程兆瑞,駱圣華,伍德強(qiáng),彭考明,舒源森,陳茄威,周 磊,王 彤

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院急診科,廣東 深圳 518033)

原發(fā)性肝癌(PLC)是一組高度異質(zhì)性腫瘤,其中最常見(jiàn)的類型為肝細(xì)胞癌(HCC)。作為全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,大多數(shù)HCC在慢性肝病的背景下發(fā)展,特別是乙型/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和肝硬化[1]。早期至中期HCC的治療方式包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融和化療栓塞等。然而,超過(guò)80%的HCC患者被診斷時(shí)已錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)[2]。迄今為止,晚期HCC的治療是有限的?？诜野彼峒っ敢种苿┧骼悄峄驑?lè)伐替尼作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的一線治療用藥,僅僅提供3個(gè)月的生存獲益期[3-5]。PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑僅僅使一小部分患者(約20%)顯示出應(yīng)答[6-7],同時(shí),目前尚缺乏有效預(yù)測(cè)免疫療法療效的生物標(biāo)志物[8]。因此,HCC治療仍面臨巨大困境,對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探索以尋找潛在的治療靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)新興治療模式迫在眉睫。由于缺乏用于腫瘤研究的合適模型,開(kāi)發(fā)新的HCC治療策略受到阻礙。在過(guò)去的十年中,類器官作為強(qiáng)大的研究工具,在細(xì)胞分子層面協(xié)助探討疾病機(jī)制,從而指導(dǎo)臨床個(gè)體化醫(yī)療,在臨床前和轉(zhuǎn)化領(lǐng)域都引起了科學(xué)家們極大的興趣[9]。本文首先將類器官與現(xiàn)有的傳統(tǒng)腫瘤模型進(jìn)行比較,繼而探討了類器官的起源、特性及其在肝癌中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 現(xiàn)有HCC腫瘤模型的局限性

1.1 體外細(xì)胞模型

作為傳統(tǒng)的腫瘤模型之一,2D細(xì)胞培養(yǎng)物以易于處理且快速生長(zhǎng)的特性廣泛應(yīng)用于腫瘤研究。然而,該培養(yǎng)物缺乏調(diào)節(jié)細(xì)胞行為,包括分化、存活、增殖和迀移的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞,因此無(wú)法基于細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)間相互作用進(jìn)行建模[10-11]。此外,在肝臟微環(huán)境中,不同位置的細(xì)胞接受不同水平的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),缺氧和葡萄糖剝奪是HCC細(xì)胞惡性增殖的已知驅(qū)動(dòng)因素[12-13]。而細(xì)胞培養(yǎng)物常常黏附于塑料培養(yǎng)基表面,形成單層細(xì)胞,直接均勻暴露于培養(yǎng)基內(nèi)因子,因此從而無(wú)法復(fù)制肝臟內(nèi)實(shí)際微環(huán)境。同時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)基盡管能夠提供細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必需的基本底物,但生長(zhǎng)因子等要素缺乏將不可避免地導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)相關(guān)途徑的喪失,甚至可能偏離真正的腫瘤生物學(xué)過(guò)程[14-16]。

1.2 體內(nèi)小鼠模型

目前已有多種方法用于建立腫瘤小鼠模型?；瘜W(xué)致癌物二乙基亞硝胺(DEN)和四氯化碳(CCl4)可經(jīng)經(jīng)典炎癥-纖維化-HCC軸誘導(dǎo)HCC小鼠,但其誘導(dǎo)的突變通常是未知的,使得后續(xù)模型構(gòu)建進(jìn)一步復(fù)雜化[17-18]。為了更好地研究人類特異性腫瘤微環(huán)境和免疫治療,已經(jīng)開(kāi)發(fā)了人源化小鼠模型,即異種移植模型的變體。具體來(lái)說(shuō),人造血干細(xì)胞(HSC)可移植到免疫缺陷小鼠中,HSC重新填充骨髓并給予功能性人免疫系統(tǒng),后續(xù)將患者來(lái)源的HCC細(xì)胞異種移植,從而提供體內(nèi)平臺(tái)以評(píng)估藥物功效并研究腫瘤與免疫系統(tǒng)之間的特異性相互作用[19]。人源化小鼠中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺乏使得其重現(xiàn)復(fù)雜的抗腫瘤免疫過(guò)程與真實(shí)人體存在一定差異[20]。

