高璐陽(yáng) 金旗,2 張毅,3 李欣 黃志華 章思鋮 段安琪 趙智慧 趙青 羅勤

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院 呼吸與肺血管病診治中心,北京 100037;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 上海市心血管病研究所心內(nèi)科,上海 200032;3.電子科技大學(xué)附屬四川省人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)科,四川 成都 610072)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種常見的血流動(dòng)力學(xué)異常狀態(tài)、嚴(yán)重的心血管疾病,可累及全身多個(gè)系統(tǒng)。其特征為肺動(dòng)脈壓異常升高、肺血管阻力不斷增加,導(dǎo)致肺血管重構(gòu),并損害右心泵血能力,最終可能導(dǎo)致右心衰竭和死亡[1]。由于現(xiàn)有的靶向藥物主要作用于舒張血管通路,因此,有必要探索發(fā)病機(jī)制,以發(fā)現(xiàn)直接針對(duì)肺動(dòng)脈重構(gòu)的治療目標(biāo)[2]。有研究[3]證實(shí),阻止肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)凋亡在肺動(dòng)脈重構(gòu)中起重要作用。有研究[4]顯示,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、侵襲和遷移等多個(gè)病理生理過程中起重要作用,并與血管重構(gòu)密切相關(guān)。在該信號(hào)通路中,叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)是Akt的下游目標(biāo)蛋白。研究[5]表明,FoxO1在肺血管中的表達(dá)水平降低可能引發(fā)肺血管重構(gòu)。因此,筆者提出了“PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1抑制PASMC凋亡”的科學(xué)假設(shè)。筆者計(jì)劃從細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)行研究,以探究PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路在PH發(fā)病機(jī)制中的作用,并希望找到新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人源肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary artery smooth muscle cell, hPASMC)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù),貨號(hào)PCS-100-023。使用的試劑包括胰酶-乙二胺四乙酸、磷酸鹽緩沖液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和抗小鼠抗體、二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司),胎牛血清(GIBCO公司,美國(guó)),平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(Sciencell公司,美國(guó)),野百合堿(monocrotaline, MCT)(Sigma公司,美國(guó)),Bcl-2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體、Akt抗體、磷酸化Akt抗體、PI3K抗體(Proteintech公司,美國(guó)),裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗體(CST公司,美國(guó)),磷酸化FoxO1抗體、FoxO1抗體(Abcam公司,英國(guó)),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(DoJinDo,日本),Transwell嵌套(帶聚碳酸酯膜,尺寸為6.5 mm,孔徑為8.0 μm)(Costar 3422),結(jié)晶紫染液(武漢谷歌生物),一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取無(wú)特定病原體級(jí)成年雄性SD大鼠(8～10周齡),購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司。倫理批件號(hào)為Fw-2021-0026。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

hPASMC在平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng),在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37 ℃和飽和濕度條件下松蓋培養(yǎng)。每隔1～2 d更換培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%鋪滿時(shí)再進(jìn)行消化和傳代。

1.3.2 細(xì)胞分組與處理

將hPASMC分為4組:空白對(duì)照組、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)組、PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)組?？瞻讓?duì)照組不接受任何額外處理;PDGF-BB組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理;PDGF-BB+LY294002組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理,并用濃度梯度為10、20、30 μg/mol的LY294002(PI3K抑制劑)處理24 h;PDGF-BB+paclitaxel組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理,并用10 μg/mol的paclitaxel(FoxO1激動(dòng)劑)處理24 h。

1.3.3 動(dòng)物分組與處理

將12只SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、MCT組、MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組。空白對(duì)照組僅在大鼠頸背部皮下注射生理鹽水,其余3組大鼠均在頸背部皮下注射60 mg/kg的MCT,MCT+LY294002組額外接受25 mg的LY294002處理,MCT+paclitaxel組在注射MCT后的第1、7、14和21天額外接受6 mg/kg的paclitaxel處理。

1.3.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將空氣干燥的hPASMC樣本使用4%多聚甲醛室溫固定20～30 min,并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),最后使用倒置顯微鏡拍照觀察,計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和cleaved caspase-3表達(dá)水平

消化離心收集各組細(xì)胞沉淀并裂解,以4 ℃和12 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞;使用二喹啉甲酸法對(duì)蛋白進(jìn)行濃度定量。每孔上樣100 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,使用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,根據(jù)蛋白分子量剪下適當(dāng)?shù)哪?分別與相應(yīng)的一抗在4 ℃孵育過夜。帶有吐溫20的三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜15 min,重復(fù)3～4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1：1 000),37 ℃孵育2 h,再次洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光試劑,在聚偏氟乙烯膜上滴加工作液,待熒光帶明顯后,放入天能全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光并拍照。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肺組織Bcl-2、cleaved caspase-3、PI3K、磷酸化Akt、FoxO1及磷酸化FoxO1表達(dá)水平

從-80 ℃冰箱中取出大鼠肺組織,剪取部分組織轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中剪碎。每管加入250 μL裂解液,在冰上裂解45 min。其余步驟同1.3.5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)hPASMC凋亡的影響

如圖1所示,采用TUNEL法檢測(cè)各組hPASMC的凋亡情況,以探究PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)hPASMC凋亡的影響。結(jié)果顯示,相比于空白對(duì)照組,PDGF-BB+LY294002組及PDGF-BB+paclitaxel組凋亡率均顯著增加(P<0.01)。

