋白免疫印跡

麻醉大鼠后將其斷頭處死,從腦部取出完整的海馬組織,使用RIPA裂解液在冰上進(jìn)行取樣和勻漿后,離心分離上清液,用BCA法測定蛋白濃度。取各組樣本上樣,用濃度為10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉處理2 h,TBST洗膜后,于4 ℃進(jìn)行一抗孵育過夜。第二天進(jìn)行TBST洗膜,經(jīng)過1 h 的二抗孵育和PBST洗膜處理后,使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,拍照后采用Image J軟件進(jìn)行相關(guān)蛋白條帶的分析和計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢性鋁中毒影響大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)期間,隨著實(shí)驗(yàn)的重復(fù)各組的逃避潛伏期均逐漸縮短,中、高劑量組大鼠的逃避潛伏期明顯長于同期對照組(P<0.05或P<0.01),低劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,低劑量組無明顯變化,中、高劑量染鋁組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短,穿越平臺次數(shù)顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表2 各組定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

表3 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 慢性鋁中毒引起大鼠海馬區(qū)病理變化

HE染色結(jié)果顯示,對照組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的細(xì)胞排列有序,邊界清晰可見;隨著鋁劑量的增加,低、中、高劑量組海馬CA1和CA3區(qū)逐漸出現(xiàn)細(xì)胞邊界明顯模糊,細(xì)胞體積顯著減小,胞漿呈現(xiàn)出深紅色,核固縮,最終細(xì)胞變形,排列紊亂。見圖1—2。

A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。圖1 4組海馬CA1區(qū)HE染色(比例尺:10 μm)

尼氏染色結(jié)果顯示,對照組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞分布整齊,神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完好,且胞質(zhì)內(nèi)的尼氏體數(shù)量豐富,顏色呈現(xiàn)出藍(lán)紫色。隨著鋁劑量的增加,低、中、高劑量組海馬CA1和CA3區(qū)逐漸出現(xiàn)細(xì)胞排列疏松,染色變淺,細(xì)胞核縮小,胞質(zhì)中的尼氏體大幅減少,乃至完全消失。上述現(xiàn)象表明慢性鋁中毒大鼠海馬CA1和CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞蛋白的合成活性下降。見圖3—4。

A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。圖3 4組海馬CA1區(qū)尼氏染色(比例尺:10 μm)

A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。圖4 4組海馬CA3區(qū)尼氏染色(比例尺:10 μm)

2.3 慢性鋁中毒降低大鼠海馬中CACNA1E、CALM、BDNF表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,中、高劑量組CACNA1E、CALM、BDNF mRNA相對表達(dá)水平較對照組明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01),而低劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

*P<0.05,**P<0.01與對照組比較。圖5 各組CACNA1E、CALM、BDNF mRNA的相對表達(dá)水平

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,中、高劑量組CACNA1E、CALM、BDNF蛋白表達(dá)水平相較于對照組明顯降低(P<0.05或P<0.01),而低劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6、表4。

圖6 各組海馬CACNA1E、CALM、BDNF蛋白免疫印跡

表4 各組海馬CACNA1E、CALM、BDNF蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

最新研究[9]發(fā)現(xiàn),鋁可能對人體造成嚴(yán)重危害,引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如老年癡呆癥。鋁元素被證實(shí)能夠穿越血腦屏障進(jìn)入大腦,對神經(jīng)系統(tǒng)造成極其嚴(yán)重的損害,影響學(xué)習(xí)能力和記憶力。還有研究[10]表明,當(dāng)大鼠腹腔注射鋁鹽溶液后,其大腦頂葉、小腦以及海馬神經(jīng)元的數(shù)量減少,其空間認(rèn)知能力降低。深入研究鋁導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙及作用機(jī)制具有重要的理論和實(shí)際意義[11-12]。通過水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、HE染色和尼氏染色,本研究證明了中、高劑量組存在不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙,其海馬區(qū)神經(jīng)元受到不同程度的損傷,證明了鋁致大鼠認(rèn)知障礙模型建立成功。

本研究選擇神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)關(guān)鍵的R型鈣通道亞基α1E(CACNA1E)及其信號傳導(dǎo)中的下游蛋白(CALM和BDNF)作為目的基因,進(jìn)行蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。與對照組相比,中、高劑量組大腦海馬組織中CACNA1E的蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低,同時(shí)伴隨CALM、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)下調(diào)。說明慢性率中毒可導(dǎo)致海馬中CACNA1E、CALM和BDNF的表達(dá)受阻。

中、高劑量組在水迷宮定位航行試驗(yàn)中逃避潛伏期增加,而在空間探索試驗(yàn)中,其在目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短,穿越平臺次數(shù)顯著減少,提示其海馬受損,學(xué)習(xí)和記憶功能下降。組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),低、中、高劑量組海馬神經(jīng)元受到不同程度的損傷,細(xì)胞變形,排列紊亂,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)尼氏體減少,染色變淺。綜上所述,本研究認(rèn)為鋁致大鼠認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與CACNA1E及其下游蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān),但具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。