2 HCC類器官的定義與起源

肝、胰和膽管類器官(HPB類器官)聯(lián)盟由全球60多位專家組成,共同將類器官定義為源自原代細(xì)胞、干細(xì)胞/祖細(xì)胞或多能干細(xì)胞(PSC),通過(guò)復(fù)現(xiàn)組織內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用以維持組織結(jié)構(gòu)和功能的三維結(jié)構(gòu)[21]。此外,衍生自HCC組織的類器官被指定為術(shù)語(yǔ)“肝細(xì)胞癌類器官(HCCO)”[22-23]。

制作HCCO的基本步驟如下:1)用消化溶液(通常是膠原酶和DNA酶的共混物)解離成單細(xì)胞。2)將單細(xì)胞接種到基質(zhì)膠(從鼠肉瘤分離的ECM)上。3)向培養(yǎng)基補(bǔ)充有模擬干細(xì)胞小生境信號(hào)傳導(dǎo)所需的小分子及生物制劑混合物,如Y27632,即Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)信號(hào)通路的抑制劑,用于防止細(xì)胞與周圍ECM失錨定時(shí)的程序性細(xì)胞死亡;Wnt 3a和R-spondin,即Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路激活劑,用于維持細(xì)胞干性,誘導(dǎo)惡性增殖[24-26]。BROUTIER等[22]是第一個(gè)成功地從人PLC開(kāi)發(fā)類器官的團(tuán)隊(duì)。相比于匹配的健康肝臟組織,HCCOs形成緊湊的氣泡樣生長(zhǎng)結(jié)構(gòu):圍繞中心腔的導(dǎo)管樣單層上皮細(xì)胞。即使在長(zhǎng)期培養(yǎng)后,類器官也保留了與腫瘤組織相似的組織病理學(xué)和遺傳特征。隨后,NUCIFORO等[23]證明了可通過(guò)腫瘤針吸活檢技術(shù),對(duì)不適合或喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的極早期或晚期HCC患者進(jìn)行HCCO的構(gòu)建,這極大程度地?cái)U(kuò)展了類器官在HCC中的應(yīng)用前景,是一項(xiàng)變革性的發(fā)現(xiàn)[23]。另一種制作HCCO的方法是在健康肝臟類器官中誘導(dǎo)HCC形成。SUN等[27]通過(guò)過(guò)表達(dá)c-Myc從重編程的人肝細(xì)胞類器官中成功誘導(dǎo)了HCC。

3 HCCOs的特性

3.1 保留親本組織特征

HCCOs高度保留了親本的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜和基因組景觀[28]。其中,各種HCC免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)水平均與親本高度一致,包括甲胎蛋白(AFP)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、谷氨酰胺合成酶和熱激蛋白70(HSP70)[23]。此外,腫瘤突變、擴(kuò)增、拷貝數(shù)變異和突變標(biāo)記在很大程度上反映了親本HCC數(shù)據(jù)[23]。BROUTIER等[22-23]使用全外顯子組測(cè)序,分別觀察到,人HCCO在4個(gè)月或8次傳代后保留了親本組織中超過(guò)80%的免疫學(xué)突變。表觀遺傳變化在癌癥中的作用也正被廣泛研究。JOSHI等[29]觀察到5種癌癥類型(結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、食管癌、胃癌和肺癌)的類器官保留了相應(yīng)原發(fā)腫瘤的DNA甲基化譜,可惜的是,HCC未被包含其中?？偟膩?lái)說(shuō),作為體外模型,類器官在其起源腫瘤的重演程度方面已顯著優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞系,然而其仍缺乏某些參數(shù)如血管形成、神經(jīng)支配和免疫細(xì)胞相互作用等。

3.2 保留腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

腫瘤微環(huán)境(TME)內(nèi)腫瘤發(fā)生與進(jìn)化涉及到克隆擴(kuò)展、遺傳多樣化和克隆選擇的反復(fù)過(guò)程[30]。在單個(gè)腫瘤內(nèi),存在具有不同突變譜的不同細(xì)胞群,這種現(xiàn)象稱為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。探索瘤內(nèi)異質(zhì)性在研究腫瘤耐藥機(jī)制方面至關(guān)重要:早期,腫瘤治療消除了易感的腫瘤克隆增殖,出現(xiàn)腫瘤緩解;然而,剩余的腫瘤亞群會(huì)通過(guò)基因突變等手段,改變其表型,從而逃避攻擊,形成耐藥。CALANDRINI等[31]研究分析了類器官內(nèi)發(fā)生體細(xì)胞突變的癌細(xì)胞分?jǐn)?shù)(CCF)(即具有給定基因突變的癌細(xì)胞比例),表明類器官培養(yǎng)物捕獲了起源腫瘤內(nèi)亞克隆特點(diǎn),顯著保留了瘤內(nèi)異質(zhì)性。此外,轉(zhuǎn)錄組分析顯示,同一培養(yǎng)物中單個(gè)結(jié)直腸癌類器官中存在基因表達(dá)水平的細(xì)微差異,這種多克隆性對(duì)于科學(xué)家真正理解腫瘤演變、免疫逃避和耐藥性等過(guò)程至關(guān)重要。