注:control,空白對(duì)照組;DAPI,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚;**表示P<0.01。圖1 TUNEL法測(cè)定hPASMC的凋亡水平

2.2 各組hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示,PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組hPASMC的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著低于PDGF-BB組(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel組Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于PDGF-BB+LY294002組(P<0.01)。相反,相比于PDGF-BB組,PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組hPASMC的cleaved caspase-3表達(dá)水平更高(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel組cleaved caspase-3表達(dá)水平低于PDGF-BB+LY294002組(P<0.01)。

注:control,空白對(duì)照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;**表示 P<0.01。圖2 各組hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.3 各組大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著低于MCT組(P<0.01),且MCT+paclitaxel組Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于MCT+LY294002組(P<0.05)。相反,相比于MCT組,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組的cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平更高(P<0.01),且MCT+paclitaxel組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平低于MCT+LY294002組(P<0.01)。

注: control,空白對(duì)照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;**表示P<0.01,*表示P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.4 各組大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肺組織PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖4所示,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的FoxO1表達(dá)水平均顯著高于MCT組(P<0.01),磷酸化FoxO1表達(dá)水平均低于MCT組(P<0.01)。MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的磷酸化Akt與Akt表達(dá)水平比值均顯著低于MCT組(P<0.01)。此外,各組之間PI3K表達(dá)水平無(wú)顯著差異。

注: control,空白對(duì)照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;p-Akt,磷酸化Akt;p-FoxO1,磷酸化FoxO1。**表示P<0.01,*表示P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

研究數(shù)據(jù)提示PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路可能在PASMC異常凋亡中發(fā)揮作用,研究結(jié)果表明PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組的hPASMC抗凋亡能力下降。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,在PI3K抑制劑作用后,FoxO1的總量增加,磷酸化FoxO1表達(dá)水平降低;在FoxO1激動(dòng)劑作用后,FoxO1表達(dá)水平升高,但磷酸化FoxO1表達(dá)水平無(wú)明顯變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似效應(yīng)。本研究的創(chuàng)新之處在于從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面首次探究了PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路在肺血管重構(gòu)過程中的作用及其對(duì)凋亡表型的影響。

PH病因復(fù)雜多樣,病情進(jìn)展迅速,常導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降并增加短期死亡風(fēng)險(xiǎn)[6]。隨著對(duì)PH發(fā)病機(jī)制的探究,PASMC異常生物學(xué)行為導(dǎo)致的肺動(dòng)脈重構(gòu)被認(rèn)為是該疾病發(fā)生與發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。既往研究指出了細(xì)胞凋亡異常在肺動(dòng)脈重構(gòu)中的重要作用。有研究[7]顯示,在PH患者的PASMC中,沉默核異質(zhì)核糖核蛋白A2B1基因會(huì)導(dǎo)致攜帶A2B1基序的信使RNA減少,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和抗凋亡能力下降。同樣,Schuoler等[8]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的PH小鼠肺組織中水通道蛋白1 的上調(diào)進(jìn)一步增加了hPASMC的凋亡,這種作用與腫瘤抑制基因p53的高表達(dá)有關(guān)。肺血管重構(gòu)一旦發(fā)生,幾乎是不可逆的,是PH治療中的關(guān)鍵和難點(diǎn)[9]。因此,深入了解肺血管重構(gòu)機(jī)制對(duì)于治療PH具有至關(guān)重要的意義。

PI3K/Akt通路廣泛存在于細(xì)胞中,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和免疫炎癥等眾多病理生理過程[10]。先前的研究已證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路與PH密切相關(guān)。在MCT大鼠模型中發(fā)現(xiàn),通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來減輕肺血管重構(gòu)可能是由于泛素蛋白酶體功能抑制引起的[11]。黃芩苷可通過增加腺苷A2A受體的活性來抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,從而緩解低氧誘導(dǎo)的PH[12]。饑餓激素可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抵抗低氧誘導(dǎo)的hPASMC凋亡,并參與PH的發(fā)生[13]。Li等[14]通過在paclitaxel(FoxO1激動(dòng)劑)晶體納米粒子上加載活性蛋白,并使用一層葡糖醛酸包被,成功制備出一種可靶向PASMC的復(fù)合制劑——葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1。這種復(fù)合制劑通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈重構(gòu),并改善大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn),Maresin 1通過LGR6(糖蛋白激素受體家族成員之一)來抑制Akt和FoxO1磷酸化,從而阻止PASMC增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。此外,有研究[16]證明在自體血栓造模下形成的慢性血栓栓塞性PH大鼠模型中,FoxO1和細(xì)胞凋亡對(duì)其發(fā)病機(jī)制起重要作用。由于PH患者終末期可能發(fā)展為右心衰竭甚至全心衰竭,可推測(cè)靶向PI3K/Akt/FoxO1通路可能有助于改善PH患者的預(yù)后。

綜上所述,本研究認(rèn)為PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1影響PASMC的凋亡,從而參與PH的發(fā)生與發(fā)展。未來可探索PI3K/Akt信號(hào)通路影響的更多表型與PH發(fā)病的關(guān)系,以深入挖掘PH的發(fā)病機(jī)制,尋找潛在的治療靶點(diǎn)。