4 類器官的應(yīng)用

4.1 研究HBV復(fù)制和HBV相關(guān)致癌作用

HBV感染是HCC發(fā)生發(fā)展的最主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一,目前,HBV的研究模式可分為3種:細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和類器官模型。一般來(lái)說(shuō),細(xì)胞模型不適用于HBV相關(guān)致癌研究,盡管它們?nèi)菀拙S持HBV復(fù)制狀態(tài)且成本低廉。動(dòng)物模型,特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物,支持形成HBV感染和免疫應(yīng)答狀態(tài),但價(jià)格昂貴且難以維持。與上述2種模型相比,類器官模型具有易于進(jìn)行遺傳修飾、維持周期長(zhǎng)、成本適中的優(yōu)勢(shì)[32]。

到目前為止,研究人員已經(jīng)建立了2個(gè)肝臟類器官模型,用于描述HBV體外感染和復(fù)制的潛力,分別為NIE等[33]構(gòu)建的多能干細(xì)胞衍生模型及DE CRIGNIS等[34]構(gòu)建的成體干細(xì)胞衍生模型。NIE等[33]提取人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并建立了功能性肝類器官模型。在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中,將hiPSC衍生的內(nèi)胚層、間充質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞與某種培養(yǎng)基共培養(yǎng)?；诩?xì)胞-細(xì)胞相互作用,當(dāng)上述細(xì)胞分化時(shí),出現(xiàn)自組織并產(chǎn)生功能性類器官。該功能性hiPSC-HCCO可支持完整的HBV生命周期并模擬HBV相關(guān)的肝功能障礙,真正重現(xiàn)宿主-病毒的相互作用。同樣的,DE CRIGNIS等[34]也證明了由健康供體產(chǎn)生的肝類器官模型可以支持HBV在體外復(fù)制。當(dāng)使用重組病毒和HBV感染的患者血清感染類器官時(shí),研究人員在類器官培養(yǎng)的上清液中可以檢測(cè)到HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)、HBV核心蛋白,甚至共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA),表明該類器官模型可以在擴(kuò)增培養(yǎng)基中高效地生產(chǎn)HBV。有趣的是DE CRIGNIS等[34]從肝移植患者的非腫瘤肝硬化組織中生成了HBV感染患者來(lái)源的肝類器官。對(duì)患者來(lái)源的肝類器官的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,存在一個(gè)異常的早期癌癥基因標(biāo)記。該標(biāo)記與癌癥基因組圖譜(TCGA)內(nèi)的HCC隊(duì)列聚集在一起,同時(shí)遠(yuǎn)離健康的肝組織,提示著該基因標(biāo)記可能是HBV介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新型生物標(biāo)志物。由于類器官可以進(jìn)行基因修飾,因此可以通過(guò)在肝細(xì)胞中外源表達(dá)HBx蛋白或其他候選病毒/宿主蛋白來(lái)研究原代肝細(xì)胞系統(tǒng)中的下游靶基因和致癌機(jī)制。

4.2 研究其他因素相關(guān)致癌作用

目前,對(duì)HCC相關(guān)致癌因素仍了解甚少,對(duì)肝臟類器官的廣泛探索,有助于加深對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)。NARUSE等[35]基于小鼠組織來(lái)源的類器官,通過(guò)體外二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo),建立了肝癌類器官模型。該模型顯示出致癌的組織病理學(xué)特征,可用于研究早期分子事件,以闡明化學(xué)因素驅(qū)動(dòng)的致癌作用。此外,SUN等[27]通過(guò)使人肝細(xì)胞重編程及p53和RB基因失活,建立了具有肝臟結(jié)構(gòu)和功能的類器官。結(jié)果顯示,c-Myc誘導(dǎo)的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度偶聯(lián)可能是肝癌發(fā)展中未被識(shí)別的致癌事件,肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展可能與c-Myc過(guò)度表達(dá)密切相關(guān),提示著c-Myc抑制劑有待被探索用于HCC治療領(lǐng)域。總之,以hiHep類器官為代表的類器官作為通過(guò)基因操控來(lái)模擬癌癥發(fā)生發(fā)展的有力工具,有助于科學(xué)家們更好地了解癌癥的起源,從而提供潛在的預(yù)防治療方案并提高腫瘤患者的生存率。

4.3 藥物篩選和個(gè)體化醫(yī)療

PLC作為一種高度異質(zhì)性疾病,其個(gè)體化治療對(duì)于提高生存率、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療至關(guān)重要。如上所述,來(lái)源于人PLC的腫瘤類器官充分保留了其來(lái)源組織的異質(zhì)性,這表明類器官有望成為探索腫瘤耐藥性和個(gè)體化醫(yī)療的有力工具。此外,肝癌類器官模型用于藥物敏感性檢測(cè)的最突出的優(yōu)點(diǎn)之一在于其良好的重現(xiàn)性和逼真性。既往研究[22]也表明,肝臟類器官可以成功地模擬體內(nèi)肝臟的功能,并長(zhǎng)期增殖。與其他模型相比,類器官模型可以再現(xiàn)疾病特征,如突變特征、病理變化和治療反應(yīng),并且可以更真實(shí)地預(yù)測(cè)出藥物治療反應(yīng)[23]。

HCC類器官作為良好的體外模型已逐漸取代2D模型,用于對(duì)分子靶向藥物(如索拉非尼)的敏感性測(cè)試。SONG等[36]使用類器官模型來(lái)測(cè)試索拉非尼的敏感性,發(fā)現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)并不會(huì)阻礙藥物擴(kuò)散而導(dǎo)致其預(yù)測(cè)療效的靈敏度降低。與2D模型相比,類器官3D結(jié)構(gòu)能夠更精確地進(jìn)行治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)。這一有趣的發(fā)現(xiàn)從側(cè)面證實(shí)了3D結(jié)構(gòu)特征不是影響藥物在組織結(jié)構(gòu)中的運(yùn)輸和擴(kuò)散的唯一因素。LI等[28]用5個(gè)手術(shù)標(biāo)本中的不同切片構(gòu)建了27種PLC(HCC和CAA)類器官,用來(lái)評(píng)估129種抗癌藥物對(duì)其的活性。大多數(shù)藥物僅在特定的類器官系中有效,這不僅證明了PLC內(nèi)高度的遺傳異質(zhì)性,而且證明了瘤內(nèi)藥物反應(yīng)的異質(zhì)性。為解決PLC耐藥性問(wèn)題,LAMPIS等[37]利用PLC來(lái)源的類器官,分別評(píng)估了其在體外培養(yǎng)基和小鼠體內(nèi)作為皮下異種移植物時(shí)對(duì)HSP 90抑制劑的反應(yīng)。結(jié)果顯示,無(wú)論是體內(nèi)或是體外培養(yǎng),患者源性類器官對(duì)HSP90抑制劑的敏感性取決于miRNA21的表達(dá),證明miRNA21似乎介導(dǎo)PLC細(xì)胞對(duì)HSP90抑制劑的耐藥性。類似地,一些研究基于PLC類器官模型,也發(fā)現(xiàn)了腫瘤耐藥相關(guān)靶點(diǎn)。如Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)和受體酪氨酸激酶誘導(dǎo)的MEK/ERK和AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的再激活可能與索拉非尼耐藥性相關(guān)[38-39]

5 小結(jié)與展望

本文綜述了肝臟類器官的定義、起源及特性,并重點(diǎn)介紹了類器官在HBV及其他致癌因素相關(guān)肝癌研究及在藥物篩選、尋找耐藥相關(guān)靶點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療中的應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)有望充分探索PLC類器官與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞,如免疫細(xì)胞和血管細(xì)胞,從而利用PLC類器官對(duì)HBV感染下抗腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行更多的研究。此外,SKARDAL等[40]用結(jié)腸癌細(xì)胞接種肝類器官以產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移瘤類器官,這種3D肝腫瘤類器官被證明是比2D細(xì)胞培養(yǎng)物更好的轉(zhuǎn)移性腫瘤模型。即使不能完全模擬肝轉(zhuǎn)移瘤的實(shí)際情況,但仍值得進(jìn)一步研究。